Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Intakt Histologisk Karakterisering af Brain-implanterede Microdevices og det omgivende væv

Published: February 11, 2013 doi: 10.3791/50126
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, 2Department of Biological Sciences, Purdue University

Summary

Her præsenterer vi en histologisk metode til optagelse, mærkning, optisk clearing, og billeddannelse den intakte hjerne vævsgrænseflade omkring kronisk implanterede microdevices i hjernevæv hos gnavere. Resultater fra de teknikker, der omfatter denne fremgangsmåde er nyttig til forståelse af virkningen af ​​forskellige gennemtrængende hjerne-implantater på det omgivende væv.

Abstract

Forskning i design og anvendelse af hjerne-implanterede microdevices, såsom mikroelektrode arrays, har til formål at producere klinisk relevante enheder, som interface kronisk med omgivende hjernevæv. Væv, der omgiver disse implantater menes at reagere på tilstedeværelsen af ​​enhederne over tid, som omfatter dannelsen af ​​et isolerende "glial ar" omkring enhederne. Imidlertid er histologisk analyse af disse væv ændringer typisk udført efter eksplantation indretningen, i en proces, der kan forstyrre morfologien af ​​vævet af interesse.

Her viser vi en protokol, hvor kortikale-implanterede enheder samles intakt i omkringliggende hjernevæv hos gnavere. Vi beskriver hvordan, når perfunderet med fiksativ er hjerner fjernet og skåret på en sådan måde, at eksplanteres enheder. Vi skitserer fluorescerende antistof mærkning og optiske clearing metoder er anvendelige til fremstilling af en informativ, men tyk vævsektion. Endelig vi demonstrerer montering og billeddannelse af disse vævssnit med henblik på at undersøge den biologiske grænseflade omkring hjerne-implanterede enheder.

Introduction

Feltet af neuroprosthetic forskning har til formål at hjælpe personer, der lider af forskellige handicap og lidelser ved at omgå syge eller beskadigede strukturer i kroppen gennem CNS interfacing enheder 1,2. Brain-implanterede microdevices, såsom mikroelektrode arrays (MEA), kan bruges til at optage eller stimulere hjernens strukturer, og dermed åbne mulighed for etablering af langsigtede grænseflader mellem elektronik og CNS-væv 3-5. Penetrerende multilaterale miljøaftaler bør udstyr, der drives ind i hjernevævet, holde særligt løfterige som tovejs grænseflader på grund af den tætte nærhed, inden for hvilken de præsenterer elektroder til en relativt lille sæt af nærliggende neuroner 6.

Imidlertid komplekse væv reaktioner skyldes langvarig implantation af gennemtrængende MEA'er, hvilket ofte resulterer i variable og gradvis nedbrydning elektrofysiologiske signal-til-støj-forhold over dage til måneder, og en stigning i elektrisk impedansmelse mellem elektrodeholdere sites og jord 7,8. De formodede oprindelsen af disse ændringer omfatter aktivering af mikroglia, reaktiv astrocytose langs microdevices, og et tab eller migrering af neuroner fra vævet omkring at implanterede enheder 9-11. En stor udfordring at forstå disse væv ændringer omkring kroniske, indtrængning MEA'er er vanskeligheden ved at erobre histologiske data af intakte vævsgrænsefladen omgiver kronisk implanterede enheder 12. Histologisk analyse af væv med enheden / vævsgrænsefladen stadig til stede ville forbedre den aktuelle enhed-fjernelse histologiske protokoller. Med en uforstyrret enhed tilbage i vævet, kan den biologiske virkning af relativt små interaktioner, såsom anvendelsen af biokompatible belægninger 13,14 eller den elektriske clearing af elektrodeoverfladen 15,16, afbildes og analyseres med hensyn til implantatet.

