Summary
We tonen een methode magnetotactic bacteriën (MTB) die kunnen worden toegepast in natuurlijke wateren verzamelen. MTB kunnen worden geïsoleerd en verrijkt door sediment monsters met behulp van een relatief eenvoudige installatie die gebruik maakt van de bacteriën de natuurlijke magnetisme. Geïsoleerde MTB kunnen dan worden in detail onderzocht met behulp van zowel licht-en elektronenmicroscopie.
Abstract
Magnetotactic bacteriën (MTB) zijn in het water levende micro-organismen die voor het eerst met name werden in 1975 1 beschreven van sediment monsters verzameld in kwelders van Massachusetts (USA). Sindsdien MTB zijn ontdekt in gelaagd water-en sediment-kolommen van over de hele wereld 2. Kenmerkend voor alle MTB is dat ze magnetosomes, die intracellulaire, membraangebonden magnetische nanokristallen van magnetiet (Fe 3 O 4) en / of greigite (Fe 3 S 4) of beide 3, 4 bevatten. In het noordelijk halfrond, zijn MTB meestal aangetrokken tot de zuidkant van een staafmagneet, terwijl in het zuidelijk halfrond zijn ze meestal aangetrokken tot het noordelijke uiteinde van een magneet 3,5. Deze eigenschap kan worden benut wanneer het proberen om MTB te isoleren van het milieu monsters.
Een van de meest voorkomende manieren om MTB verrijken is een doorzichtige plastic container gebruiken om sediment en water te halen uit een natuurlijke bron,zoals een zoetwater vijver. In het noordelijk halfrond is het zuiden van een staafmagneet geplaatst tegen de buitenzijde van de container net boven het bezinksel op de sediment-water interface. Na enige tijd kunnen de bacteriën worden verwijderd uit de binnenzijde van de houder nabij de magneet met een pipet en vervolgens verrijkt met een capillaire circuit 6 en een magneet. Zodra verrijkt, de bacteriën kan worden geplaatst op een microscoopglaasje met een opknoping neerzetten en geobserveerd in een lichtmicroscoop of afgezet op een koperen rooster en waargenomen met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).
Met deze methode kan geïsoleerd MTB microscopisch worden bestudeerd om kenmerken zoals zwemmen bepalen gedrag, type en aantal flagella, celmorfologie van de cellen, vorm van het magnetische kristallen aantal magnetosomes, aantal magnetosome ketens in elke cel, samenstelling nanomineral de kristallen en aanwezigheid van intracellulaire vacuolen.
Protocol
1. MTB Collection
- Bij de beslissing over een zoetwater site om magnetotactic bacteriën verzamelen (MTB), is het vaak het beste om te beginnen met een vijver of langzaam bewegende stroom die een zachte modderige sediment laag heeft. In deze demonstratie haalden we een monster aan de rand van de Olentangy River op de campus van de Ohio State University (OSU) in Columbus, Ohio (VS). Dit was een gunstige locatie voor onze demonstratie, het hier beschreven protocol is van toepassing op alle in het water levende locatie. De gebruikte materialen in dit protocol is te vinden in tabel 1. Een plek met de diepte van het water tussen 10 en 100 cm. Op een dergelijke locatie, moet u het verzamelen van de bovenste laag van de meeste sediment met behulp van een heldere, schroef-top container. Schep het sediment en water in de houder totdat deze is gevuld met een derde tot de helft sediment en de resterende hoeveelheid water. Houd de container onder water totdat deze gevuld is met water en daarna stevig klap op de vuurpijl de container wet de schroefdop. Het is niet nodig om te mengen het sediment. Wrijf de buitenkant van de container droog met een handdoek en dan het monster naar het laboratorium. Het is niet nodig om de sample terug haasten naar uw laboratorium. We hebben gelaten MTB monsters in plastic containers in het veld voor enkele dagen voordat ze terug te brengen naar ons laboratorium. De MTB levensvatbaar moeten gedurende enkele weken tot maanden zijn, zolang je de monsters op een koele, schaduwrijke plaats in het veld.
