Summary
우리는 자연 물에 적용 할 수있는 magnetotactic 박테리아 (MTB)를 수집하는 방법을 보여줍니다. MTB는 고립과 박테리아의 자연 자기의 활용 비교적 간단한 설정을 사용하여 침전 샘플 풍부하게 할 수 있습니다. 절연 MTB 그런 다음 빛과 전자 현미경를 사용하여 자세하게 검토 할 수 있습니다.
Abstract
Magnetotactic 균 (MTB)는 첫째 특히 메사추세츠 (USA)의 염 습지에서 수집 침전 샘플 1975 1에서 설명 된 수중 미생물 있습니다. 이후 MTB는 모두 세계 2 이상에서 층상 물과 침전물-열에서 발견되었습니다. 모든 MTB에 일반적인 기능들은 세포, 막 바인딩 된 자성 자철광의 nanocrystals (철 3 O 4) 및 / 또는 greigite (철 3 S 4) 또는 두 가지 모두 3 4아르 magnetosomes를 포함한다는 것입니다. 남반구에서 사람들은 보통 자석 3,5의 북쪽 끝 부분에 매력을하는 동안 북반구에서는 MTB는 일반적으로, 바 자석의 남쪽 끝 부분에 매력을 수 있습니다. 환경 샘플에서 MTB를 분리 할 때이 속성을 악용 할 수 있습니다.
MTB를 풍성하게하는 가장 일반적인 방법 중 하나는, 천연 소스에서 침전물과 물을 수집하기 위해 투명한 플라스틱 용기를 사용하는 것입니다담수 연못 등. 북반구에서는, 바 자석의 남쪽 끝 단지 침전물 물 인터페이스에서 침전물 위의 컨테이너의 외부에 대한 배치됩니다. 약간의 시간 후, 박테리아는 피펫으로 자석 근처에있는 컨테이너의 내부에서 제거 할 수 있습니다 다음 모세관 경주 6 자석을 사용하여 더 값진 경험을했습니다. 일단, 풍부한 박테리아는 매달려 드롭 방법을 사용하여 현미경 슬라이드에 배치 할 수 있으며 가벼운 현미경에서 관찰 또는 구리 그리드에 입금 및 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용하여 관찰했다.
이 방법 사용 절연 MTB는 미세 또한 수영과 같은 특성을 결정하기 위해 연구 될 수 세포, 자기 결정의 모양, magnetosomes 수, 각 셀에 magnetosome 체인의 수의 구성의 flagella, 세포 형태학의 행동 유형과 번호 nanomineral 결정하고, 세포 내 액포의 존재.
Protocol
1. MTB 수집
- magnetotactic 박테리아를 수집 할 수있는 담수 사이트 (MTB)에 결정할 때, 그것은 종종 부드러운 진흙 퇴적물 층이있는 연못 또는 느리게 이동 스트림로 시작하는 것이 좋습니다. 이 예제에서 우리는 콜럼버스에있는 오하이오 주립 대학 (OSU), 오하이오 (USA)의 캠퍼스에있는 Olentangy 강의 가장자리에 샘플을 수집했습니다. 이 우리의 데모의 편리한 위치에있을 때, 여기에 설명 된 프로토콜은 수중 위치에 적용됩니다. 이 프로토콜에 사용 된 자료는 표 1에서 찾을 수 있습니다. 물 깊이는 10 100cm 사이의 위치를 찾습니다. 같은 장소에서, 당신은 침전 명확한, 스크류 탑 컨테이너를 사용하는 페이지의 상단에있는 레이어를 수집해야합니다. 이 한 절반 삼분의 침전 물과 남은 볼륨이 가득 될 때까지 컨테이너에 침전물과 물을 퍼내다. 이 물이 가득 될 때까지 잠수 용기를 보관하고 단단히 컨테이너 w를 쏠i 번째의 나사 상단 뚜껑. 이 침전물을 혼합 할 필요가 없습니다. 수건으로 건조 용기의 외부를 닦아 다음 실험실에 표본을 채취하시면됩니다. 당신의 실험실로 샘플을 서두를 필요가 없습니다. 우리는 우리의 실험실로 돌아 오는 전에 몇 일 동안 현장에서 플라스틱 용기에 MTB 샘플을 그만 뒀어요. 이 분야에서 시원하고 그늘진 곳에서 샘플을 저장으로 MTB은 오래 같이 개월 몇 주 동안 가능한 있어야합니다.
