Summary
ونحن يبرهن على وجود طريقة لجمع البكتيريا magnetotactic (MTB) التي يمكن تطبيقها على المياه الطبيعية. يمكن أن تكون معزولة وMTB المخصب من عينات الرواسب باستخدام الإعداد بسيطة نسبيا والتي يستفيد من المغناطيسية البكتيريا الطبيعية. ويمكن بعد ذلك أن تدرس معزولة MTB بالتفصيل باستخدام كل من الضوء والمجهر الإلكتروني.
Abstract
البكتيريا Magnetotactic (MTB) هي الكائنات الدقيقة التي تم المائية الأولى المذكورة لا سيما في 1975 1 من عينات الرواسب التي تم جمعها في المستنقعات المالحة من ولاية ماساتشوستس (الولايات المتحدة الأمريكية). ومنذ ذلك الحين تم اكتشاف MTB في المياه والرواسب الطبقية الأعمدة من جميع أنحاء العالم 2. ميزة واحدة مشتركة بين جميع MTB هو أنها تحتوي على magnetosomes، والتي هي داخل الخلايا، البلورات النانوية المغناطيسية غشاء محدد من أكسيد الحديد الأسود (الحديد 3 O 4) و / أو greigite (الحديد 3 S 4) أو 3 على حد سواء، 4. في نصف الكرة الشمالي، وعادة ما تنجذب إلى MTB الطرف الجنوبي من قضيب مغناطيسي، بينما في نصف الكرة الجنوبي عادة ما تنجذب إلى الطرف الشمالي من المغناطيس 3،5. يمكن استغلال هذه الخاصية عند محاولة عزل MTB من العينات البيئية.
واحدة من الطرق الأكثر شيوعا لتخصيب MTB هو استخدام الحاويات البلاستيكية واضحة لجمع الرواسب والمياه من مصدر طبيعي،مثل بركة المياه العذبة. في نصف الكرة الشمالي، يتم وضع الطرف الجنوبي من قضيب مغناطيسي ضد خارج الحاوية فقط فوق الرواسب في واجهة الرواسب في المياه. بعد بعض الوقت، يمكن إزالة البكتيريا من داخل الحاوية بالقرب من المغناطيس مع ماصة ثم تخصب باستخدام مزيد من مضمار السباق الشعرية المغناطيس 6 و أ. المخصب مرة واحدة، يمكن وضعها على البكتيريا على شريحة المجهر باستخدام أسلوب قطرة شنقا والتي لوحظت في ضوء المجهر أو المودعة على شبكة النحاس، ولاحظ باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال (TEM).
باستخدام هذا الأسلوب، قد يكون درس معزولة MTB مجهريا لتحديد خصائص السلوك مثل السباحة، ونوع وعدد من سياط مورفولوجيا الخلايا، الخلايا، شكل بلورات مغناطيسية، وعدد من magnetosomes، وعدد من سلاسل magnetosome في كل خلية، وتكوين بلورات nanomineral، وجود فجوات بين الخلايا.
