Summary
Wir demonstrieren eine Methode, um magnetotaktischen Bakterien (MTB), die natürlichen Gewässern angewendet werden können sammeln. MTB isoliert und angereichert werden von Sedimentproben mit einem relativ einfachen Setup, das zu Nutze macht die Bakterien die natürlichen Magnetismus. Isolated MTB können anschließend im Detail sowohl mit Licht-und Elektronenmikroskopie untersucht werden.
Abstract
Magnetotaktische Bakterien (MTB) sind im Wasser lebende Mikroorganismen, die zuerst vor allem in 1975 1 wurden aus Sedimentproben in Salzwiesen of Massachusetts (USA) gesammelt beschrieben. Seitdem MTB haben im Schichtbetrieb Wasser-und Sediment-Säulen wurden aus der ganzen Welt 2 entdeckt. Ein gemeinsames Merkmal aller MTB ist, dass sie Magnetosomen, die intrazelluläre Membran-gebundenen magnetischen Nanokristalle aus Magnetit (Fe 3 O 4) und / oder Greigit (Fe 3 S 4) oder beide 3, 4 sind enthalten. In der nördlichen Hemisphäre, werden MTB typischerweise mit dem südlichen Ende eines Stabmagneten angezogen, während in der südlichen Hemisphäre sie in der Regel bis zum nördlichen Ende eines Magneten 3,5 angezogen werden. Diese Eigenschaft kann ausgenutzt werden, wenn sie versuchen, MTB aus Umweltproben zu isolieren.
Einer der gebräuchlichsten Methoden zum MTB bereichern ist eine klare Kunststoff-Behälter zu verwenden, um Sediment und Wasser aus einer natürlichen Quelle sammeln,wie einem Süßwasser Teich. In der nördlichen Hemisphäre ist das südliche Ende eines Stabmagneten an der Außenseite des Behälters oberhalb des Sediments an der Sediment-Wasser-Grenzfläche platziert. Nach einiger Zeit können die Bakterien aus dem Inneren des Behälters in der Nähe des Magneten mit einer Pipette entfernt und dann weiter unter Verwendung eines Kapillar-Rennstrecke und einen Magneten 6 angereichert. Sobald angereichert, die Bakterien auf einem Objektträger mit einem hängenden Tropfen Verfahren platziert werden und beobachtet im Lichtmikroskop oder abgeschieden auf einem Kupfergitter und beobachtet mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).
Mit dieser Methode können isolierte MTB untersucht mikroskopisch Eigenschaften wie Schwimmen bestimmen Verhalten, Art und Anzahl der Geißeln, Zell-Morphologie der Zellen, die Form der magnetischen Kristalle, die Anzahl der Magnetosomen, die Anzahl der Magnetosomenketten in jeder Zelle, die Zusammensetzung der die nanomineral Kristalle, und das Vorhandensein der intrazelluläre Vakuolen.
Protocol
Ein. MTB Sammlung
- Bei der Entscheidung über ein Süßwasser-Website, um magnetotaktischen Bakterien sammeln (MTB), ist es oft am besten, mit einem Teich oder langsam fließenden Bach, der einen weichen schlammigen Sedimenten Schicht beginnen. In dieser Demonstration sammelten wir eine Probe am Rande des Olentangy River auf dem Campus der Ohio State University (OSU) in Columbus, Ohio (USA). Dies war zwar eine günstige Lage für unsere Demonstration ist die hier beschriebene Protokoll für jeden Wasserorganismen Lage. Die Materialien in diesem Protokoll verwendet werden in Tabelle 1 zu finden. Finden einer Stelle, wo die Tiefe des Wassers liegt zwischen 10 und 100 cm. An einer solchen Stelle, sollten Sie sammeln die oberste Schicht des Sediments mit einer klaren, Schraub-Top-Container. Schaufel das Sediment und Wasser in den Behälter, bis er mit einem Drittel bis zur Hälfte Sediment und dem verbleibenden Volumen mit Wasser gefüllt ist. Halten Sie den Behälter getaucht, bis es mit Wasser gefüllt ist und dann dicht verschließen den Behälter wit seiner Schraub-Deckel. Es ist nicht notwendig, um das Sediment zu mischen. Wischen Sie die Außenseite des Behälters mit einem Handtuch trocken und nehmen Sie dann die Probe auf Ihrem Labor. Es ist nicht notwendig, die Probe so schnell wieder in Ihrem Labor. Wir haben MTB Proben in Kunststoff-Behältern im Bereich links für mehrere Tage, bevor er sie zurück zu unserem Labor. Die MTB lebensfähig sein sollten für mehrere Wochen bis Monate, so lange Sie die Proben an einem kühlen, schattigen Ort auf dem Feld.
