Мы опишем метод для отслеживания endomembrane вызванной разрывом внутриклеточных бактерий<em> Шигеллы Флекснера<em></em</em> И<em<em><em> Микобактерий туберкулеза</em></em</em> От хост инвазии клеток. Наш анализ использует CCF4, хозяин цитоплазматических FRET зонда в живых или фиксированных клетках. Этот репортер разлагается под фермент, присутствующий деятельности на поверхности бактерий.
Шигеллы Флекснера являются патогенными бактериями, которые вторгаются в клетки-хозяева, входящих в эндоцитотический вакуоли. Впоследствии этот разрыв мембраны, закрытое отделение позволяет бактериям перемещаться в цитозоль, пролиферируют и дальнейшего вторжения соседних ячеек. Микобактерий туберкулеза фагоцитоз клетками иммунной системы, и недавно было показано, что разрыв мембраны phagosomal в макрофагах. Мы разработали надежный анализ для отслеживания phagosomal нарушения мембраны клетки-хозяина после вступления шигеллы Флекснера или микобактериями туберкулеза. Подходе используется CCF4, лад репортер чувствительны к β-лактамазы, что уравновешивает в цитозоле клеток-хозяев. После вторжения в клетки-хозяева, бактериальными патогенами, зонд остается неизменным, пока бактерии находятся в мембране закрытых отсеков. После разрушения вакуоль, β-лактамазу активность на поверхности внутриклеточных патогенов расщепляет CCF4 немедленно приведетING к потере FRET сигнала и переключение спектр ее излучения. Это надежное радиометрический анализ дает точную информацию о времени вакуоли разрыв индуцированной вторжения бактерий, и он может быть соединен с автоматизированной микроскопии и обработки изображений специализированных алгоритмов обнаружения излучения сигналов FRET донора и акцептора. Кроме того, оно позволяет исследовать динамику вакуоли разрушение вызванное внутриклеточных бактерий в режиме реального времени в отдельные клетки. Наконец, он идеально подходит для высокопроизводительного анализа с пространственно-временным разрешением, превышающим предыдущие методы. Здесь мы предоставляем экспериментальные детали примерных протоколов для CCF4 вакуолярных разрыва анализа на клетках HeLa и ТНР-1 макрофагами для покадровой экспериментов или конечными точками экспериментов с использованием шигеллы Флекснера, а также несколько штаммов микобактерий, таких как Mycobacterium Маринум, Mycobacterium Bovis, и микобактерий туберкулеза.
Многочисленные бактериальных патогенов усваиваются в мембране закрытых отсеках эукариотических клеток во время их течения инфекции. Проникновение в клетку происходит либо путем фагоцитоза специализированных клетках-хозяевах, как это имеет место для микобактерий туберкулеза, которые поглощаются макрофагами, или патогенов вызывают их активное поглощение обычно в не-фагоцитов. В случае индуцированное поглощение, например, для шигелл Флекснера, патоген впрыскивает эффекторных белков в цитозоле, что хост захвата наряду с другими функциями клетки жестко регулируется машины endomembrane сортировки в результате локализации бактерий в эндосомного 1,2 отсека. Впоследствии, Shigella нарушает ограждающих мембраны приводит к разрыву и вакуолярных цитозольные доступ возбудителя вмешательства хозяина торговлей мембраны и избежать доставки в лизосомы. Совсем недавно phagolysosomal разрыв Также было обнаружено как инфекции улategy используются микобактерий туберкулеза, патогенный микроорганизм, который считался в течение длительного времени, чтобы быть локализован исключительно в пределах мембраносвязанные отсека 3,17.
Исследовать динамику торговли субклеточных мембран инвазивных патогенов, большие успехи были достигнуты с просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на основе исследований в конце 1980 4,5. Например, флуоресцентной микроскопии на основе методов, использующих красители, антитела против бактериальных компонентов поверхности или маркеров для совместной локализации с субклеточных отсеков взяла на 6,7. Тем не менее, они по-прежнему не дают точной пространственно-временной и надежности для измерения вакуолярных разрыва бактериальными патогенами количественно.
Это препятствие, была встречена с анализ, основанный на полученных цефалоспоринов CCF4-AM FRET репортера, который впервые был использован для изучения экспрессии генов 8. Затем он был использован в контексте инфперегиба биологии для расследования эффекторных секреции и следовать поглощение Neisseria в клетки-хозяева 9,10,11. Мы разработали анализ воспользовавшись этим репортером для изучения вакуолярных разрыва индуцированных шигеллы Флекснера 12 и микобактерий туберкулеза 17. Принцип нашего метода представлена на рисунке 1, используя шигеллы Флекснера. Во-первых, клетки-хозяева, которые загружаются с FRET CCF4-AM субстрат, который в ловушке внутри цитоплазмы после отщепления AM сложноэфирные остатки. Затем клетки инфицируют шигеллы Флекснера. β-лактамазы, присутствующих на поверхности бактерий способен расщеплять CCF4 подложки, как только вакуоли трещин. Это приводит к потере FRET сигнал переключения пик излучения от 535 нм до 450 нм при возбуждении зонда при 405 нм. Радиометрические измерения 450/535 нм интенсивность подчеркивает вакуолярных целостности: низкие коэффициенты отражают мембрана-анзакрытые или внутриклеточных бактерий, в то время как высокие коэффициенты отражают контакт между бактериями и хозяином цитозоле. Мы также сообщаем адаптации этого метода для изучения phagosomal разрыва индуцированных микобактерий туберкулеза в ТНР-1 макрофагами. Экспериментальные принципы остаются теми же хотя последовательность обратная, CCF4-AM загрузки применяется только после бактериальной инфекции.