Protocol
1. MTB كوكتيل
- عند اتخاذ قرار بشأن موقع لجمع المياه العذبة البكتيريا magnetotactic (MTB)، فمن الأفضل أن تبدأ في كثير من الأحيان مع بركة أو تيار بطيئة الحركة لديها طبقة ناعمة الرواسب الطينية. في هذه المظاهرة جمعنا عينة على حافة نهر Olentangy في حرم جامعة ولاية أوهايو (OSU) في كولومبوس، أوهايو (الولايات المتحدة الأمريكية). ورغم أن هذا كان موقع مناسب للتظاهر لدينا، وبروتوكول الموصوفة هنا تنطبق على أي مكان المائية. ويمكن الاطلاع على المواد المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1. العثور على الموقع حيث عمق المياه ما بين 10 و 100 سم. في مثل هذا الموقع، يجب ان تجمع طبقة العلوية معظم الرواسب باستخدام واضحة والمسمار قمة الحاوية. حلج القطن الرواسب والمياه في وعاء حتى يتم ملأها ثلث إلى نصف الرواسب المتبقية وحجم بالماء. إبقاء الحاويات الغارقة حتى يتم ملأها بالماء ثم الغطاء بإحكام ث الحاوياتإيث في أعلى غطاء المسمار. انها ليست ضرورية لخلط الرواسب. مسح خارج الحاوية الجافة مع منشفة وثم أخذ عينة إلى مختبر الخاص بك. فإنه ليس من الضروري الاستعجال في عينة المختبر الخاص بك مرة أخرى إلى. لقد تركنا عينات MTB في حاويات بلاستيكية في هذا المجال لعدة أيام قبل إعادتهم إلى مختبرنا. يجب أن تكون قابلة للحياة MTB لعدة أسابيع إلى أشهر ما دمت تخزين العينات في مكان بارد ومظلل في الميدان.
- مرة واحدة في العينة في المختبر الخاص، وتخفيف الغطاء وترك الأمر تغطي الحاوية لتقليل كمية التبخر. تخزين الحاويات في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة، درج، أو تغطي كامل الحاوية مع رقائق الألومنيوم. السماح للالرواسب والجسيمات الدقيقة لتسوية تماما إلى أسفل الحاوية من خلال ترك العينة لعدة ساعات دون عائق لعدة أيام. فإنه ليس من الضروري أن يمزج الرواسب، MTB تفضل بيئة دون عائق. الجدران واضحة من وعاء من البلاستيكسوف تسمح لك للتأكد من أن الجزيئات قد استقروا إلى أسفل. اعتمادا على نموذج الخاص بك، يمكن أن يبقى على قيد الحياة MTB في العينة لعدة شهور.
2. MTB عزل
- عندما كنت على استعداد لعزل مغناطيس MTB مكان، على جانبي الحاوية البلاستيكية حوالي 1 سم فوق واجهة الرواسب في المياه (الشكل 1A). يجب الحرص على عدم تعكير صفو الرواسب في قاع الإناء. وضع القطب الجنوبي للقضيب مغناطيسي على جانب واحد من الحاويات والجانب الشمالي من المغناطيس شريط آخر على الجانب المقابل (الشكل 1A). يمكن أن تستخدم أي تقريبا المغناطيس، مثل قضيب تحريك مغناطيسي أو كبيرة مغناطيس الثلاجة. ويمكن استخدام أي شيء لدعم مغناطيس في الارتفاع الصحيح فوق واجهة الرواسب في المياه. لقد وجدنا أن يستريح في مغناطيس على الجزء العلوي من الورق المقوى أو البلاستيك مربع هو أفضل، ومع ذلك، يمكن أيضا أن تكون مسجلة المغناطيس إلى خارج الحاوية البلاستيكية. انتظر 30 دقيقة لعدةساعات للبكتيريا على السباحة إلى المغناطيس.
- استخدام ماصة معقمة لجمع بعناية المياه من داخل الحاوية (الشكل 1A) بالقرب من موقف قضيب مغناطيسي القطب الجنوبي (على العينات التي تم جمعها في نصف الكرة الشمالي). يجب أن تحتوي على هذه المياه التي تم MTB لجذب المغناطيس شريط القطب الجنوبي. المقبل، يجب استخدام مضمار السباق الشعرية لإثراء MTB.
3. MTB مضمار السباق
- من أجل إثراء عينتك مع البكتيريا magnetotactic، مضمار السباق الشعرية ضروري (أرقام 1B و 1C). هذه يجب القيام بها قبل عزل الخلايا من الحاوية البلاستيكية واضحة.
