Summary
Vi viser en fremgangsmåde til at indsamle magnetotactic bakterier (MTB), der kan anvendes til naturlige vande. MTB kan isoleres og beriget fra sedimentprøver under anvendelse af en relativt enkel opsætning, der udnytter bakteriernes naturlige magnetisme. Isoleret MTB kan derefter blive undersøgt nærmere ved hjælp af både lys-og elektronmikroskopi.
Abstract
Magnetotactic bakterier (MTB) er akvatiske mikroorganismer, der først blev især beskrevet i 1975 1 fra sedimentprøver indsamlet på strandengene i Massachusetts (USA). Siden da MTB er blevet opdaget i lagdelt vand-og sediment-kolonner fra hele verden 2. Ét fælles træk for alle MTB er, at de indeholder magnetosomes, som er intracellulære, membranbundne magnetiske nanokrystaller af magnetit (Fe 3 O 4) og / eller greigite (Fe 3 S 4) eller begge dele 3, 4. På den nordlige halvkugle, er MTB typisk tiltrukket af den sydlige ende af en stangmagnet, mens der i den sydlige halvkugle, de er som regel tiltrukket af den nordlige ende af en magnet 3,5. Denne egenskab kan udnyttes, når de forsøger at isolere MTB fra miljøprøver.
En af de mest almindelige måder at berige MTB er at anvende en klar plast beholder til opsamling af sediment og vand fra en naturlig kilde,såsom en ferskvand dam. På den nordlige halvkugle, er den sydlige del af en stangmagnet anbragt mod ydersiden af beholderen lige over sedimentet i sediment-vand-grænsefladen. Efter nogen tid kan bakterierne fjernes fra indersiden af beholderen nær magneten med en pipette og derpå beriget yderligere ved anvendelse af en kapillær racerbane 6 og en magnet. Når beriget, bakterierne kan placeres på et objektglas under anvendelse af en hængende dråbe fremgangsmåde og observeret i et lysmikroskop eller afsættes på et kobbernet og observeret under anvendelse transmissionselektronmikroskopi (TEM).
Under anvendelse af denne fremgangsmåde kan isoleret MTB undersøges mikroskopisk for at bestemme egenskaber såsom svømning adfærd, arten og antallet af flageller, cellemorfologi af cellerne, formen af de magnetiske krystaller, antal magnetosomes, antal magnetosome kæder i hver celle, sammensætning af De nanomineral krystaller, og tilstedeværelse af intracellulære vakuoler.
Protocol
1. MTB Collection
- Når der træffes beslutning om en ferskvands websted til at indsamle magnetotactic bakterier (MTB), er det ofte bedst at starte med en dam eller langsom strøm, der har en blød mudret sedimentlag. I denne demonstration har vi samlet en prøve på kanten af Olentangy River på campus af The Ohio State University (OSU) i Columbus, Ohio (USA). Mens dette var en bekvem placering til vores demonstration, protokollen beskrevet her er gældende for alle akvatiske sted. Materialer i denne protokol kan findes i tabel 1. Finde et sted, hvor vanddybden ligger mellem 10 og 100 cm. På sådan et sted, skal du samle den øverste mest lag af sediment ved hjælp af en klar, skrue-top container. Score sediment og vand ind i beholderen, indtil det er fyldt med en tredjedel til halvdelen sediment og det resterende volumen med vand. Hold beholderen neddykket, indtil det er fyldt med vand og derefter tæt låg på beholderen wed sin skrue-top låg. Det er ikke nødvendigt at blande sedimentet. Tør ydersiden af beholderen tørt med et håndklæde og derefter tage prøven til laboratoriet. Det er ikke nødvendigt at haste prøven tilbage til dit laboratorium. Vi har forladt MTB prøver i plastbeholdere på området i flere dage før at bringe dem tilbage til vores laboratorium. Det MTB skal være rentabelt for flere uger til måneder, så længe du opbevare prøverne i et køligt, skyggefuldt sted i marken.
- Når prøven er i laboratoriet, løsne hætten og lade det dækker beholderen for at reducere mængden af fordampning. Opbevares i beholderen ved stuetemperatur i et mørkt rum, skuffe eller fuldstændigt dækker beholderen med aluminiumsfolie. Tillader sediment og fine partikler til fuldstændig sedimentere til bunden af beholderen ved at lade prøven uforstyrret i adskillige timer til adskillige dage. Det er ikke nødvendigt at blande sedimentet, MTB foretrækker en uforstyrret miljø. De klare vægge plastbeholderenvil give dig mulighed for at bekræfte, at partiklerne har løst til bunden. Afhængig af din prøve, kan MTB forblive i live i prøven i mange måneder.