- Zodra het monster zich in uw laboratorium, draai de dop en laat het voor de container om de hoeveelheid verdamping te verminderen. Sla de container bij kamertemperatuur in een donkere kamer, lade of volledig bedekken van de houder met aluminiumfolie. Laat het bezinksel en fijne deeltjes volledig naar de bodem van de container regelen waarbij het monster ongestoord enkele uren tot enkele dagen. Het is niet nodig om het sediment te mengen, MTB voorkeur een ongestoorde omgeving. De heldere wanden van de plastic containerzal u toelaten om te bevestigen dat de deeltjes zich hebben gevestigd op de bodem. Afhankelijk van uw monster, kan MTB leven blijven in de steekproef voor vele maanden.
2. MTB Isolatie
- Wanneer u klaar bent om de MTB, plaats magneten isoleren op de zijkanten van de plastic container ongeveer 1 cm boven het sediment-water interface (Figuur 1A). Pas het sediment in de bodem van de container verstoren. Plaats de zuidpool van een staafmagneet aan een zijde van de container en de noordzijde van een staafmagneet aan de andere zijde (Figuur 1A). Bijna elke magneet kan worden gebruikt, zoals een magnetische roerstaaf of grote ijskastmagneet. Alles kan worden gebruikt om de magneten steunen op de juiste hoogte boven het sediment-water interface. We hebben gevonden dat de magneten rust op de bovenkant van een kartonnen of plastic doos best echter de magneten kan ook worden geplakt aan de buitenzijde van de plastic container. Wacht 30 minuten tot enkeleuur voor de bacteriën om te zwemmen naar de magneet.
- Gebruik een steriele pipet om het water zorgvuldig verzamelen van in de container (Figuur 1A) in de buurt van de positie van het zuid-pool staafmagneet (voor monsters die genomen op het noordelijk halfrond). Dit water bevat de MTB die zijn aangetrokken tot de zuid-pool staafmagneet. Vervolgens moet een capillaire circuit worden gebruikt om verder verrijken MTB.
3. MTB Racetrack
- Om uw steekproef te verrijken met magnetotactic bacteriën, een capillaire circuit nodig is (figuur 1B en 1C). Deze moeten voorafgaand aan het isoleren van de cellen van de heldere plastic container.
- Gebruik een 5,75 inch (146 mm) glas Pasteur pipet aan op een circuit te maken. Gebruik een diamant pen of bestand te snijden de bovenkant van de pipet, de lengte van de pipet is niet essentieel, maar het moet kunnen ongeveer 1-2 ml water bevatten. Vervolgens gebruikt u een bunsenbrander aan de punt smelten, zodatwordt gesloten (figuur 1C). De resulterende tube moet een open einde en een gesloten einde.
- Maak een aantal van deze circuits en vervolgens autoclaaf. Daarnaast moet u katoen en een aantal lange metalen naalden autoclaveren.
- Voeg monster gefiltreerd water, vanuit nabij het sediment water interface die getoond in Figuur 1A een autoclaaf circuit met een lange metalen naald bevestigd aan een gefilterde spuit. De poriegrootte van het filter 0,22 mm om vuil en verontreinigingen uit het water verwijderd worden. Het is belangrijk om er absoluut zeker van dat er geen luchtbellen in het glas capillair.
- Steek de onderkant van het circuit met steriele katoenen (Figuur 1B). Het metalen naald katoen stoten naar het afgedichte uiteinde van het circuit dus is 0,5 - 1 cm afstand van het gesloten uiteinde (Figuur 1C).
- Met behulp van een steriele pipet, voeg de MTB-bevattende water (uit sectie 2.2) om de sample reservoir (open einde) van een voorbereide MTB circuit (Figuur 1B).
4. MTB Verrijking
- Zodra het circuit is gevuld met monstervloeistof, leg het op zijn kant op een horizontaal oppervlak (bijvoorbeeld een benchtop) en plaats de zuidpool van een staafmagneet (op het noordelijk halfrond) naast de verzegelde punt van het circuit (figuur 1B en 1C).