Hførend vi demonstrere en metode til at indsamle, behandle og image den intakte microdevice interface for detaljeret mikroskopi-baseret analyse af det omgivende hjernevæv. Ved denne fremgangsmåde er enheden og omgivende hjernevæv opsamlet i en tyk (> 250 um) vævssnit under anvendelse af en vibratome. At forbedre histologisk label indtrængen i disse tykke skiver, er fluorescerende histokemiske og immunhistokemisk etiketter anvendes i store koncentrationer i opløsninger indeholdende blokerende serum og detergent til flere dage. En optisk clearing opløsning anvendes til at forbedre mikroskopi billeddannelse dybder, og vævet er monteret i 2-sidede kamre til efterfølgende laserscanning konfokal mikroskopi 17. At indfange hele histologiske grænseflade, er en computerstyret translationel fase anvendes under billedbehandling til at indsamle z-stack panoramaer langs længden af ​​implantaterne. Foruden billeddannelse anvendte væv etiketter, indsamling laser reflektans tilbage fra implantaterog transmission lys gennem vævet både hjælpe lokalisere indretningen grænseflade i forhold til omgivende væv. Væv fremstillet ved anvendelse af dette "Device-Capture Histologi" (DCHist) protokol giver imaging adgang til morfologisk bevarede væv / enhed interaktioner, og dermed forbedrer på tidligere device-fjernelse histologiske protokoller 18.

Protocol

Løsninger

Phosphatbufret saltvand (PBS) - i g / l, 9 g NaCl, 0,144 g KH 2 PO 4, 0,795 g Na 2 HPO 4, ved pH 7,4

4% formaldehyd - i ml / l, 202 ml dibasisk natriumphosphat-opløsning (0,4 M Na 2 HPO 4), 48 ml monobasisk natriumphosphat-opløsning (0,4 M NaH 2 PO4), 500 ml 8% formaldehydopløsning, 250 ml Milli- Q DDI vand, ved pH 7,4

Hepes-pufret Hanks saltopløsning med natriumazid (HBHS) - i g / l, 7,5 g NaCI, 0,3 g KCI, 0,06 g KH 2 PO 4, 0,13 g Na 2 HPO 4, 2 g glucose, 2,4 g HEPES, 0,05 g MgCI2 6 dele H2O, 0,05 g MgSO 4 7 dele H2O, 0,165 g CaCl2, 0,09 g NaN3 ved pH 7,4

Wash Solution (WS) - 1% vol / vol, Normal gedeserum, 0,3% Triton X-100, i HBHS med natriumazid (NaN3). Afkøles WS ved 4 ° C før anvendelse i efterfølgende trin.

U2 Sca l e Solution - 4 M urinstof, 30% glycerol og 0,1% Triton X-100 17

PROCEDURE

Alle forsøg blev udført under tilsyn af Purdue Animal Care og brug Udvalg og Laboratory Animal Program på Purdue University.

1. Kirurgi

  1. Forskellige aseptiske kirurgiske metoder er forenelige med præsenteret histologisk metode. Anvendelse af en stereotaktisk ramme og automatiserede inserters anbefales at forbedre reproducerbarhed og kontrol af mikroelektrode-arrays (MEA) implantation vinkel i forhold til stereotaksisk planer.

Bemærk: I denne demonstration vores kirurgiske metode er som følger: Hold gnaver emne i stereotaksisk earbars while under isofluran bedøvelse (mellem 1-3%) båret af medicinsk kvalitet ilt. Test for manglen på en tå-klemme afspejler i rotte eller manglen på en hale pinch refleks hos mus for at bekræfte, at dyret er fuldstændigt bedøvet. Påfør øjensalve og rengør det kirurgiske sted med tre alternerende vask af Betadine og ethanol. Vask hænder, Dawn kirurgiske handsker, hårnet, ansigtsmaske og kjole. Indsprøjtes en bolus af lidocain at dulme det kirurgiske område, skal du oprette et snit med en saks eller en skalpel, klar periosteum med knogle skraber og bomuld applikatorer, og skabe en kraniotomi ved hjælp af en tandlægebor håndstykke og bor. Drive en enkelt-skaft MEA til cortex under anvendelse af en mikromanipulator. Har en kirurgisk assistent støtte i at bevare aseptiske kirurgi forhold og dokumentere afviklingen af ​​operationen.

  1. Efter implantation af MEA i hjernen, billeder indsamle gennem et kirurgisk mikroskop for at informere den eventuelle fjernelse af skallen fra hele bregn. Implanterede dele af enheder vil blive bevaret in situ.

Bemærkning: En eventuel samling af væv med in situ indretninger er afhængig af nøje matcher planet af enhedens insertion med planet for vævssektionering. Detaljerede noter om enheden insertion plan i forhold til hjernen, er således meget vigtig.

