Summary
Мы демонстрируем метод сбора магнитотактических бактерий (MTB), которые могут быть применены к природной воды. MTB могут быть выделены и обогащенный из проб донных осадков с помощью сравнительно простой установки, которая использует природный магнетизм бактерий. Изолированные MTB могут быть подробно рассмотрены, используя как световой и электронной микроскопии.
Abstract
Магнитотактических бактерий (МТБ) являются водными микроорганизмами, которые впервые были описаны в частности 1975 1 из проб донных осадков, собранных в солончаки штата Массачусетс (США). С тех пор MTB были обнаружены в стратифицированную воды и осадка колонн со всего мира 2. Одной из особенностей, общих для всех MTB является то, что они содержат магнитосом, которые являются внутриклеточными, мембраносвязанных магнитных нанокристаллов магнетита (Fe 3 O 4) и / или грейгит (Fe 3 S 4) или как 3, 4. В Северном полушарии, MTB, как правило, привлекают к юго конца стержневого магнита, в то время как в южном полушарии они, как правило, привлекают к северному концу магнита 3,5. Это свойство может быть использовано при попытке изолировать MTB из проб окружающей среды.
Одним из наиболее распространенных способов обогащения MTB является использование прозрачных пластиковых контейнеров для сбора осадка и воды из природного источника,таких как пресноводный пруд. В Северном полушарии, в южной части стержневого магнита помещается в отношении внешней поверхности контейнера чуть выше осадок в осадок-вода. Через некоторое время, бактерии могут быть удалены из внутри контейнера рядом с магнитом с помощью пипетки, а затем обогащенный дальнейшем с помощью капиллярной ипподроме 6 и магнита. Как только обогащается, бактерии могут быть размещены на предметное стекло микроскопа использовании висячей капли метод и наблюдать в световой микроскоп или наносится на медную сетку и наблюдать с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).
Используя этот метод, изолированные MTB могут быть изучены при помощи микроскопа, чтобы определить характеристики, такие как плавание поведения, тип и количество жгутиков, клеточной морфологии клеток, форма магнитных кристаллов, количество магнитосом, количество магнетосом сети в каждой ячейке, состав nanomineral кристаллов, а наличие внутриклеточных вакуолей.
Protocol
1. Коллекция MTB
- При принятии решения о пресноводных сайт для сбора магнитотактических бактерий (MTB), часто лучше всего начать с прудом или медленно движущийся поток, который имеет мягкий мутный слой осадка. В этой демонстрации мы собрали образцы на краю Olentangy реки на территории студенческого городка Университета штата Огайо (OSU) в Колумбусе, штат Огайо (США). В то время это было удобное место для нашей демонстрации, протокол, описанный здесь применимо к любой водной месте. Материалы, используемые в настоящем протоколе можно найти в таблице 1. Найти место, где глубина воды составляет от 10 до 100 см. В таком месте, вы должны собрать самый верхний слой осадка использованием ясно, с завинчивающейся крышкой контейнера. Совок отложений и воды в контейнере, пока не будет заполнена одной трети до половины осадка и оставшийся объем воды. Держите контейнер погружения, пока не будет заполнена водой, а затем жестко ограничить контейнер сого ее завинчивающейся крышкой. Это не следует смешивать осадка. Протрите снаружи контейнера сухим полотенцем, а затем взять образец вашей лаборатории. В этом нет необходимости спешить образца обратно в лабораторию. Мы оставили MTB образцы в пластиковых контейнерах в поле за несколько дней до возвращения их в нашу лабораторию. MTB должны быть жизнеспособными в течение нескольких недель до нескольких месяцев, пока вы храните образцы в сухом, прохладном месте в области.
- Как только образец находится в вашей лаборатории, ослабьте крышку и оставить его покрытие контейнера, чтобы уменьшить количество испарения. Храните контейнер при комнатной температуре в темном помещении, ящик или полностью покрывать контейнер с алюминиевой фольгой. Разрешить осадка и мелкие частицы полностью оседают на дне контейнера, оставляя нетронутыми образцы в течение нескольких часов до нескольких дней. Это не следует смешивать осадков, MTB предпочитаете спокойное проживание. Ясно стенах пластиковом контейнерепозволит вам убедиться, что частицы осели на дно. В зависимости от вашего образца, MTB могут оставаться живыми в образце в течение многих месяцев.