- 샘플은 실험실에되면, 뚜껑을 느슨하게하고 증발의 양을 줄일 수있는 용기를 덮고 두십시오. 어두운 방, 서랍에서 실온에서 컨테이너를 저장하거나 완전히 알루미늄 호일로 용기를 다룹니다. 퇴적물과 고급 입자가 완전히 몇 일 몇 시간 동안 방해받지 샘플을 출발하여 컨테이너의 하단에 정착 할 수 있도록 허용합니다. 그것은 퇴적물을 혼합 할 필요가 없습니다, MTB는 그대로 환경을 선호합니다. 플라스틱 용기의 명확한 벽이 입자가 아래로 정착했는지 확인 할 수 있습니다. 샘플에 따라 MTB는 많은 달 동안 샘플에서 살아 남아있을 수 있습니다.
2. MTB 절연
- 이 약 1cm 침전물 물 인터페이스 (그림 1A) 위의 플라스틱 용기의 측면에있는 MTB, 장소 자석을 분리 할 준비가되면. 용기의 바닥에있는 퇴적물을 방해하지 않도록주의하십시오. 반대편 (그림 1A)에서 컨테이너와 다른 바 자석의 북쪽의 한쪽면에 바 자석의 남극를 놓습니다. 거의 모든 자석은 이러한 자기 저어 바 또는 대형 냉장고 자석으로 사용하실 수 있습니다. 아무거나는 침전물 물 인터페이스 위에 올바른 높이에서 자석을 지원하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 골판지 또는 플라스틱 상자의 상단에있는 자석을 쉬고 것이 가장 그러나, 자석은 또한 플라스틱 용기의 외부에 붙어 될 수 것으로 나타났습니다. 여러에 30 분을 기다려야박테리아 시간은 자석으로 수영합니다.
- 주의 남쪽 극 바 자석 (북반구에 수집 된 샘플의 경우)의 위치 근처의 컨테이너 (그림 1A) 내부에서 물을 수집하기 위해 멸균 피펫을 사용합니다. 이 물은 남쪽 극 바 자석에 매료 된 MTB를 포함해야합니다. 다음, 모세관 경주가 더욱 MTB을 풍요롭게하는 데 사용되어야합니다.
3. MTB의 경마장
- magnetotactic 박테리아와 샘플을 풍요롭게하기 위해, 모세관 경마장이 (인물 1B와 1C)가 필요합니다. 다음은 일반 플라스틱 용기에서 세포를 분리하기 전에 변경해야합니다.
- 경마장을 만들기 위해 5.75 인치 (146mm) 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 피펫의 상단을 잘라 다이아몬드 펜이나 파일을 사용 피펫의 길이는 중요하지 않습니다,하지만 물을 약 1-2 ML를 포함 할 수 있습니다. 다음 팁을 녹기 분젠 버너를 사용하는 때문에는 (그림 1C) 밀봉된다. 그 결과 피펫은 오픈 엔드 및 봉인 끝이 있어야합니다.
- 이 racetracks 여러 후 압력솥을 만듭니다. 또한면 여러 긴 금속 바늘을 압력솥해야합니다.
- 필터링 주사기에 부착 된 긴 금속 바늘을 사용하여 autoclaved 경기장으로 그림 1A에 도시 된 침전물 물 인터페이스 근처에서 수집 한 필터링 샘플 물을, 추가 할 수 있습니다. 필터의 기공 크기가 물에서 파편과 오염 물질을 제거하기 위해 0.22 mm해야합니다. 이 모세관 유리에 기포가 없는지 철저하게 확인하는 것이 중요합니다.