- Nachdem die Probe im Labor, lösen Sie den Deckel und lassen Sie ihn für den Behälter, um die Menge der Verdunstung zu reduzieren. Bewahren Sie die Behälter bei Raumtemperatur in einem dunklen Raum, Schublade oder vollständig bedecken den Behälter mit Aluminiumfolie. Erlauben das Sediment und feine Teilchen vollständig auf dem Boden des Behälters ab, indem man die Probe ungestört für einige Stunden bis mehrere Tage. Es ist nicht notwendig, um das Sediment zu mischen, bevorzugen MTB einen ungestörten Umfeld. Die klaren Wände des Kunststoffbehälterskönnen Sie bestätigen, dass die Teilchen auf den Boden nieder. Abhängig von Ihrer Probe können MTB in der Probe verbleiben Leben für viele Monate.
2. MTB Isolation
- Wenn Sie bereit sind, um die MTB, Ort Magneten auf den Seiten der Kunststoff-Behälter ca. 1 cm über der Sediment-Wasser-Grenzfläche (Abbildung 1A) zu isolieren sind. Achten Sie darauf, um das Sediment am Boden des Behälters zu stören. Setzen Sie den Südpol eines Stabmagneten auf der einen Seite des Behälters und der Nordseite des anderen Stabmagneten auf der gegenüberliegenden Seite (Abbildung 1A). Fast jedes Magneten verwendet werden, wie etwa einem magnetischen Rührstab oder große Magnete. Alles kann verwendet werden, um die Magneten in der richtigen Höhe über dem Sediment-Wasser-Grenzfläche zu unterstützen. Wir haben festgestellt, dass die aufliegenden Magnete auf der Oberseite eines Papp-oder Kunststoff-Box ist sehr gut, jedoch sind die Magnete auch zur Außenseite des Kunststoffbehälters abgeklebt werden. Warten Sie 30 min bis zu mehrerenStunde für die Bakterien zu dem Magneten zu schwimmen.
- Verwenden Sie eine sterile Pipette sorgfältig sammeln das Wasser aus dem Inneren des Behälters (1A) in der Nähe der Position des Südpol Stabmagneten (für Proben in der nördlichen Hemisphäre gesammelt). Dieses Wasser sollte die MTB, die zum Südpol Stabmagneten angezogen worden sind. Weiter sollte eine Kapillare Rennstrecke zur weiteren Bereicherung des MTB werden.
3. MTB Racetrack
- Um Ihre Probe mit magnetotaktischen Bakterien anzureichern, ist eine Kapillare Rennstrecke notwendig (1B und 1C). Diese müssen vor dem Isolieren der Zellen aus dem klaren Plastikbehälter hergestellt werden.
- Verwenden Sie einen 5,75 Zoll (146 mm) Glas Pasteurpipette eine Rennstrecke zu machen. Verwenden eines Diamant Stift oder Datei abzuschneiden die Spitze der Pipette, ist die Länge der Pipette nicht entscheidend, aber es sollte in der Lage sein, um etwa 1-2 ml Wasser enthalten. Weiter, verwenden Sie einen Bunsenbrenner, um die Spitze zu schmelzen, so dasses wird abgedichtet (Abbildung 1C). Die resultierende Pipette sollte ein offenes Ende und ein verschlossenes Ende.
- Machen Sie mehrere dieser Rennstrecken und dann Autoklaven. Darüber hinaus werden Sie brauchen, um Baumwolle und mehrere lange Metall-Nadeln autoklavieren.
- Hinzufügen filtrierten Probe Wasser, aus der Nähe der Sedimentwasserschnittstelle in 1A gezeigt gesammelt, zu einer autoklavierten Rennstrecke Verwendung eines langen metallischen Nadel an einer Spritze filtriert. Die Porengröße des Filters 0,22 mm sollte, um Verschmutzungen und Verunreinigungen aus dem Wasser zu beseitigen. Es ist wichtig, absolut sicher sein, dass keine Luftblasen in der Glaskapillare.
