Vi beskriver en metode for å spore endomembransystemet brudd oppstår ved de intracellulære bakterier<em> Shigella flexneri<em></em</em> Og<em<em><em> Mycobacterium tuberculosis</em></em</em> På vertscellen invasjon. Vår analyse gjør bruk av CCF4, en rekke cytoplasma FRET sonde i levende eller faste celler. Dette reporter er degradert av en enzymaktivitet til stede på den bakterielle overflate.
Shigella flexneri er sykdomsfremkallende bakterier som invaderer vertsceller inngår en endocytic vakuole. Deretter gjør at brudd på denne membranen lukkede kupé bakterier å flytte i cytosol, sprer og videre invadere nabolandet celler. Mycobacterium tuberculosis er phagocytosed av immunceller, og har nylig vist seg å sprekke phagosomal membran i makrofager. Vi utviklet en robust analyse for sporing phagosomal membran avbrudd etter vertscellen oppføring av Shigella flexneri eller Mycobacterium tuberculosis. Fremgangsmåten gjør bruk av CCF4, et FRET reporter følsom for β-laktamase som equilibrates i cytosol av vertsceller. Ved invasjon av vertsceller ved bakterielle patogener, forblir sonden intakt så lenge bakteriene ligge i membran-lukkede rom. Etter avbrudd av vakuole, β laktamase-aktivitet på overflaten av det intracellulære patogene spalter CCF4 øyeblikkelig føreing til tap av FRET signal og bytte sin emisjonsspekteret. Denne robuste proporsjonal analysen gir nøyaktig informasjon om tidspunktet for vacuolar brudd forårsaket av invaderende bakterier, og det kan kobles til automatisert mikroskopi og bildebehandling av spesielle algoritmer for deteksjon av utslipp signalene fra FRET donor og akseptor. Videre tillater det undersøkte dynamikken i vacuolar forstyrrelser fremkalt ved intracellulære bakterier i sanntid i enkeltceller. Til slutt, er det perfekt egnet for high-throughput analyser med en spatio-temporal oppløsning enn tidligere metoder. Her gir vi de eksperimentelle detaljer om eksemplarisk protokoller for CCF4 vacuolar brudd analysen på Jakten celler og THP-1 makrofager for time-lapse eksperimenter eller endepunkt eksperimenter med Shigella flexneri samt flere mykobakterielle stammer som Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, og Mycobacterium tuberculosis.
Mange bakterielle patogener er internalisert i membran-lukkede avdelinger av eukaryote celler under løpet av infeksjonen. Celleinnskrift skjer enten gjennom fagocytose av spesialiserte vertsceller, slik tilfellet er for Mycobacterium tuberculosis som er inntatt av makrofager, eller patogener aktivt indusere deres opptak i typisk ikke-fagocytiske celler. I tilfelle av indusert opptak, for eksempel for Shigella flexneri, injiserer patogenet effektor proteiner i verten cytosol at overta blant annet cellefunksjoner den strengt regulert endomembransystemet sortering maskiner resulterer i bakteriell lokalisering innenfor et endosomale kammer 1,2. Deretter Shigella forstyrrer den omsluttende membranen fører til vacuolar brudd og cytosolic tilgang av organismen forstyrrer host membran trafficking og unngå levering til lysosomer. Mer nylig har phagolysosomal ruptur også blitt funnet som infeksjon strategy brukt av Mycobacterium tuberculosis, en patogen som var tenkt for en lang tid for å bli utelukkende lokalisert i en membran-bundet kammer 3,17.
For å undersøke dynamikken i subcellular membran smugling av invasive patogener, har store forbedringer er oppnådd siden transmisjonselektronmikroskopi (TEM) basert studier av slutten av 1980 4,5. For eksempel fluorescens mikroskopi baserte metoder ved hjelp av fargestoffer, tok antistoffer mot bakterielle overflaten komponenter, eller markører for samlokalisering med subcellular avdelinger enn 6,7. Men de fortsatt ikke gir presis tid og rom oppløsning og robusthet til å måle vacuolar ruptur av bakterielle patogener kvantitativt.
Dette hinderet er løst med en analyse basert på cephalosporin avledet CCF4-AM FRET reporter som først ble brukt til å studere genuttrykk åtte. Deretter ble det brukt i sammenheng med infection biologi for å undersøke effector sekresjon, og for å følge opptaket av Neisseria inn vertscellene 9,10,11. Vi utviklet en analyse dra nytte av denne reporter for å studere vacuolar brudd forårsaket av Shigella flexneri 12 og Mycobacterium tuberculosis 17. Prinsippet for foreliggende fremgangsmåte er beskrevet i figur 1 under anvendelse av Shigella flexneri. Først blir vertceller lastet med FRET CCF4-AM substrat som er fanget inne i cytoplasma etter spalte utenfor AM ester moieties. Deretter blir celler infisert med Shigella flexneri. β-laktamase tilstede på overflaten av bakteriene er i stand til å spalte den CCF4 substratet så snart som vacuolar ryker. Dette fører til et tap av FRET signalsvitsjepunktet den emisjonstopp fra 535 nm til 450 nm etter eksitasjon av sonden ved 405 nm. Den proporsjonal måling av de 450/535 nm intensiteter fremhever vacuolar integritet: lave forholdstall reflektere membran-enlukkede eller ekstracellulære bakterier mens høye prosenter gjenspeile kontakt mellom bakterier og verten cytosol. Vi rapporterer også en tilpasning av denne metoden for å studere phagosomal brudd forårsaket av Mycobacterium tuberculosis i THP-1 makrofager. De eksperimentelle prinsippene er de samme selv om sekvensen reverseres, CCF4-AM lasting påføres først etter bakteriell infeksjon.