  1. Efter enheden implantation, anvende silikoneelastomer Kwik-Sil (WPI), omkring det udsatte MEA shanks eller kabler, og lad hærde. Et steriliseret plaststykke, såsom et snit pipettespids, kan anvendes til at indeholde siliconeelastomer i en lille brønd omkring kraniotomi under hærdning.
  2. Påfør et lag af todelt dental akryl ("Jet Liquid" og "Jet Powder" fra Lang Dental) over Kwik-Sil og det udsatte kranium.

Bemærk: I et senere trin vil headcap smeltes ved at tillade implantatet skal separeresfra kraniet. UV-hærdende acryl bør undgås over Kwik-Sil og kraniotomi, da dette meget hårdt acryl er vanskelige at fjerne senere. Visuelt uigennemsigtige materialer omkring implantatet bør også undgås, klare Kwik-Sil indeholder en visning af implantatet under de efterfølgende trin i denne protokol.

  1. Udfør postoperativ pleje procedurer som pr lokal protokol af de dyrevelfærdsmæssige bestemmelser, og vende tilbage ambulante patienter til single-huse bur-bokse.

2. Perfusion og Tissue Collection

Bemærk: Se Gage et al. for en detaljeret perfusion procedure gennemgang i rotte-dyremodellen 19.

  1. Brug anæstesi og perfusion protokol godkendes af institutionens dyrepleje og brug udvalg. Efter dybt bedøve gnaveren (bekræftet ved mangel på tå-pinch refleks hos rotter eller hale-klemme refleks hos mus) og eksponering af hjertet, at lavvandede saks snit itil venstre ventrikel og højre atrium. Indsætte en stump kanyle i den venstre ventrikel og levere room temp PBS. Levere i alt ~ 10 ml PBS med ~ 5 ml / min i mus og ~ 200 ml PBS ved ~ 100 ml / min i rotter. Kig efter blodclearance fra leveren under.
  2. Injicer histologisk relevante kemiske etiketter transcardialt, om ønsket, ved at sprøjte levering med omhu for at undgå at indføre bobler.

Bemærk: Vaskulære etiketter (f.eks Dil) og nucleinsyre kontrastfarve farvestoffer (fx Hoechst 33342) er eksempler på kemiske etiketter leverbare under perfusion. Når det administreres ordentligt, bør disse histologiske markører mærke hele dyret 20.

  1. Lever pufret, stuetemperatur, 4% formaldehyd transcardialt at fiksere dyret. Undgå septumperforation tværs af hjertet, der kan dokumenteres ved lunge-næse afdræning i perfusion. Kig efter fiksering rystelser i de store musklerat indikere fuldstændig perfusion. Levere i alt ~ 10 ml fikseringsmiddel på ~ 5 ml / min i mus og ~ 200 ml fikseringsmiddel på ~ 100 ml / min i rotter.
  2. Efter perfusion, dyret halshugge, afsløre en del af hjernestammen eller cerebellum hjælp rongeurs eller sakse og sted hoved i 4% formaldehyd opløsning natten over ved 4 ° C.
  3. Vask hovedet i tre hold PBS med 1-4 timers intervaller mellem vaskninger.
  4. Opbevares faste hoveder i HBHS indeholdende natriumazid ved 4 ° C i dage til måneder.

3. Brain Fjernelse med in situ Devices

Bemærk: Udfør denne sektion i et stinkskab, mens iført passende personlige værnemidler. Undgå væv udtørring ved at returnere den faste hoved til HBHS løsning med jævne mellemrum.

  1. Forsigtigt dissekere væk huden og andre væv fra omkring acrylsyre kalot med pincet og små sakse.
  2. Mens iført varme-insensitive handsker, anvende en loddekolbe at fjerne dental acryl-og blotlægge et område af underliggende klare Kwik-Sil (figur 2a).

Bemærk: Målet med dette trin er at tillade mikrosakse en passende vinkel på adgang til positioner, hvor de implanterede indretninger ind i hjernen, således at hjerne-implanterede komponenter kan separeres fra komponenter fastgjort til kraniet.