- Stecken Sie den unteren Rand der Rennstrecke mit steriler Baumwolle (Abbildung 1B). Verwenden Sie die Metall-Nadel, die Baumwolle in Richtung der verschlossenen Ende der Rennstrecke drücken so dass es 0,5 - 1 cm entfernt von der versiegelten Spitze (Abbildung 1C).
- Mit einer sterilen Pipette, fügen Sie den MTB-haltigem Wasser (aus Abschnitt 2.2) auf die Probe reservoir (open end) einer vorbereiteten MTB Rennstrecke (Abbildung 1B).
4. MTB Enrichment
- Sobald die Rennstrecke mit der Probe gefüllt ist, lag es auf der Seite auf einer horizontalen Fläche (zB ein Tischgerät) und platzieren Sie den Südpol eines Stabmagneten (in der nördlichen Hemisphäre) neben dem verschlossenen Spitze der Rennstrecke (1B und 1C).
- Nach 5 bis 30 Minuten für die MTB durch die Baumwolle zu migrieren. Dann sollten Sie sammeln das Fluid in der Nähe der Spitze der Rennstrecke. Zu lange warten können Verunreinigungen, z. B. andere bewegliche Bakterien, auf die Spitze der Kapillare einzubringen. Optional können Sie auch ein Lichtmikroskop, um die Spitze der Rennstrecke sehen und beobachten das MTB an der Rennstrecke Geheimtipp sammeln. Dies ermöglicht Ihnen zu bestimmen, wie lange es die MTB durch die Wattestopfen migrieren dauert.
- Drücken Sie vorsichtig mit dem Diamantmesser einen kleinen Kratzer in der Nähe Wattestopfen machen und lassen Sie das Ende der Rennstrecke. <li> Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer schmalen Nadel (25 oder 27 Gauge), um die Flüssigkeit von der Spitze der Rennstrecke entfernen. Diese flüssige Probe sollte nun der angereicherten MTB.
5. MTB Beobachtung durch Lichtmikroskopie
- Geben Sie einen Tropfen (10-20 ul) des angereicherten MTB Probe auf einem Deckglas.
- Schnell drehen das Deckglas auf, so dass die Tropfen wird nun nach unten und hängen von dem Deckglas.
- Platzieren des Deckplättchens auf einen O-Ring, der auf einem Glas-Objektträger ruht. Der O-Ring soll einen geringfügig kleineren Durchmesser als das Deckglas (etwa 1 cm, Abbildung 2).
- Legen Sie diese hängenden Tropfen auf einem Lichtmikroskop Bühne und konzentrieren sich auf eine Kante des Tropfens. Ein 60X Trockenobjektiv funktioniert sehr gut, da die meisten eine hohe numerische Apertur (NA, z. B. 0,93) haben, aber nicht erfordern Öl, das schwer zu hängenden Tropfen-Verfahren (Abbildung 2) zu verwenden ist.
- Legen Sie das südliche Ende eines Stabmagneten in der Nähe des hängenden drop und MTB beginnt in Richtung der Kante des Tropfens am nächsten zu dem Magneten (Abbildung 3) zu migrieren. Innerhalb von wenigen Minuten viele MTB sollte an der Kante des Tropfens (Abbildung 3). Beweisen Sie sich, dass die Bakterien magnetischen durch die Umkehrung der Pole des Magneten sind und dann beobachten, die Bakterien schwimmen in die entgegengesetzte Richtung.
6. MTB Beobachtung durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
- Geben Sie einen Tropfen (~ 20 ul) der angereicherten MTB auf eine Kupfer-Netz und damit die Bakterien für 10 Minuten absetzen.
- Wick Sie überschüssiges Wasser mit einem Stück von sauberem Filterpapier.
- Optional kann das Gitter negativ mit 2% Uranylacetat, 2% Phosphorwolframsäure, pH 7,2, oder 2,5% Natriummolybdat 7, 8, 9 gefärbt werden. Dies geschieht, indem die Kupfer-Gitter auf einem Tropfen Fleck unmittelbar nach Inkubation des Gitters mit der angereicherten MTB getan. Inkubieren des Gitters mit der negativen Beize werden die Zeiten in Abhängigkeit von der strain verwendet und dann Docht aus der Flüssigkeit mit einem sauberen Filterpapier.