- 멸균면 (그림 1B)와 레이스 트랙의 하단을 연결합니다. 거리에 밀봉 된 팁 (그림 1C)에서 1cm -이게 0.5입니다 있도록 경마장의 밀봉 된 끝 부분에 솜을 밀어 금속 바늘을 사용합니다.
- 멸균 피펫 사용하여 샘플에 MTB 함유 물을 (섹션 2.2에서) 추가 연구준비된 MTB의 경주 (그림 1B)의 eservoir (오픈 엔드).
4. MTB 농축
- 경마장은 샘플 액체로 가득되면, 수평 표면에 옆으로 쏟아 붓는 (예를 들어, benchtop) 및 경마장의 봉인 팁 (인물 1B 옆에 (북반구에서) 바 자석의 남쪽 기둥을 배치 와 1C).
- 면을 통해 마이그레이션 할 수있는 MTB 기준 5 ~ 30 분 정도 기다립니다. 그런 다음 경마장의 끝 근처의 유체를 수집해야합니다. 너무 오래 기다리는 것은 모세관의 끝을하는 다른 운동성 세균 등 오염 물질을, 소개 할 수 있습니다. 선택적으로, 당신은 경주의 끝을 확인하고 MTB는 경마장의 끝에서 수집 볼 가벼운 현미경을 사용할 수 있습니다. 이 당신이면 플러그를 통해 마이그레이션 할 수있는 MTB 소요 시간을 결정 할 수 있습니다.
- 부드럽게면 플러그 근처의 작은 흠집을 만들어 경마장의 끝을 스냅하는 다이아몬드 칼을 사용합니다. <리> 경마장의 끝에서 유체를 제거하는 좁은 바늘 (25 또는 27 게이지)가 1 ML의 주사기를 사용합니다. 이 액체 샘플은 현재 강화 MTB를 포함해야합니다.
5. 가벼운 현미경에 의한 MTB 전망대
- coverslip 위에 강화 MTB 샘플의 드롭 (10-20 μl)를 배치합니다.
- 그렇게 빨리 드롭이 현재 줄어들고 직면하고 coverslip에 달려있다 위에 coverslip을 뒤집기.
- 유리 슬라이드에 휴식하는 O-링에 coverslip를 놓습니다. O-링는 약간 작은 직경 coverslip을 (; 그림 2 약 1 cm)이 있어야합니다.
- 가벼운 현미경 단계에이 매달려 드롭을 배치하고 드롭 중 하나를 가장자리에 초점을 맞 춥니 다. 하지만 매달려 드롭 방식 (그림 2)을 사용하기 어려운 오일을 필요로하지 않는다 가장 높은 수치 조리개 값 (예를 들어, 0.93 NA)를 가지고 있기 때문에 60X 건조 목적은 잘 작동합니다.
- 매달려 D에 바 자석 가까이의 남쪽 끝을 배치ROP와 MTB는 자석 (그림 3)에 가장 가까운 드롭의 가장자리으로 마이그레이션하기 시작합니다. 몇 분 이내에 많은 MTB는 드롭의 가장자리 (그림 3)에 있어야합니다. 박테리아가 자석의 극을 반대로하여 자기 것을 이룬 후 박테리아가 반대 방향에서 수영 관찰합니다.
6. 전송 전자 현미경 (TEM)에 의한 MTB 관측
- 구리 그리드로 강화 MTB의 드롭 (~ 20 μl)을 놓고 박테리아가 10 분 동안 해결 할 수 있습니다.
- 깨끗한 필터 종이를 초과 물을 위크.
- 선택적으로, 그리드에 부정적인 2 % uranyl 아세테이트, 2% phosphotungstic 산성 산도 7.2, 또는 2.5 %의 나트륨 molybdate 7, 8, 9 물들 할 수 있습니다. 이것은 즉시 강화 MTB와 격자를 잠복기 후 얼룩 한 방울에 구리 그리드를 배치하여 이루어집니다. 부정적인 얼룩으로 격자를 길러, 시간은 세인트에 따라 달라집니다아니야!는 사용 후 깨끗한 필터 종이와 유체를 등심.