- Wacht 5 tot 30 min voor de MTB om te migreren door het katoen. Dan moet je het verzamelen van de vloeistof bij de punt van het circuit. Te lang wachten kunnen introduceren verontreinigingen, zoals andere beweeglijke bacteriën, de punt van de capillair. Optioneel kunt u gebruik maken van een lichtmicroscoop naar de punt van het circuit bekijken en de MTB te halen bij de punt van de circuit's te kijken. Dit zal u toelaten om te bepalen hoe lang het de MTB om te migreren door de katoenen prop neemt.
- Voorzichtig gebruik maken van de diamant mes om een krasje in de buurt katoenen plug te maken en uit te schakelen snap het einde van het circuit. <li> Een 1 ml spuit met een smalle naald (25 of 27 gauge) aan het fluïdum uit de punt van het circuit. Deze vloeistof monster moet bevatten nu de verrijkte MTB.
5. MTB Observatie met lichtmicroscopie
- Breng een druppel (10-20 pi) van de verrijkte MTB monster op een dekglaasje aan.
- Snel draai de dekglaasje om zodat de druppel is nu naar beneden en opknoping van het dekglaasje.
- Plaats het dekglaasje op een o-ring die rust op een glasplaatje. De o-ring moet een iets kleinere diameter dan het dekglaasje (ongeveer 1 cm, figuur 2).
- Plaats deze opknoping vallen op een lichtmicroscoop podium en richten op een rand van de druppel. Een droge 60X objectief werkt goed omdat de meeste een hoge numerieke apertuur (NA, bijvoorbeeld 0,93) maar vereisen olie, die moeilijk te gebruiken voor de opknoping neerzetten (figuur 2).
- Plaats de zuidkant van een staafmagneet in de buurt van de opknoping dROP en MTB beginnen te migreren naar de rand van de druppel dichtst bij de magneet (figuur 3). Binnen enkele minuten vele MTB moet aan de rand van de druppel (figuur 3). Bewijs jezelf dat de bacteriën zijn magnetisch door het omkeren van de polen van de magneet en dan houden aan de bacteriën zwemmen in de tegenovergestelde richting.
6. MTB Observatie door Transmissie Elektronen Microscopie (TEM)
- Breng een druppel (~ 20 pi) van de verrijkte MTB op een koperen rooster en laat de bacteriën na gedurende 10 min.
- Wick overtollige water met een stuk schone filtreerpapier.
- Eventueel kan het rooster negatief gekleurd met 2% uranylacetaat, 2% fosfowolfraamzuur pH 7,2, of 2,5% natriummolybdaat 7, 8, 9. Dit wordt gedaan door de koperen rooster op een druppel vlek onmiddellijk na incuberen het raster met verrijkte MTB. Incubeer het raster met negatieve vlek, de tijden variëren afhankelijk van de stain gebruikt en vervolgens lont uit de vloeistof met een stuk schone filtreerpapier.
- Let op de MTB met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, figuur 4). Voor de hier beschreven werkzaamheden MTB werden geadsorbeerd aan Formvar gestabiliseerd en koolstof gecoate 200 mesh koperen roosters (Ted Pella # 01800). De roosters werden met het koolstofatoom omlaag op een druppel celsuspensie gedurende 10 min, daarna direct gewassen een keer door het plaatsen van het rooster op een druppel water gedurende 30 sec. Voor het kleuren werden de roosters op een daling van 2% uranylacetaat (Ted Pella # 19481) gedurende 30 seconden tot 5 minuten en vervolgens gedroogd volledig met een stukje filtreerpapier. De roosters werden geanalyseerd door TEM met behulp van een FEI Tecnai Geest op 80kV of een FEI Tecnai F20 met behulp van hoge hoek ringvormige donker veld STEM op 200kV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een magneet is een effectief instrument dat gebruikt kan worden om magnetotactic bacteriën (MTB) in milieumonsters (Figuur 1A) isoleren. Een capillaire circuit (Figuur 1B) gebruikt de magnetische eigenschappen van MTB aan te trekken door een prop katoen waar ze kunnen worden gescheiden van niet-magnetotactic micro-organismen ook opgenomen in de milieumonster.