2. MTB изоляции
- Когда вы будете готовы, чтобы изолировать MTB, магниты места по бокам пластиковый контейнер примерно на 1 см выше осадок-вода (рис. 1А). Будьте осторожны, чтобы не потревожить осадок на дне емкости. Поместите южного полюса стержневого магнита на одной стороне контейнера и северной стороны другого стержневого магнита на противоположную сторону (рис. 1А). Практически любой магнит может быть использован, например, магнитной мешалкой или большой магнит холодильника. Все может быть использован для поддержки магниты на нужной высоте над осадком воде интерфейс. Мы обнаружили, что отдыхает магниты на вершине картонные или пластиковые окна лучше всего, однако, магниты также могут быть приклеенный к внешней стороне пластикового контейнера. Подождите 30 минут до несколькихчасы для бактерий, чтобы плыть к магниту.
- С помощью стерильной пипеткой тщательно собирать воду внутри контейнера (рис. 1А) около положения южного полюса стержневого магнита (для образцов, собранных в Северном полушарии). Эта вода должна содержать MTB, которые были привлечены к юго-полюс магнита. Далее, капиллярный ипподроме должны быть использованы для дальнейшего обогащения MTB.
3. MTB Racetrack
- Для того, чтобы обогатить ваш пример с магнитотактических бактерий, капиллярный ипподроме необходимости (рис. 1В и 1С). Они должны быть сделаны до выделения клеток из ясного пластиковый контейнер.
- Используйте 5,75 дюймовый (146 мм) стекло пипетки Пастера, чтобы ипподроме. Используйте перо алмаза или файл, чтобы отрезать верхнюю часть пипетки, длина пипетки не критично, но она должна быть в состоянии содержать примерно 1-2 мл воды. Затем с помощью газовой горелки, чтобы расплавить кончик так, чтобыона становится запечатанные (рис. 1С). В результате пипетки должны иметь открытый конец и запечатанный конец.
- Сделайте несколько таких гоночных трассах, а затем автоклав. Кроме того, вы должны будете автоклав хлопка и несколькими длинными металлическими иглами.
- Добавить фильтруется проб воды, собранных из вблизи границы осадка воды показано на рисунке 1а, чтобы автоклавного ипподроме помощью длинной иглы металла прикреплена к фильтруется шприц. Размер пор фильтра должен быть 0,22 мм для устранения мусора и загрязняющих веществ из воды. Важно быть абсолютно уверены, что нет никаких пузырьков воздуха в стеклянный капилляр.
- Вставьте нижнюю часть ипподрома с стерильной ватой (рис. 1б). С помощью металлической иглы нажать на хлопок на запечатанный конец трека, так что 0,5 - 1 см от кончика запечатанный (рис. 1С).
- С помощью стерильной пипеткой, добавляют MTB содержащих воду (из раздела 2.2) к образцу гeservoir (открытый конец) подготовленного ипподрома MTB (рис. 1б).
4. MTB обогащению
- После ипподроме наполнен образец жидкости, положите его на бок на горизонтальную поверхность (например, настольные) и поместить южного полюса стержневого магнита (в Северном полушарии) рядом с запечатанной кончик ипподроме (рис. 1B и 1С).
- Подождите 5 до 30 мин для MTB мигрировать через хлопка. Тогда вы должны собирать жидкости вблизи вершины ипподроме. Ожидание слишком долго может ввести загрязняющих веществ, таких как другие подвижные бактерии, до кончика капилляра. При желании можно использовать световой микроскоп, чтобы посмотреть кончиком ипподром и смотреть MTB собирать на верхушке ипподроме в. Это позволит вам определить, как долго он принимает MTB мигрировать через ватный тампон.
- Осторожно использовать алмазный нож, чтобы сделать небольшой царапины около ватный тампон и обрывать конце ипподрома. <li> Используйте 1 мл шприц с узкой иглы (25 или 27 калибра), чтобы удалить жидкость из кончика ипподроме. Эта жидкость образца теперь должен содержать обогащенного MTB.
5. MTB наблюдения с помощью световой микроскопии
- Поместите каплю (10-20 мкл) образца обогащенного MTB на покровное.
- Быстро переверните покровное над тем, падение в настоящее время сталкивается вниз и свисают с покровным.
- Поместите покровное на уплотнительное кольцо, которое покоится на стекле. Уплотнительное кольцо должно быть немного меньше диаметра затем покровное (около 1 см; рис. 2).
- Разместите эту висячей капли на свет столик микроскопа и сосредоточить внимание на одном краю капли. 60X сухой цели работает очень хорошо, потому что большинство из них имеют высокую числовую апертуру (NA, например, 0,93), но не требуют масла, которые трудно использовать для висячей капли метода (рис. 2).
- Поместите в южной части стержневого магнита близко к висящей гROP и MTB начнет мигрировать к краю капли ближе к магниту (рис. 3). Через несколько минут многие MTB должна быть на краю капли (рис. 3). Докажите себе, что бактерии обладают магнитными свойствами путем изменения полюсом магнита, а затем наблюдать бактерии плавают в противоположном направлении.