2. MTB Isolation
- Når man er klar til at isolere MTB, placere magneter på siderne af plastbeholderen 1 cm over sediment-vand grænsefladen (figur 1A). Vær omhyggelig med ikke at forstyrre sedimentet i bunden af beholderen. Anbring sydpolen af en stangmagnet på den ene side af beholderen og den nordlige side af en anden stangmagnet på den modsatte side (fig. 1A). Næsten alle magnet kan anvendes, såsom en magnetisk omrørerstav eller stort køleskab magnet. Alt kan anvendes til at støtte magneterne i den korrekte højde over sedimentet-vand-grænsefladen. Vi har konstateret, hviler magneterne på toppen af en pap eller plastic boks er bedst kan imidlertid magneterne også tapes til ydersiden af plastbeholderen. Vent 30 min til fleretimer for bakterierne at svømme til magneten.
- Brug en steril pipette til omhyggeligt opsamle vandet fra inde i beholderen (figur 1A) nær positionen for den syd-pol bar magnet (for prøver indsamlet i den nordlige halvkugle). Dette vand skal indeholde MTB, som er blevet tiltrukket af syd-pol stangmagnet. Derefter vil en kapillær racerbane anvendes til yderligere at berige MTB.
3. MTB Racetrack
- For at berige din prøve med magnetotactic bakterier, en kapillær racerbane er nødvendig (figur 1B og 1C). Disse skal gøres forud for isolering af cellerne fra klar plastbeholder.
- Brug en 5,75 tommer (146 mm) glas Pasteur pipette at gøre en racerbane. Anvende en diamant pen eller en fil til at afskære toppen af pipetten, længden af pipetten er ikke afgørende, men det bør være i stand til at indeholde omkring 1-2 ml vand. Dernæst anvendes en bunsenbrænder til at smelte spidsen, således atbliver forseglet (figur 1C). Den resulterende pipette bør have en åben ende og en lukket ende.
- Gøre flere af disse baner og dernæst autoklaveres. Derudover vil du nødt til at autoklavere bomuld og flere lange metal nåle.
- Tilføj filtrerede prøve vand, opsamlet fra nær sediment vand-grænsefladen vist i figur 1A, på en autoklaveret racerbane med en lang metalnål fæstnet til en filtreret sprøjte. Porestørrelsen af filteret skal være 0,22 mm for at fjerne snavs og forureninger fra vandet. Det er vigtigt at være helt sikker på, at der ikke er nogen luftbobler i glaskapillar.
- Sæt bunden af banen med steril bomuld (figur 1B). Brug metalnål til at skubbe bomuld mod den lukkede ende af banen, så det er 0,5 til 1 cm væk fra den forseglede spids (figur 1C).
- Ved hjælp af en steril pipette, MTB-holdige vand (fra afsnit 2,2) tilsættes til prøven reservoir (åben ende) af en fremstillet MTB racerbane (figur 1B).
4. MTB Enrichment
- Når racerbanen er fyldt med prøvevæske, lægge den på sin side på en vandret flade (eksempelvis et benchtop) og placere den sydlige pol af en stangmagnet (på den nordlige halvkugle) ved siden af den forseglede spidsen af racerbanen (figur 1B og 1C).
- Vent 5 til 30 min for MTB at migrere gennem bomuld. Så skal du opsamle væsken nær spidsen af racerbanen. Venter for længe, kan indføre kontaminanter, såsom andre mobile bakterier, til spidsen af kapillaret. Du kan vælge at bruge et lysmikroskop for at se spidsen af racerbanen og se MTB samle på væddeløbsbanen tip. Dette vil give dig mulighed for at bestemme, hvor lang tid det tager MTB at migrere gennem vatprop.
- Forsigtigt bruge diamant kniv til at lave en lille ridse nær vatprop og bræk i slutningen af racerbanen. <li> Brug en 1 ml sprøjte med en smal kanyle (25 eller 27 gauge) for at fjerne væsken fra spidsen af racerbanen. Denne væskeprøve skal nu indeholde den berigede MTB.
5. MTB Observation ved lysmikroskopi
- Placer en dråbe (10-20 pi) af det berigede MTB prøve på et dækglas.
- Hurtigt vende dækglasset over så drop nu vender nedad, og hængende fra dækglasset.
- Placere dækglasset på en o-ring, der hviler på et objektglas. O-ringen bør have en lidt mindre diameter derefter dækglasset (ca. 1 cm, figur 2).
- Placere denne hængende dråbe på et lysmikroskop fase og fokusere på en kant af dråben. En 60X tør mål virker meget godt, fordi de fleste har en høj numerisk apertur (NA, fx 0,93) men kræver ikke olie, som er vanskelig at bruge til hængende dråbe-fremgangsmåden (figur 2).