Figuur 1. Een doorzichtige plastic fles met daarin een sediment en water monster genomen uit de Olentangy River in Columbus, Ohio (VS). Het flesje bevat ongeveer de helft sediment en de helft water. De zuidkant van een magneet geplaatst ongeveer 1 cm boven het sediment tot enkele uren (A). Na verwijderen van een deel van de vloeistof uit de buurt van de magneet op de in de houder wordt geplaatst in een capillair racetrack waar de MTB zwem door een prop katoen (pijl) naar het zuiden einde van een staafmagneet (B). Een close-up van de capillaire circuit met de sample, katoen, gefiltreerde vloeistof, gesloten uiteinde van het capillair en zuidkant van een staafmagneet (C).
Figuur 2. Nadat de MTB zijn verrijkt uit het circuit kan een kleine druppel worden op een dekglaasje, die vervolgens ondersteboven gedraaid en geplaatst op een o-ring die rust op een dia. Deze slide-o-ring-dekglaasje sandwich kan worden geplaatst op een lichtmicroscoop podium en bekeken met een 60X objectief droge (oil lenzen zijn lastig te gebruiken met een opknoping druppel).
Figuur 3. Heldere veld microscoop beeld van MTB zwemmen (dunnelange pijlen) en het verzamelen van aan de rand van de opknoping druppel (korte pijlen), die naast de zuidpool van een staafmagneet.
Figuur 4. Transmissie electronen microscoop beeld van een enkele magnetotactic bacterie verrijkt vanuit milieu sediment monster. De morfologie van de cel (spirillen) en magnetosomes zijn duidelijk zichtbaar met een flagellum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Magnetotactic bacteriën zijn niet noodzakelijkerwijs in elke aquatisch milieu op 8 maar wanneer ze dat doen komen, ze zijn te vinden in de orde van 100 - 1.000 cellen per milliliter 2. Met het oog op de MTB met behulp van optische microscopie te observeren, moet u ongeveer 50 bacteriën / ml in uw monster 8. Als er geen of weinig MTB in je steekproef, dan zul je ofwel moet een nieuwe milieu-site selecteren om uw monsters te verzamelen of moet u een of meer van de technieken besproken in de volgende paragraaf te proberen.
Ten eerste, moet u proberen het verzamelen van meer sediment uit de omgeving met behulp van een grote plastic kuip 8. Dit is vooral handig als grote aantallen kweekbare MTB nodig zijn. Afhankelijk van de omgeving monster, kan het niet mogelijk MTB monsters met een concentratie van 50 bacteriën / ml onmiddellijk na het verzamelen van het monster te isoleren. Daarom, wanneer u uw milieu-monster terug naar de laboratory, kan het nuttig zijn om te wachten op het monster aan laboratoriumomstandigheden acclimatiseren voordat u de MTB met een staafmagneet isoleren. Dit acclimatiseringsperiode zal de bacteriële gemeenschap om te rijpen en bevolken de cultuur leidt tot hogere concentraties van MTB. Een andere eenvoudige techniek dat vaak meer geconcentreerd MTB monsters de staafmagneet laten aan de zijde van de monsterhouder (Figuur 1A) voor een langere tijd (bijvoorbeeld, enkele dagen). Dit moet het mogelijk maken de MTB meer tijd om te migreren naar de magneet. Een laatste techniek die nuttig kunnen zijn, worden meerdere circuits (Figuur 1B) tegelijkertijd worden gebruikt en de MTB van elk circuit combineren in een monster. Als je denkt dat er een probleem is met een circuit of als er te veel verontreinigende micro-organismen (dwz niet-MTB) in uw verrijkt monster, kunt u het circuit onder een lichtmicroscoop op de MTB te observeren terwijl ze zwemmen door de katoen plug en in de tip. Dit zal u toelaten om te bepalen of besmetting van micro-organismen worden ook komen door de katoenen prop en wanneer naar het verrijkingsproces te stoppen.