6. MTB наблюдения методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)
- Место падения (~ 20 мкл) обогащенного MTB на медную сетку и позволяют бактериям урегулировать в течение 10 мин.
- Вика лишнюю воду с кусочком чистой фильтровальной бумаги.
- Необязательно, сетка может быть негативно окрашенных 2% уранилацетата, 2% фосфорно-кислый 7,2, или 2,5% раствор натрия молибдат 7, 8, 9. Это делается путем размещения медную сетку на каплю пятно сразу же после инкубации сетки с обогащенным MTB. Инкубируйте сетки с отрицательной окраски, раз будет меняться в зависимости от улАйн использовать, а затем фитиль от жидкости с куском чистой фильтровальной бумаги.
- Соблюдайте MTB использованием просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ, рисунок 4). Для работы описаны здесь MTB были адсорбированных на формвар стабилизированный и углерода покрытием 200 меш медной сетки (Ted Pella # 01800). Сети были размещены с углеродом стороной вниз на каплю суспензии клеток в течение 10 мин, затем сразу же промывают один раз путем размещения сетки на каплю воды на 30 сек. Для окрашивания, сетки были размещены на капли 2% уранилацетата (Ted Pella # 19481) за 30 сек до 5 мин, а затем полностью высушить с помощью куска фильтровальной бумаги. Решетки были проанализированы с помощью ПЭМ, используя либо Дух FEI Tecnai на 80kV или FEI Tecnai F20 с использованием высоких темных углов кольцевой STEM поле на 200 кВ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Магнит является эффективным инструментом, который может быть использован для выделения магнитотактических бактерий (MTB), содержащихся в пробах окружающей среды (рис. 1А). Капиллярной ипподроме (рис. 1б) использует магнитные свойства MTB, чтобы привлечь их через ватный тампон, где они могут быть отделены от не-магнитотактических микроорганизмы содержатся также в рамках экологического образца.
Рисунок 1. Прозрачный пластиковый флакон, содержащий отложений и воды образец, собранный из Olentangy реке в городе Колумбус, штат Огайо (США). Бутылка содержит примерно половину осадка и половину воды. Южной части магнит помещается примерно на 1 см выше осадка в течение нескольких часов (A). После удаления некоторых из жидкости рядом с магнитом внутри контейнера, он помещается внутри капиллярной гacetrack где MTB плавание через ватный тампон (стрелка) на юго конца стержневого магнита (B). Закрыть вид на ипподром капиллярной показывает пример, хлопок, фильтруют жидкость, запечатанный конец капиллярной трубке и южной части стержневого магнита (C).
Рисунок 2. Когда MTB были обогащены от ипподрома, небольшое падение может быть размещен на покровное стекло, которое затем перевернул вверх дном и помещают на уплотнительное кольцо, которое покоится на слайде. Это слайд-о-кольцо-покровное сэндвич могут быть размещены на свет столик микроскопа и просматривать с помощью 60X сухой цели (нефть линзы неудобны для использования с висячей капли).
Рисунок 3. Яркое изображение поле микроскопа плавания MTB (тонкиедлинные стрелки) и сбор на край висячей капли (короткие стрелки), который находится рядом с южным полюсом магнита.
Рисунок 4. Просвечивающего электронного микроскопа изображение одной бактерии магнитотактических обогащенный с экологической образца осадка. Морфологии клетки (спириллы) и магнитосом четко видны вместе с одним жгутиком.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Магнитотактических бактерии не обязательно имеются в каждом водную среду 8, но когда они происходят, они могут быть найдены порядка 100 - 1000 клеток на миллилитр 2. Для того чтобы наблюдать MTB с помощью оптической микроскопии, необходимо около 50 бактерий / мл в образце 8. Если нет или мало MTB в вашей выборке, то вам нужно будет либо выбрать новый экологический сайт для сбора вашим образцам или вам нужно попробовать один или несколько методов, обсуждаемых в следующем разделе.