- 전송 전자 현미경 (TEM, 그림 4)를 사용하여 MTB를 관찰. 일이 여기에 설명 된 내용은 MTB는 Formvar 안정화와 탄소 코팅 200 메쉬의 구리 격자 (테드 펠라 # 01800)에 adsorbed되었습니다. 격자는 최대 10 분까지에 세포 현탁액의 드롭 탄소 측에 아래로 배치 된 후 즉시 30 초에 물 한 방울에 격자를 배치하여 한 번 씻어. 착색를 들어, 격자는 초는 5 분, 30에 2 % uranyl 아세트산 (테드 펠라 # 19481)의 드롭 위치하고 완전히 필터 종이를 사용하여 건조 하였다. 격자는 TEM은 200kV에서 높은 각도 환형 암시 줄기를 사용하여 80kV 또는 페이 Tecnai F20에 두 페이 Tecnai 정신을 사용하여 분석 하였다.
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Representative Results
자석은 환경 샘플 (그림 1A)에 포함 된 magnetotactic 세균 (MTB)를 분리하는 데 사용할 수있는 효과적인 도구입니다. 모세관 경마장 (그림 1B)은 그들이 또한 환경 시료 내에 포함 된 비 magnetotactic 미생물에서 분리 될 수있는면 플러그인을 통해 유치를 MTB의 자기 속성을 사용합니다.
그림 1. 침전와 물 샘플을 포함하는 투명한 플라스틱 병 콜럼버스, 오하이오 (USA)의 Olentangy 강에서 수집. 병은 약 1 반 침전 한 반 물을 포함하고 있습니다. 자석의 남쪽 끝 (A) 몇 시간 동안 침전 위의 약 1cm를 배치하고 있습니다. 컨테이너 내부에 자석 근처에서 유체의 일부를 제거 후, 모세관 R의 내부 배치됩니다acetrack있는 바 자석 (B)의 남쪽 끝 부분면 플러그 (화살표)을 통해 MTB 수영. ,면을 샘플을 보여 모세관 경마장의 전망을 최대 가까이, 필터링 유체의 모세관 튜브 및 막대 자석 (C)의 남쪽 끝의 봉인 끝.
MTB는 경마장에서 풍부하게 한 후 그림 2., 작은 드롭 그런 다음 거꾸로 뒤집힌와 슬라이드에 휴식하는 O-링에 삽입되는 coverslip에 배치 할 수 있습니다. 이 슬라이드-O-링 coverslip 샌드위치는 가벼운 현미경 단계에 위치하며 60X 건조 목표를 (석유 렌즈가 매달려 드롭을 사용하기 불편한 아르)를 사용하여 볼 수 있습니다.
그림 3. MTB 수영의 밝은 필드 현미경 이미지 (얇은긴 화살표)와 바 자석의 남극 옆에있는 매달려 드롭 (짧은 화살표)의 가장자리에 모여.
그림 4. 환경 침전 샘플에서 농축 한 magnetotactic의 세균의 전송 전자 현미경 이미지입니다. 셀 (나선균)과 magnetosomes의 형태는 단일 편모와 함께 명확하게 볼 수 있습니다.
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Discussion
Magnetotactic 박테리아는 반드시 모든 수생 환경 8 찾을 수 없습니다하지만이 발생 할 때, 100의 순서에서 찾을 수 있습니다 - 밀리리터이 1000 셀. 광학 현미경을 사용하여 MTB를 관찰하기 위해, 당신은 약 50 균 / 샘플 8 ML이 필요합니다. 샘플에 또는 몇 MTB가없는 경우, 당신은 이걸 샘플을 수집하거나 다음 섹션에서 설명하는 기술 중 하나 이상을 시도해야합니다 새로운 환경 사이트를 선택해야합니다.