We moeten vermelden dat er meer geavanceerde manieren om MTB te isoleren, maar deze methoden vereisen het gebruik van meer gespecialiseerde apparatuur. Een voorbeeld omvat het gebruik van een magneetspoel, in plaats van een staafmagneet, en aangepaste glas vaartuigen MTB isoleren van zoetwater sedimenten 10, 11. De hier beschreven protocol is een goedkope en effectieve werkwijze voor het bepalen of een milieu ter MTB bevat. Deze isolatie en verrijking protocol is eenvoudig genoeg dat microbiology studenten gemakkelijk kan beheersen en "afstemmen" zodat hogere opbrengsten van MTB kan worden bereikt. Nadat de MTB zijn geïsoleerd, andere analyses zoals fluorescentie in situ hybridisatie, 16S rRNA sequentie voor door analyse energie-dispersieve spectroscopie (EDS), TEM, optische microscopieen magnetische metingen kunnen worden uitgevoerd op de MTB 12, 13, 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Amerikaanse National Science Foundation (EAR-0920299 en EAR-0745808); Amerikaanse National Science Foundation Oost-Aziatische en Pacifische zomer instituten, de Geological Society of America Research Grant Program en de Alumni Subsidies voor Graduate Research en Scholarship van de Ohio State University. We willen graag naar de redacteur en twee anonieme reviewers voor hun inzichtelijke commentaar bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides | Fisher Scientific | S95933 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| O-ring | Hardware store | ||
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bar magnet | Fisher Scientific | S95957 | |
| Container | Any | Any plastic or glass container that can hold at least 0.5 L and can be sealed | |
| Cotton | Any | ||
| Microscope with 60X dry lens | Zeiss | A 60X dry lens is not absolutely necessary, but this gives a high NA without using oil | |
| Diamond pen | Fisher Scientific | 08-675 | |
| 0.22 mm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9788564 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Formvar/Carbon 200 mesh, copper grids | Ted Pella Inc. | 01800 | |
| Uranyl acetate | Ted Pella Inc. | 19481 | |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | ||
| Tecnai F20 S/TEM | FEI |
References
- Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190, 377-379 (1975).
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).
- Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).
- Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria. Science. 334, 1720-1723 (2011).
- Simmons, S. L., Bazylinski, D. A., et al. South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere. Science. 311, 371-374 (2006).
- Wolfe, R., Thauer, R., et al. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Letters. 45, 31-35 (1987).
- Rodgers, F. G., Blakemore, R. P. Intercellular structure in a many-celled magnetotactic prokaryote. Archives of Microbiology. 154, 18-22 (1990).
- Moench, T. T., Konetzka, W., et al. A novel method for the isolation and study of a magnetotactic bacterium. Archives of Microbiology. 119, 203-212 (1978).
- Balkwill, D., Maratea, D. Ultrastructure of a magnetotactic spirillum. Journal of Bacteriology. 141, 1399-1408 (1980).
- Lins, U., Freitas, F., et al. Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms. Brazilian Journal of Microbiology. 34, 111-116 (2003).
- Jogler, C., Lin, W., et al. Toward Cloning of the Magnetotactic Metagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3972-3979 (2009).
- Lin, W., Li, J., et al. Newly Isolated but Uncultivated Magnetotactic Bacterium of the Phylum Nitrospirae from Beijing, China. Applied and Environmental Microbiology. 78, 668-675 (2012).
- Li, J., Pan, Y., et al. Biomineralization, crystallography and magnetic properties of bullet-shaped magnetite magnetosomes in giant rod magnetotactic bacteria. Earth and Planetary Science Letters. 293, 368-376 (2010).
- Oestreicher, Z., Valerde-Tercedor, C. Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy. Micron. 43, 1331-1335 (2012).