Således, ved kvantitative Ratiometrisk fluorescens målinger på celle-nivå, kan det vacuolar ruptur av Shigella flexneri spores i sanntid og i faste prøver fra ulike celletyper 12,13,14. Videre kan denne fremgangsmåte tilpasses til en rekke andre invaderende patogener som vist i denne studien ved hjelp av Mycobacterium bovis og Mycobacterium tuberculosis. Endelig tillater miniatyrisering av vår protokollen til 96 brønn (eller 384 brønner) formater screening av en rekke betingelser med høy gjennomstrømning.
Den CCF4-AM/β-lactamase analysen er en grei metode for å spore vacuolar avbrudd forårsaket av intracellulære Shigella flexneri og mykobakterier i ulike celletyper. Den gjør bruk av en følsom laktamase cytoplasmisk FRET reporter som blir spaltet av et enzym som er aktivt på overflaten av bakteriene.
Tap av den CCF4-AM substrat kan lett unngås ved å tilsette probenecid for alle løsningene etter lasting av substratet. Som vist, kan analysen tilpasses flere celletyper (epitelceller, fagocyttiske celler) og formater (96 brønner, 35 mm glassbunn retter, 6/12/24 brønnplater). For bruk av den 6/12/24 brønn plate, blir sterile dekkglass fordelt på bunnen av hver brønn før såing av cellene. På slutten av forsøket, er Dekkglass overført på lysbilder i montering medium, for eksempel forlenge Gold Antifade Reagens (Invitrogen). På denne måten signalet er stabil i lengre tidsperioder etter at analysensammenlignet med 96 brønner format hvor prøvene er bevart i PBS etter fiksering. Den høye kostnaden for CCF4-AM underlaget bør tas i betraktning før fastsettelse av prøvevolum. Dette er grunnen til at vi anbefaler å skalere dem ned. Eksperimenter er dyrere i 6/12/24 godt format, men signalene er stabile i flere dager. Tvert imot, eksperimenter er billigere i 96 brønn format, men prøvene må analyseres på dagen for eksperimentet. Det er bemerkelsesverdig at virkelige eksperimenter kan også utføres ved 96 brønn eller 384 brønns format. Dette gjør opptre live eksperiment ved hjelp dusinvis av forholdene på samme tid (muterte bakterier, MOI, plasmid eller siRNA transfeksjon, kjemikalier etc.) med antall stillinger per brønn. Selv egnet for Shigella flexneri, merker vi at "true" sanntid eller time-lapse eksperimenter er ikke gjennomførbart for mykobakterier studier siden infeksjonen syklusen overstiger målbare konsentrasjoner av CCF4 som kan beholdes i cytosol. ForAv denne grunn er den CCF4-AM substrat påføres på cellene først etter invasjon er oppnådd.
I tilfelle MetaMorph programvare brukes for innhenting og tolkning, anbefaler vi at du bruker modulen "skjerm kjøpet" som gjør det mulig å anskaffe en hel 96/384 brønners plate med et bestemt antall bilder per brønn. Videre er modulen "gjennomgang skjermdata" lar (i) å visualisere den sammensatte bilde mosaikk av hver brønn for en hvilken som helst kanal på samme tid på en stor "plakat" og (ii) å feste en spesialisert algoritme for å måle intensiteten på 535 og de 450 nm kanaler. Selv om vi har vært i stand til å måle vacuolar ruptur av single bakterier ved hjelp av time-lapse mikroskopi, ønsker vi å advare at den enzymatiske aktiviteten på overflaten av enkelte bakterier varierer rendering det vanskelig å nøyaktig relatere antall intracellulære bakterier og effektiviteten av vacuolar ruptur.
Gitt robustheten av analysen, er det egnet for high gjennomstrømming nærmer seg i 96 eller 384 vel formater. Vi har også med hell tilpasset denne protokollen for FACS analyse for å studere infeksjon av celler i suspensjon 16. Målingen kan også anvendes for undersøkelse av andre bakterier eller bærere som presenterer laktamase på deres overflate, som fører til et bredt spekter av anvendelser. For eksempel kan denne tilnærming brukes til å studere vacuolar ruptur indusert av andre patogener som β-laktamase uttrykke Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes eller Salmonella typhimurium 12.. Siden Listeria monocytogenes har en kort infeksjon syklus sammenlignes med Shigella flexneri, time-lapse eksperimenter er mulige. I kontrast, fordi Legionella pneumophila og Salmonella typhimurium vise lange infeksjon sykluser, foreslår vi å utføre endepunktdata eksperimenter.
Mangfoldet av mulige bruksområder gjør CCF4-AM/β-lactamase analysen eninteressant fluorometrisk metode for sporing vacuolar brudd forårsaket av intracellulære patogener i faste prøver eller i sanntid.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av Agence Nationale pour la Recherche og ved European Research Council.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in – 80 ° aliquots |
Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
Probenecid | Sigma | P8761 | |
β-lactamase | Sigma | P0389 |