- Placer den sydlige ende af en stangmagnet tæt på hængende dROP og MTB vil begynde at migrere mod kanten af dråben tættest på magneten (fig. 3). Inden for få minutter mange MTB bør være på kanten af dråben (figur 3). Bevis for dig selv, at bakterierne er magnetisk ved at vende stangen af magneten og derefter observere bakterier svømme i den modsatte retning.
6. MTB Observation af Transmission Electron Microscopy (TEM)
- Anbring en dråbe (~ 20 ul) af det berigede MTB på et kobbernet og tillade bakterierne at bundfælde i 10 min.
- Væge overskydende vand med et stykke rent filterpapir.
- Eventuelt kan nettet blive negativt farvet med 2% uranylacetat, 2% phosphortungstensyre, pH 7,2, eller 2,5% natriummolybdat 7, 8, 9. Dette gøres ved at placere kobbernet på en dråbe plet umiddelbart efter inkubation af gitteret med den berigede MTB. Inkuber gitteret med den negative pletten, vil variere afhængigt af stain anvendes, og derefter suges fra fluidet med et stykke rent filterpapir.
- Observere MTB hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM, figur 4). For arbejdet her beskrevne MTB blev adsorberet til Formvar stabiliseret og carbon overtrukne 200 mesh kobber net (Ted Pella # 01.800). Gitrene blev anbragt med det carbonatom nedad på en dråbe af cellesuspensionen i op til 10 min, derefter straks vasket en gang ved at placere risten på en dråbe vand i 30 sek. Til farvning blev nettene anbragt på en dråbe 2% uranylacetat (Ted Pella # 19481) i 30 sek til 5 min og tørres derefter fuldstændigt med et stykke filtrerpapir. Nettene blev analyseret ved TEM anvendelse af enten en FEI Tecnai Spirit på 80kV eller en FEI Tecnai F20 hjælp af høj vinkel ringformede mørke felt STEM på 200kV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En magnet er et effektivt værktøj, som kan anvendes til at isolere magnetotactic bakterier (MTB) indeholdt i miljøprøver (figur 1A). En kapillær racerbane (figur 1 B) anvender de magnetiske egenskaber af MTB at tiltrække dem gennem en bomuldsprop, hvor de kan adskilles fra ikke-magnetotactic mikroorganismer også indeholdt i miljøprøven.
Fig. 1. En klar plastflaske indeholdende et sediment og vand udtaget fra Olentangy River i Columbus, Ohio (USA). Glasset indeholder omtrent halvdelen sediment og halvdelen vand. Den sydlige ende af en magnet placeres omtrent 1 cm over sedimentet i op til flere timer (A). Efter fjernelse af noget af fluidet fra nær magneten på indersiden i beholderen, anbringes inde i et kapillar racetrack hvor MTB svømme gennem en vatprop (pil) mod den sydlige ende af en stangmagnet (B). En tæt op betragtning af den kapillære racerbanen viser prøven, bomuld, filtreret fluid, forseglet ende af kapillarrøret og sydlige ende af en stangmagnet (C).
Figur 2. Når MTB er blevet beriget fra banen, kan en lille dråbe kan anbringes på et dækglas, som derefter vendt på hovedet og anbragt på en o-ring, der hviler på et objektglas. Dette dias-o-ring-dækglas sandwich kan placeres på et lysmikroskop scene og ses ved hjælp af en 60X tør mål (olie linser er ubekvemme at bruge med en hængende dråbe).
Figur 3. Bright felt mikroskop billede af MTB svømning (tyndlange pile) og indsamling på kanten af den hængende dråbe (korte pile), der ligger ved siden af sydpolen af en stangmagnet.
Figur 4. Transmissionselektronmikroskop billede af en enkelt magnetotactic bakterie beriget fra et miljømæssigt sedimentprøve. Morfologien af cellen (spirillum) og magnetosomes er klart synlig sammen med en enkelt flagel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Magnetotactic bakterier ikke nødvendigvis findes i alle vandmiljøet 8, men når de finder sted, kan de findes i størrelsesordenen 100 - 1000 celler per milliliter 2. For at observere MTB ved optisk mikroskopi, skal du cirka 50 bakterier / ml i din prøve 8. Hvis der ikke er eller kun få MTB i din prøve, så vil du enten nødt til at vælge en ny miljømæssig websted for at hente dine prøver eller du bliver nødt til at prøve et eller flere af de teknikker diskuteres i næste afsnit.