- Beachten Sie die MTB mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, Abbildung 4). Für die hier beschriebenen Arbeiten MTB wurden Formvar stabilisiert und Kohlenstoff beschichtet 200 mesh Kupfergittern (Ted Pella # 01800) adsorbiert. Die Gitter mit dem Kohlenstoff Seite wurden auf einem Tropfen Zellsuspension für bis zu 10 min platziert, dann sofort gewaschen einmal, indem das Gitter auf einem Tropfen Wasser für 30 Sekunden. Zur Anfärbung wurden die Gitter auf einem Tropfen von 2% Uranylacetat (Ted Pella # 19.481) für 30 platziert sec bis 5 min und dann getrocknet komplett mit einem Stück Filterpapier. Die Gitter wurden mit TEM entweder mit einem FEI Tecnai Spirit bei 80kV oder einer FEI Tecnai F20 mit hohen Winkel ringförmigen Dunkelfeld-STEM bei 200kV analysiert.
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Representative Results
Ein Magnet ist ein wirksames Werkzeug, um magnetotaktischen Bakterien (MTB) in Umweltproben (Abbildung 1A) enthalten isolieren. Eine Kapillare Rennstrecke (1B) nutzt die magnetischen Eigenschaften der MTB, um sie durch einen Wattestopfen wo sie aus nicht magnetotaktischen Mikroorganismen auch in der Umweltprobe enthaltenen getrennt werden können anzuziehen.
Abbildung 1. Eine klare Kunststoff-Flasche mit einem Sediment und Wasser Probe aus dem Olentangy River in Columbus, Ohio (USA) gesammelt. Die Flasche enthält etwa die Hälfte Sediment und ein-halb Wasser. Das südliche Ende eines Magneten befindet sich ca. 1 cm über dem Sediment für platzierte bis zu mehreren Stunden (A). Nach Entfernen eines Teils des Fluids aus der Nähe des Magneten auf der Innenseite des Behälters, wird es im Inneren einer Kapillare r platziertacetrack wo die MTB schwimmen durch einen Wattestopfen (Pfeil) in Richtung Süden Ende eines Stabmagneten (B). Eine Nahaufnahme der Kapillare Rennstrecke zeigt die Probe, Baumwolle, gefilterte Flüssigkeit, geschlossenes Ende der Kapillare und südlichen Ende eines Stabmagneten (C).
Abbildung 2. Sobald die MTB von der Rennstrecke angereichert sein, kann ein kleiner Tropfen auf einem Deckglas, das dann umgedreht wird umgedreht und auf einem O-Ring, der auf einem Schlitten aufliegt abgegeben werden. Das Slide-O-Ring-Deckglas-Sandwich auf einem Lichtmikroskop Bühne platziert werden und unter Verwendung eines 60X Trockenobjektiv (Öl Objektive sind unbequem mit einem hängenden Tropfen verwenden).
Abbildung 3. Hellfeld-Mikroskop Bild MTB Schwimmen (dünnelangen Pfeile) und Sammeln von an der Kante des hängenden Tropfens (kurze Pfeile), die neben der Südpol eines Stabmagneten ist.
Abbildung 4. Transmissionselektronenmikroskop Bild eines einzelnen magnetotaktischen Bakterium aus ökologischer Sedimentprobe bereichert. Die Morphologie der Zelle (Spirillum) und Magnetosomen deutlich sichtbar sind zusammen mit einer einzelnen Flagellum.
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Discussion
Magnetbakterien sind nicht unbedingt in jeder Gewässer 8 gefunden, aber wenn sie eintreten, können sie in der Größenordnung von 100 gefunden werden - 1000 Zellen pro Milliliter 2. Um die MTB mittels optischer Mikroskopie beobachten, benötigen Sie etwa 50 Bakterien / ml in Ihrer Probe 8. Wenn es keine oder nur wenige MTB in Ihrer Probe sind, dann müssen Sie entweder eine neue Umwelt-Website auswählen, um Ihre Proben zu sammeln oder müssen Sie eine oder mehrere der Techniken im nächsten Abschnitt besprochen versuchen.