Таким образом, количественный радиометрические измерения флуоресценции на уровне одной клетки, вакуоли разрыва шигелл Флекснера можно отслеживать в реальном времени и в фиксированных образцов из различных типов клеток 12,13,14. Кроме того, этот способ может быть адаптирован к ряду других инвазивных патогенов, как показано в этом исследовании с использованием Mycobacterium Bovis и микобактерий туберкулеза. Наконец, миниатюризация наш протокол до 96 хорошо (или 384 а) форматов позволяет скрининг многочисленных условий с высокой пропускной способностью.
Анализ CCF4-AM/β-lactamase является простой метод для отслеживания вакуоли нарушения индуцированных внутриклеточных шигелл Флекснера и микобактерий в различных типах клеток. Это делает использование лактамазы, чувствительные цитоплазматической FRET репортер, который расщепляется ферментом активное на поверхности бактерий.
Потеря CCF4-AM подложки можно легко избежать путем добавления пробенецид, чтобы все решения после загрузки подложки. Как показано, анализ может быть адаптирована к многих типах клеток (эпителиальных клеток, фагоцитирующих клеток) и форматов (96, 35 мм со стеклянным дном посуды, 6/12/24 луночных планшетах). Для использования 6/12/24 луночный планшет, стерильные покровные распределены в нижней части каждой лунке перед посевом клеток. В конце эксперимента, покровные передаются на предметных стеклах в монтажной среде, такой как продлить Золото Реагент Antifade (Invitrogen). Таким образом, сигнал стабилен в течение длительного периода времени после анализапо сравнению с 96 скважин формат, где образцы сохранились в PBS после фиксации. Высокая стоимость CCF4-AM подложки должны быть приняты во внимание, прежде чем определение объема образца. Именно поэтому мы рекомендуем масштабирование их вниз. Эксперименты стоят дороже в формате 6/12/24 хорошо, но сигналы являются стабильными в течение нескольких дней. Напротив, эксперименты дешевле в 96-луночном формате, но образцы должны быть проанализированы в день эксперимента. Следует отметить, что живые эксперименты также может быть выполнена на 96 или 384 луночном формате. Это позволяет выполнять живой эксперимент с использованием десятков условий одновременно (мутантные бактерии, MOI, плазмиды или миРНК трансфекции, химикаты и т.д.) с номерами позиций на лунку. Хотя подходит для шигеллы Флекснера, мы подчеркиваем, что "истинный" реального времени или покадровой экспериментов не представляется возможным для исследования, так как микобактерии инфекционный цикл превышает измеряемых концентраций CCF4, которые могут быть сохранены в цитозоле. ДляПоэтому CCF4-AM подложку наносится на клетки только после того, как вторжение достигнута.
В случае MetaMorph программное обеспечение используется для сбора и анализа, мы рекомендуем использовать модуль "экран приобретения", что позволяет приобретение всей 96/384 луночный планшет с заданным числом картин на лунку. Кроме того, модуль "обзор данных экрана» позволяет (я) визуализации сшитые картины мозаики каждую лунку для любого канала одновременно на большом "сайт", и (II) цикл специализированный алгоритм для измерения интенсивностей в 535 и 450 нм каналах. Хотя, мы были в состоянии измерить вакуолярных разрыве одиночных бактерий использованием покадровой микроскопии, мы бы хотели предупредить Вас, что ферментативная активность на поверхности отдельных бактерий изменяется, что делает его трудно точно соотнести количество внутриклеточных бактерий и эффективность вакуолярных разрыву.
Принимая во внимание надежность анализа, он подходит для чIGH производительном подходе в 96 или 384 и форматов. Мы также успешно адаптировались этот протокол для FACS анализа для изучения инфекции клеток в суспензии 16. Этот анализ также может быть использован для исследования других бактерий или носителей представляет лактамазы на их поверхности, что приводит к широкий диапазон применений. Например, этот подход может быть использован для изучения вакуолярных разрыва индуцированных других патогенов, таких как β-лактамазы выразив легионелл, листерий или Salmonella Typhimurium 12. С листерий имеет короткий цикл инфекции сопоставимы с шигеллы Флекснера, покадровой эксперименты возможны. В противоположность этому, потому что легионелл и сальмонеллы Typhimurium показывать длинные циклы инфекции, мы предлагаем проводить эксперименты конечной точки.
Разнообразие возможных применений делает CCF4-AM/β-lactamase анализаинтересный флуорометрические метод для отслеживания вакуоли разрыв индуцированных внутриклеточных патогенов в фиксированных образцов или в реальном времени.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась Национальным агентством Pour La Recherche и Европейским исследовательским советом.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in – 80 ° aliquots |
Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
Probenecid | Sigma | P8761 | |
β-lactamase | Sigma | P0389 |