Først bør du prøve at indsamle mere sediment fra miljøet ved hjælp af et stort plastbæger 8. Dette er især nyttigt, hvis et stort antal unculturable MTB er nødvendige. Afhængigt af miljø-prøve, kan det ikke være muligt at isolere MTB prøver med en koncentration på 50 bakterier / ml umiddelbart efter opsamling af prøven. Derfor, når du bringer din miljøprøve tilbage til lagiveres oplæg og præsentationer, kan det være fordelagtigt at vente på prøven at akklimatisere til laboratoriebetingelser før de forsøger at isolere MTB med en stangmagnet. Denne akklimatiseringsperiode vil tillade det bakterielle fællesskab at modne og genbefolke kulturen fører til højere koncentrationer af MTB. En anden simpel teknik, der ofte producerer mere koncentrerede MTB prøver er at forlade stangmagnet på siden af prøvebeholderen (figur 1A) i en længere tidsperiode (f.eks flere dage). Dette skulle gøre det muligt MTB mere tid til at migrere til magneten. Et sidste teknik, der kan være nyttig, er at anvende flere baner (figur 1B) på en gang og derefter kombinere MTB fra hver racerbane i en prøve. Hvis du mener, der er et problem med en racerbane, eller hvis der er for mange kontaminerende mikroorganismer (dvs. ikke-MTB) i din beriget prøve, kan du placere racerbanen under et lysmikroskop at observere MTB da de svømmer igennem bomuld PLUg og ind i spidsen. Dette vil give dig mulighed for at afgøre, om forurenende mikroorganismer også kommer igennem bomuld stik og hvornår de skal stoppe berigningsprocessen.
Det bør nævnes, at der er mere avancerede måder at isolere MTB, men disse metoder kræver anvendelse af mere specialiserede udstyr. Et eksempel involverer anvendelse af en magnetisk spole i stedet for en stangmagnet, og tilpassede glaskar at isolere MTB fra ferskvand sedimenter 10, 11. Protokollen beskrevet her repræsenterer en prisbillig og effektiv fremgangsmåde til bestemmelse af, om en miljømæssig side indeholder MTB. Denne isolation og berigelse protokollen er enkle nok, at mikrobiologi studerende kan beherske og let "fin-tune", således at højere udbytter af MTB kan opnås. Når MTB er blevet isoleret, andre analyser, såsom fluorescens in situ hybridisering, rRNA 16S sekventering for samfundet analyse, energidispersiv spektroskopi (EDS), TEM, optisk mikroskopiog magnetiske målinger kan udføres på MTB 12, 13, 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den amerikanske National Science Foundation (EAR-0.920.299 og EAR-0.745.808), US National Science Foundation East Asien og Stillehavsområdet Summer Institutes, Geologisk Society of America Research Grant Program og Alumni Tilskud til Graduate Research og Scholarship fra The Ohio State University. Vi vil gerne takke redaktøren og to anonyme korrekturlæsere for deres indsigtsfulde kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides | Fisher Scientific | S95933 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| O-ring | Hardware store | ||
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bar magnet | Fisher Scientific | S95957 | |
| Container | Any | Any plastic or glass container that can hold at least 0.5 L and can be sealed | |
| Cotton | Any | ||
| Microscope with 60X dry lens | Zeiss | A 60X dry lens is not absolutely necessary, but this gives a high NA without using oil | |
| Diamond pen | Fisher Scientific | 08-675 | |
| 0.22 mm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9788564 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Formvar/Carbon 200 mesh, copper grids | Ted Pella Inc. | 01800 | |
| Uranyl acetate | Ted Pella Inc. | 19481 | |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | ||
| Tecnai F20 S/TEM | FEI |
References
- Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190, 377-379 (1975).
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).
- Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).
- Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria. Science. 334, 1720-1723 (2011).
- Simmons, S. L., Bazylinski, D. A., et al. South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere. Science. 311, 371-374 (2006).
- Wolfe, R., Thauer, R., et al. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Letters. 45, 31-35 (1987).
- Rodgers, F. G., Blakemore, R. P. Intercellular structure in a many-celled magnetotactic prokaryote. Archives of Microbiology. 154, 18-22 (1990).
- Moench, T. T., Konetzka, W., et al. A novel method for the isolation and study of a magnetotactic bacterium. Archives of Microbiology. 119, 203-212 (1978).
- Balkwill, D., Maratea, D. Ultrastructure of a magnetotactic spirillum. Journal of Bacteriology. 141, 1399-1408 (1980).
- Lins, U., Freitas, F., et al. Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms. Brazilian Journal of Microbiology. 34, 111-116 (2003).
- Jogler, C., Lin, W., et al. Toward Cloning of the Magnetotactic Metagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3972-3979 (2009).
- Lin, W., Li, J., et al. Newly Isolated but Uncultivated Magnetotactic Bacterium of the Phylum Nitrospirae from Beijing, China. Applied and Environmental Microbiology. 78, 668-675 (2012).
- Li, J., Pan, Y., et al. Biomineralization, crystallography and magnetic properties of bullet-shaped magnetite magnetosomes in giant rod magnetotactic bacteria. Earth and Planetary Science Letters. 293, 368-376 (2010).
- Oestreicher, Z., Valerde-Tercedor, C. Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy. Micron. 43, 1331-1335 (2012).