Zunächst sollten Sie versuchen, sammeln mehr Sediment aus der Umgebung mit einer großen Plastikwanne 8. Dies ist besonders nützlich, wenn eine große Anzahl von unculturable MTB benötigt werden. Abhängig von der Umweltprobe, kann es nicht möglich sein, MTB Proben mit einer Konzentration von 50 Bakterien / ml unmittelbar nach Entnahme der Probe zu isolieren. Deshalb, wenn Sie bringen Sie Ihre Probe aus der Umwelt zurück zum laboratory, kann es vorteilhaft sein, für die Probe, um zu warten, bevor Laborbedingungen versucht, die Verwendung eines MTB Stabmagneten isolieren gewöhnen. Diese Eingewöhnungszeit wird es der bakteriellen Gemeinschaft zu reifen und bevölkern die Kultur, was zu höheren Konzentrationen von MTB. Eine andere Technik, die oft einfach produziert konzentrierteren MTB Proben ist, den Stabmagneten auf der Seite des Probenbehälters (1A) für eine längere Zeit (beispielsweise mehrere Tage) verlassen. Dies sollte es der MTB mehr Zeit, um den Magneten zu migrieren. Eine letzte Technik, die nützlich sein können, ist es, mehrere Rennstrecken (Abbildung 1B) auf einmal benutzen und dann verbinden die MTB von jeder Rennstrecke in einer Probe. Wenn Sie glauben, dass es ein Problem mit einer Rennstrecke oder wenn es zu viele kontaminierenden Mikroorganismen (dh nicht-MTB) in Ihrem angereicherte Probe sind, können Sie die Rennstrecke unter einem Lichtmikroskop die MTB beobachten, wie sie durch die Baumwolle plu schwimmen platziereng und in die Spitze. Dies ermöglicht Ihnen zu bestimmen, ob kontaminierenden Mikroorganismen auch kommen durch den Wattebausch und wenn die Anreicherung zu stoppen.
Wir sollten erwähnen, dass es mehr ausgefeilte Möglichkeiten zur MTB isolieren, aber diese Methoden erfordern den Einsatz von mehr spezialisierte Ausrüstung. Ein Beispiel hierfür ist die Verwendung einer Magnetspule, anstatt einen Stabmagneten und kundenspezifische Glas-Schiffe MTB ab Süßwassersedimente 10, 11 zu isolieren. Das hier beschriebene Protokoll stellt eine kostengünstige und effektive Methode zur Bestimmung, ob eine Umweltverträglichkeitsprüfung Website MTB enthält. Diese Isolierung und Anreicherung Protokoll ist einfach genug, dass Mikrobiologie Schüler beherrschen und einfach "fine-tune", so dass höhere Ausbeuten an MTB erreicht werden kann. Sobald die MTB isoliert wurden, andere Analysen, wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, rRNA 16S für Community-Analyse, Energie Spektroskopie (EDS), TEM, optische Mikroskopie Sequenzierungund magnetischen Messungen kann auf der MTB 12, 13, 14 durchgeführt werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
US National Science Foundation ostasiatischen und pazifischen Summer Institutes;; der Geological Society of America Research Grant Program und den Alumni Grants for Graduate Research and Scholarship Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der US National Science Foundation (EAR-0920299 und EAR-0745808) unterstützt an der Ohio State University. Wir möchten den Editor und zwei anonymen Gutachtern für ihre wertvollen Kommentare danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides | Fisher Scientific | S95933 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| O-ring | Hardware store | ||
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bar magnet | Fisher Scientific | S95957 | |
| Container | Any | Any plastic or glass container that can hold at least 0.5 L and can be sealed | |
| Cotton | Any | ||
| Microscope with 60X dry lens | Zeiss | A 60X dry lens is not absolutely necessary, but this gives a high NA without using oil | |
| Diamond pen | Fisher Scientific | 08-675 | |
| 0.22 mm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9788564 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Formvar/Carbon 200 mesh, copper grids | Ted Pella Inc. | 01800 | |
| Uranyl acetate | Ted Pella Inc. | 19481 | |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | ||
| Tecnai F20 S/TEM | FEI |
References
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