- استخدام بوصة 5.75 (146 ملم) والزجاج ماصة باستور لإجراء مضمار السباق. استخدام قلم الماس أو ملف لقطع الجزء العلوي من ماصة، وطول ماصة ليست حاسمة، ولكن يجب أن تكون قادرة على احتواء ما يقرب من 1-2 مل من الماء. بعد ذلك، استخدم ناسخ بنسن لإذابة بحيث تلميحيصبح مختومة (الشكل 1C). ينبغي أن يكون لها ماصة الناتجة نهاية مفتوحة ومغلقة نهاية.
- جعل العديد من هذه حلبة والأوتوكلاف ذلك الحين. بالإضافة إلى ذلك، سوف تحتاج إلى الأوتوكلاف القطن والإبر عدة معدنية طويلة.
- إضافة تصفية المياه عينة، تم جمعها من الرواسب بالقرب من واجهة الماء هو مبين في الشكل 1A، إلى مضمار السباق تعقيمها باستخدام إبرة معدنية طويلة تعلق على حقنة تصفيتها. يجب أن يكون حجم المسام للمرشح أن يكون 0.22 ملم للقضاء على الحطام والملوثات من المياه. من المهم أن تكون متأكدا تماما من أنه لا توجد فقاعات الهواء في الزجاج الشعرية.
- توصيل الجزء السفلي من مضمار السباق مع القطن المعقم (1B الشكل). استخدام إبرة معدنية لدفع القطن في نهاية مختومة من مضمار السباق لذلك هو 0،5 حتي 1 سم بعيدا عن الطرف مختومة (الشكل 1C).
- باستخدام ماصة معقمة، إضافة المياه التي تحتوي على MTB (من القسم 2.2) لعينة البحثeservoir (نهاية مفتوحة) لمضمار السباق استعدادا MTB (1B الشكل).
4. MTB التخصيب
- مرة واحدة يتم تعبئة السوائل مضمار السباق مع العينة، وضع على جانبها على سطح أفقي (على سبيل المثال، وهو الفوق) ووضع القطب الجنوبي للقضيب مغناطيسي (في نصف الكرة الشمالي) بالقرب من غيض مختومة من مضمار السباق (أرقام 1B و1C).
- إنتظر من 5 إلى 30 دقيقة لMTB للهجرة من خلال القطن. ثم يجب عليك جمع السائل بالقرب من غيض من مضمار السباق. يمكن انتظار طويل جدا، أعرض الملوثات، مثل البكتيريا متحركة أخرى، لغيض من شعري. اختياريا، يمكنك استخدام المجهر ضوء لعرض غيض من مضمار السباق ومشاهدة MTB جمع معلومات سرية في مضمار السباق في. وهذا سوف يسمح لك لتحديد كم من الوقت يستغرق لMTB للهجرة من خلال المكونات القطن.
- استخدام السكين برفق الماس لجعل الصفر قليلا بالقرب من المكونات القطن والمفاجئة قبالة نهاية مضمار السباق. <لى> استخدم حقنة 1 مل مع إبرة ضيقة (25 أو 27 مقياس) لإزالة السائل من غيض من مضمار السباق. يجب أن تحتوي هذه العينة السائلة الآن MTB المخصب.
5. MTB المراقبة من المجهر الضوئي
- وضع قطرة (10-20 ميكرولتر) من العينة MTB المخصب على ساترة.
- الوجه بسرعة ساترة أكثر من ذلك الانخفاض يواجه الآن إلى أسفل وتتدلى من ساترة.
- وضع ساترة على عصابة س، وهذا هو يستريح على شريحة زجاجية. ينبغي لليا الدائري ويبلغ قطرها أصغر قليلا ثم ساترة (حوالي 1 سم، الشكل 2).
- ضع هذا الانخفاض في الصعود إلى منصة الشنق المجهر الخفيفة والتركيز على حافة واحدة من الهبوط. والهدف 60X الجافة يعمل بشكل جيد جدا لأن معظم لديها فتحة عالية العددية (NA، على سبيل المثال، 0.93) ولكن لا تتطلب النفط، والتي من الصعب استخدام للأسلوب قطرة شنقا (الشكل 2).