첫째, 큰 플라스틱 욕조 8을 사용 환경에서 더 많은 퇴적물을 수집하려고합니다. unculturable MTB 많은 수의이 필요한 경우이 특히 유용합니다. 환경 시료에 따라서는 즉시 샘플을 수집 한 후 50 세균 / ML의 농도를 갖는 MTB 샘플을 분리 할 수없는 경우가 있습니다. 따라서 LA로 다시 환경 샘플을했을 때boratory, 그것은 바 자석을 사용하여 MTB를 분리하기 전에 실험실 조건에 순응하는 샘플이 나올 때까지 기다리는 것이 좋을 것입니다. 이 acclimation 기간은 박테리아 커뮤니티 MTB 높은 농도로 이어지는 문화를 성숙하고 repopulate 할 수 있습니다. 더 자주 집중 MTB 샘플을 생산하고 또 다른 간단한 기술은 오랜 기간 (예를 들어, 몇 일)에 대한 샘플 컨테이너 (그림 1A)의 측면에 막대 자석을 떠날 것입니다. 이 자석으로 마이그레이션 할 수있는 더 많은 MTB 시간을 허용해야합니다. 마지막으로이 기술은 유용 할 수 있습니다, 하나 샘플로 각 경마장에서 MTB를 조합 한 번에 여러 racetracks을 (그림 1B)를 사용하는 것입니다. 당신은 경마장과 나 풍부한 샘플에 너무 많은 오염 미생물 (즉, 비 MTB)가있는 경우, 당신은 사람들이면 plu을 통해 수영로 MTB를 관찰 할 수있는 빛 현미경으로 경주를 배치 할 수있는 문제가되었다고 판단되는 경우g 및 팁에. 이 오염 미생물도면 플러그를 통해 올 때와 농축 프로세스를 중지하는 경우가 결정 할 수 있습니다.
우리는 MTB를 분리하는보다 정교한 방법이 있다는 것을 언급해야하지만, 이러한 방법은보다 전문적인 장비의 사용을 필요로합니다. 하나의 예는 담수 퇴적물 10, 11 일부터 MTB를 분리 할 수있는 자기 코일의 사용, 대신 바 자석, 및 사용자 정의 유리 선박을 포함한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 환경 사이트가 MTB를 포함 여부를 결정 저렴하고 효과적인 방법을 나타냅니다. 이 절연 및 농축 프로토콜은 미생물학 학생들이 MTB보다 높은 수익률을 달성 할 수 있도록 "미세 조정"쉽게 습득 할 수있는 충분한 간단합니다. MTB는 분리 한 후, 이러한 형광에 원위치 하이브리드 화 등의 분석, 16는 지역 사회 분석, 에너지 흩어지는 분광법 (EDS), TEM, 광학 현미경에 대한 시퀀싱 rRNA및 자기 측정 MTB 12, 13, 14 일에 실시 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
미국 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 동아시아 및 태평양 서머 연구소; 미국 연구 기금 프로그램의 지질 사회와 대학원 연구 장학금 졸업생 교부금이 작품은 미국 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (EAR-0920299 및 EAR-0745808)의 보조금에 의해 지원되었다 오하이오 주립 대학에서. 우리는 자신의 통찰력 덧글에 대한 편집기와 두 개의 익명 리뷰어 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides | Fisher Scientific | S95933 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| O-ring | Hardware store | ||
| Cover slips | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bar magnet | Fisher Scientific | S95957 | |
| Container | Any | Any plastic or glass container that can hold at least 0.5 L and can be sealed | |
| Cotton | Any | ||
| Microscope with 60X dry lens | Zeiss | A 60X dry lens is not absolutely necessary, but this gives a high NA without using oil | |
| Diamond pen | Fisher Scientific | 08-675 | |
| 0.22 mm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9788564 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Formvar/Carbon 200 mesh, copper grids | Ted Pella Inc. | 01800 | |
| Uranyl acetate | Ted Pella Inc. | 19481 | |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | ||
| Tecnai F20 S/TEM | FEI |
References
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