Во-первых, вы должны стараться собирать больше осадка из окружающей среды, используя большую пластиковую ванну 8. Это особенно полезно, если большое количество unculturable MTB необходимости. В зависимости от экологических образцов, оно не может быть возможным, чтобы изолировать MTB образцов с концентрацией 50 бактерий / мл сразу после сбора образца. Поэтому, когда вы приносите ваш экологические образцы обратно в Ла-boratory, это может быть выгодно ждать образца, чтобы акклиматизироваться в лабораторных условиях, прежде чем пытаться изолировать MTB использованием стержневого магнита. Этот период акклиматизации позволит бактериальные сообщества, чтобы созреть и населить культуры приводит к более высокой концентрации MTB. Еще один простой метод, который часто приводит к более концентрированной образцы MTB это оставить стержневого магнита на стороне контейнер для пробы (рис. 1а) в течение длительного периода времени (например, за несколько дней). Это должно позволить MTB больше времени, чтобы перейти на магните. И последний метод, который может быть полезным, заключается в использовании нескольких гоночных трассах (рис. 1б) сразу, а затем объединить MTB друг от ипподрома в одном образце. Если вы считаете, есть проблемы с беговой дорожкой или если есть слишком много загрязняющих микроорганизмов (т.е. не MTB) в Вашем обогащенного образца, вы можете разместить ипподроме под световым микроскопом наблюдать MTB, как они плавают через хлопка плюг и в чаевых. Это позволит вам определить, если загрязняющие микроорганизмы также поступают через ватный тампон и, когда остановить процесс обогащения.
Следует отметить, что существуют более изощренные способы, чтобы изолировать MTB, но эти методы требуют использования более специализированным оборудованием. Один из примеров связан с использованием магнитной катушки, а стержневого магнита, и специальные стеклянные сосуды, чтобы изолировать MTB из пресноводных отложений 10, 11. Протокол, описанный здесь, представляет собой недорогой и эффективный способ для определения того, экологические сайт содержит MTB. Эта изоляция и обогащения протокол достаточно прост, что микробиологии студенты могут освоить и легко "тонкой настройки", так что более высокие выходы MTB может быть достигнута. После MTB были выделены, другие анализы, такие как флуоресценции в гибридизация, 16S рРНК последовательности для сообщества анализа, энергетической дисперсии спектроскопии (EDS), TEM, оптической микроскопиии магнитных измерений могут быть проведены на MTB 12, 13, 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Национального научного фонда США (EAR-0920299 и EAR-0745808), Национальный научный фонд США Восточной Азии и Тихого Летние институты; Геологического общества Америки Программа исследовательских грантов и грантов для выпускников Высшей исследования и стипендии из Университета штата Огайо. Мы хотели бы поблагодарить редактора и двух анонимных рецензентов за их ценные комментарии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides | Fisher Scientific | S95933 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| O-ring | Hardware store | ||
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bar magnet | Fisher Scientific | S95957 | |
| Container | Any | Any plastic or glass container that can hold at least 0.5 L and can be sealed | |
| Cotton | Any | ||
| Microscope with 60X dry lens | Zeiss | A 60X dry lens is not absolutely necessary, but this gives a high NA without using oil | |
| Diamond pen | Fisher Scientific | 08-675 | |
| 0.22 mm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9788564 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Formvar/Carbon 200 mesh, copper grids | Ted Pella Inc. | 01800 | |
| Uranyl acetate | Ted Pella Inc. | 19481 | |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | ||
| Tecnai F20 S/TEM | FEI |
References
- Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190, 377-379 (1975).
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).
- Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).
- Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria. Science. 334, 1720-1723 (2011).
- Simmons, S. L., Bazylinski, D. A., et al. South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere. Science. 311, 371-374 (2006).
- Wolfe, R., Thauer, R., et al. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Letters. 45, 31-35 (1987).
- Rodgers, F. G., Blakemore, R. P. Intercellular structure in a many-celled magnetotactic prokaryote. Archives of Microbiology. 154, 18-22 (1990).
- Moench, T. T., Konetzka, W., et al. A novel method for the isolation and study of a magnetotactic bacterium. Archives of Microbiology. 119, 203-212 (1978).
- Balkwill, D., Maratea, D. Ultrastructure of a magnetotactic spirillum. Journal of Bacteriology. 141, 1399-1408 (1980).
- Lins, U., Freitas, F., et al. Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms. Brazilian Journal of Microbiology. 34, 111-116 (2003).
- Jogler, C., Lin, W., et al. Toward Cloning of the Magnetotactic Metagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3972-3979 (2009).
- Lin, W., Li, J., et al. Newly Isolated but Uncultivated Magnetotactic Bacterium of the Phylum Nitrospirae from Beijing, China. Applied and Environmental Microbiology. 78, 668-675 (2012).
- Li, J., Pan, Y., et al. Biomineralization, crystallography and magnetic properties of bullet-shaped magnetite magnetosomes in giant rod magnetotactic bacteria. Earth and Planetary Science Letters. 293, 368-376 (2010).
- Oestreicher, Z., Valerde-Tercedor, C. Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy. Micron. 43, 1331-1335 (2012).