- وضع الطرف الجنوبي من شريط المغناطيس إلى إغلاق د شنقاوسوف تبدأ شرطة عمان السلطانية وMTB إلى الهجرة نحو حافة الهبوط الأقرب إلى المغناطيس (الشكل 3). في غضون بضع دقائق وينبغي أن يكون العديد من MTB على حافة الهبوط (الشكل 3). تثبت لنفسك أن البكتيريا ممغنطة عن طريق عكس قطب المغناطيس ثم مراقبة البكتيريا السباحة في الاتجاه المعاكس.
6. MTB مراقبة من قبل المجهر الإلكتروني بالإرسال (TEM)
- وضع قطرة (~ 20 ميكرولتر) من MTB المخصب على شبكة النحاس والسماح للبكتيريا لتسوية لمدة 10 دقيقة.
- الفتيل من الماء الزائد مع قطعة من ورق الترشيح نظيفة.
- اختياريا، يمكن الشبكة ملطخة سلبا مع خلات اليورانيل 2٪، 2٪ حامضي الفسفوتنغستيك 7.2، أو 2.5٪ الصوديوم موليبديت 7 و 8 و 9. يتم ذلك عن طريق وضع شبكة النحاس على قطرة من وصمة عار على الفور بعد احتضان الشبكة مع MTB المخصب. احتضان الشبكة مع وصمة عار سلبية، فإن بعض الأحيان تختلف تبعا للشارععين المستخدمة، والفتيل ثم قبالة السائل مع قطعة من ورق الترشيح نظيفة.
- مراقبة MTB باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال (TEM، الشكل 4). لعمل صفها هنا وكثف لMTB استقرت Formvar والكربون المغلفة النحاس شبكة الشبكات 200 (تيد بيلا # 01800). وضعت شبكات مع الجانب الكربون أسفل على قطرة من تعليق الخلية لمدة تصل إلى 10 دقيقة، ثم يغسل مرة واحدة على الفور عن طريق وضع شبكة على قطرة ماء لمدة 30 ثانية. لتلطيخ، وضعت على شبكات قطرة من خلات اليورانيل 2٪ (تيد بيلا # 19481) لمدة 30 ثانية إلى 5 دقائق ثم تجفف وباستخدام تماما قطعة من ورق الترشيح. تم تحليل الشبكات بواسطة TEM باستخدام إما الروح Tecnai الاتحاد الدولي للفروسية في 80kV أو F20 Tecnai FEI باستخدام زاوية الحلقي عالية STEM مجال الظلام في 200kV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A المغناطيس هو أداة فعالة يمكن استخدامها لعزل البكتيريا magnetotactic (MTB) الواردة في العينات البيئية (الشكل 1A). A مضمار السباق الشعرية (1B الشكل) يستخدم الخواص المغناطيسية للMTB لجذبهم من خلال المكونات القطن حيث يمكن فصلهم عن غير الكائنات الدقيقة الواردة magnetotactic أيضا في عينة بيئية.
الشكل 1. A زجاجة بلاستيكية تحتوي على واضحة عينة الرواسب والمياه التي جمعت من نهر Olentangy في كولومبوس، أوهايو (الولايات المتحدة الأمريكية). الزجاجة يحتوي على ما يقرب من نصف المياه والرواسب نصف. يتم وضع الطرف الجنوبي من المغناطيس حوالي 1 سم فوق الرواسب لمدة تصل إلى عدة ساعات (A). بعد إزالة بعض من السائل من مكان قريب من المغناطيس على داخل الحاوية، فإنه يتم وضع داخل لص الشعريةacetrack حيث تسبح MTB من خلال المكونات القطن (السهم) في نهاية الجنوب من قضيب مغناطيسي (B). A قرب نظرا لمضمار السباق الشعرية تظهر العينة، والقطن، والسوائل التي تمت تصفيتها في نهاية مختومة من الأنبوب الشعري والطرف الجنوبي من المغناطيس شريط (C).
الشكل 2. بمجرد إثراء MTB من مضمار السباق، يمكن وضع قطرة صغيرة على ساترة، ثم انقلبت التي وضعت رأسا على عقب على يا الدائري الذي يستريح على شريحة. يمكن وضع هذه الشريحة ساندويتش-O-الدائري ساترة على مسرح المجهر الضوئي وعرضها باستخدام هدفا 60X الجافة (العدسات النفط غير مناسبة للاستخدام مع انخفاض شنقا).
الشكل 3. مشرق الصورة المجهر مجال السباحة MTB (رقيقةسهام طويلة) وجمع على حافة الهبوط شنقا (الأسهم قصيرة) التي تقع بجوار القطب الجنوبي للقضيب مغناطيسي.
الشكل 4. الصورة ناقل المجهر الإلكتروني من جرثومة واحدة magnetotactic المخصب من عينة الرواسب البيئية. مورفولوجية الخلية (حليزنة) وmagnetosomes واضحة للعيان إلى جانب السوط واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لا Magnetotactic البكتيريا وجدت في كل بالضرورة البيئة المائية 8 ولكن عندما تفعل ذلك تحدث، يمكن العثور عليها بناء على أمر من 100 - 1،000 الخلايا في المليلتر 2. من أجل مراقبة MTB باستخدام المجهر الضوئي، وسوف تحتاج ما يقرب من 50 البكتيريا / مل في عينة الخاص بك 8. إذا كان هناك أي MTB أو قليلة في عينة الخاص بك، فإنك سوف تحتاج إما لتحديد موقع جديد لجمع عينات بيئية أو ستحتاج الى محاولة واحدة أو أكثر من التقنيات التي تمت مناقشتها في القسم التالي.
أولا، يجب أن تحاول جمع المزيد من الرواسب البيئة باستخدام البلاستيك حوض كبير 8. هذا هو مفيدة بشكل خاص إذا كانت هناك حاجة أعداد كبيرة من MTB unculturable. اعتمادا على العينات البيئية، فإنه قد لا يكون من الممكن عزل عينات MTB وجود تركيز البكتيريا من 50 / مل مباشرة بعد جمع العينة. لذلك، عندما وجهتم عينتك البيئية عودة إلى لوس انجليسboratory، قد يكون من المفيد لانتظار العينة ليتأقلم مع الظروف المختبرية قبل محاولة عزل MTB باستخدام قضيب مغناطيسي. وسوف تسمح هذه الفترة التأقلم المجتمع البكتيرية حتى تنضج وإعادة في الثقافة مما يؤدي إلى تركيزات أعلى من MTB. أسلوب آخر بسيط هو أن تنتج في كثير من الأحيان عينات MTB أكثر تركيزا هو ترك قضيب مغناطيسي على جانب الحاوية العينة (الشكل 1A) لفترة أطول من الوقت (على سبيل المثال، عدة أيام). هذا يجب أن تسمح في الوقت MTB أكثر على الهجرة إلى المغناطيس. أسلوب واحد نهائي قد يكون من المفيد، هو استخدام عدة حلبة (1B الشكل) في آن واحد ومن ثم الجمع بين MTB من كل مضمار السباق في عينة واحدة. إذا كنت تعتقد أن هناك مشكلة مع مضمار السباق أو إذا كان هناك عدد كبير جدا من الكائنات الحية الدقيقة الملوثة (أي غير MTB) في عينتك المخصب، يمكنك وضع مضمار السباق تحت المجهر ضوء لمراقبة MTB لأنها تسبح من خلال PLU القطنز وإلى الحافة. وهذا سوف يسمح لك لتحديد ما إذا الكائنات الحية الدقيقة الملوثة تأتي أيضا من خلال المكونات القطن ومتى تتوقف عملية التخصيب.
ينبغي أن نذكر أن هناك طرقا أكثر تطورا لعزل MTB، ولكن هذه الأساليب تتطلب استخدام معدات أكثر تخصصا. مثال واحد ينطوي على استخدام لفائف المغناطيسي، بدلا من قضيب مغناطيسي، والأواني الزجاجية المخصصة لعزل MTB من رواسب المياه العذبة 10 و 11. بروتوكول الموصوفة هنا تمثل وسيلة غير مكلفة وفعالة لتحديد ما إذا كان يحتوي موقع البيئية MTB. هذه العزلة وبروتوكول تخصيب ما يكفي من واضح ومباشر أن الطلاب يستطيعون السيطرة علم الأحياء الدقيقة وسهولة "صقل" بحيث يمكن تحقيق عائدات أعلى من MTB. مرة واحدة وقد تم عزل MTB، تحليلات أخرى مثل التهجين في الموقع مضان، 16S الرنا الريباسي التسلسل لتحليل المجتمع، والطاقة الطيفي التشتت (EDS)، TEM، المجهر الضوئيويمكن أن تجرى القياسات المغناطيسية على MTB 12 و 13 و 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية (EAR-0920299 0745808 وEAR)؛ الولايات المتحدة المؤسسة الوطنية للعلوم الشرق آسيا والمحيط الهادئ المعاهد الصيفية، والجمعية الجيولوجية الأمريكية برنامج المنح البحثية والمنح للبحوث خريجي الدراسات العليا والمنح الدراسية من جامعة ولاية أوهايو. نود أن نشكر رئيس التحرير واثنين من المراجعين المجهولين للتعليق على بصيرة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides | Fisher Scientific | S95933 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| O-ring | Hardware store | ||
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bar magnet | Fisher Scientific | S95957 | |
| Container | Any | Any plastic or glass container that can hold at least 0.5 L and can be sealed | |
| Cotton | Any | ||
| Microscope with 60X dry lens | Zeiss | A 60X dry lens is not absolutely necessary, but this gives a high NA without using oil | |
| Diamond pen | Fisher Scientific | 08-675 | |
| 0.22 mm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9788564 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Formvar/Carbon 200 mesh, copper grids | Ted Pella Inc. | 01800 | |
| Uranyl acetate | Ted Pella Inc. | 19481 | |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | ||
| Tecnai F20 S/TEM | FEI |
References
- Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190, 377-379 (1975).
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).
- Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).
- Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria. Science. 334, 1720-1723 (2011).
- Simmons, S. L., Bazylinski, D. A., et al. South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere. Science. 311, 371-374 (2006).
- Wolfe, R., Thauer, R., et al. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Letters. 45, 31-35 (1987).
- Rodgers, F. G., Blakemore, R. P. Intercellular structure in a many-celled magnetotactic prokaryote. Archives of Microbiology. 154, 18-22 (1990).
- Moench, T. T., Konetzka, W., et al. A novel method for the isolation and study of a magnetotactic bacterium. Archives of Microbiology. 119, 203-212 (1978).
- Balkwill, D., Maratea, D. Ultrastructure of a magnetotactic spirillum. Journal of Bacteriology. 141, 1399-1408 (1980).
- Lins, U., Freitas, F., et al. Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms. Brazilian Journal of Microbiology. 34, 111-116 (2003).
- Jogler, C., Lin, W., et al. Toward Cloning of the Magnetotactic Metagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3972-3979 (2009).
- Lin, W., Li, J., et al. Newly Isolated but Uncultivated Magnetotactic Bacterium of the Phylum Nitrospirae from Beijing, China. Applied and Environmental Microbiology. 78, 668-675 (2012).
- Li, J., Pan, Y., et al. Biomineralization, crystallography and magnetic properties of bullet-shaped magnetite magnetosomes in giant rod magnetotactic bacteria. Earth and Planetary Science Letters. 293, 368-376 (2010).
- Oestreicher, Z., Valerde-Tercedor, C. Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy. Micron. 43, 1331-1335 (2012).