  1. Under et kirurgisk mikroskop, skåret ind i silikone-elastomer med buede mikrosakse, fjernelse af små stykker Kwik-Sil med pincet ned til den position, hvor indretningerne ind i hjernen.
  2. Fortsætte med at skære langs overfladen af ​​kraniotomi med buede mikrosakse at adskille Dele, der er knyttet til polysilicium og kraniet fra komponenter implanteret i hjernen. Igen bruge mikroskop forstørrelse og stor omhu, når der skæres gennem de udsatte enhedens komponenter, idet man undgaar at skubbe eller trække implants i det faste væv.
  3. Fjern knogle omkring headcap med omhu ved hjælp rongeurs. Brug en spatel til at adskille hjernen med implanterede enheder fra kraniet. Opbevar hjernen i HBHS løsning indtil den er klar til at skære.
  4. Anbring hjernen i et glas petriskål fyldes med HBHS, og bruge et barberblad til at fjerne uvedkommende væv, såsom rygmarven, lillehjernen, eller lugtekolben, alt efter om de er relevante for placeringen af ​​indretningen implantation. Anvende en hjerne blok (Ted Pella) og barberblade afsnit hjernen og skabe et fladt plan ligger tæt op vinklen af ​​de implanterede indretninger, opnås dette ved at placere hjernen i en passende størrelse hjerne blok, orientering af hjernen, således at enhver synlige del af implantatet er parallel med barberblad guide, og placere et barberblad i knivføringen mindst 2 mm fra implantatet. Tryk på barberblade gennem vævet. Montere denne overflade til et vibratome platform. Alternativt, et barberblad monteret på en mikromanipulator kan anvendes i en tilsvarende styret måde som hjernen blok til at skabe et plan der ligger tæt op retningen af ​​implantatet.
  5. Placer is under den vibratome platform, og efter at der vævsoverfladen til kortvarigt at tørre på et stykke køkkenrulle, hjernen overholde en vibratome hjælp Super Glue. Lim den flade væv plan oprettet i forrige trin er på scenen. Med asymmetriske væv dimensioner. Orientere prøven, således at den bredeste dimension limes ned parallelt med bevægelsesretningen af ​​vibratome bladet for at undgå bladet potentielt banke væv over Efter limen sæt (~ 1-2 min), tilsættes afkølet (~ 4 ° C) PBS til vibratome skålen omkring vævet.
  6. Collect tykke vævssnit 200-400 um, herunder kontrol væv, når den maksimale vibrationshastighed (~ 100 Hz) og en langsom blad progression rate (<0,2 mm per sekund) med en bladvinkel på 10 ° fra horizontal. Collect skiver forsigtigt med en pensel eller scoop spatel og opbevares i HBHS i en plade med 24 brønde ved 4 ° C.
  7. Når in situ enheden er synlig for det blotte øje eller et kirurgisk mikroskop, indsamle tyndere sektioner at nærme indretningen i skive trin på 100 um eller mindre.

Bemærk: Typiske silicium mikro-implantater er synlige med det blotte øje i formaldehyd-fikseret gnaver cerebral cortex væv mellem 300 og 500 um fra anordningens overflade.

  1. Med in situ enheden nu tæt på overfladen af vævet, indsamle en> 250 um væv skive indeholdende enheden inden. Estimation af den nødvendige tykkelse kan blive hjulpet ved at referere tidligere indsamlede skiver.

Bemærk: Større enheder, multishank enheder og vinklede enheder kan kræve tykkere vævsskiver (> 500 um) at fange enheden i et væv stykke; remedlem at både udbredelsen af ​​anvendte etiketter og mikroskopi imaging dybde vil være begrænset i den endelige dataindsamling fra disse meget tykke skiver. Hvis det er muligt, undgå at slå enheden med vibratome klinge, da dette kan forårsage at trække af indretningen gennem vævet og morfologiske deformation.

4. Vævsbehandling og Clearing

  1. Vask skiver 3x på 5 min per vask i HBHS
  2. Inkuber i natriumborhydrid (5 mg NaBH4 / 1 ml HBHS) i 30 min total (15 min hver side af skive). Flip skiverne under anvendelse af en rustfri stål eller teflonbelagt mikro ske og lille pensel (Ted Pella). Langsomme og tankevækkende bevægelser forbedre resultaterne af hver skive flip. Undgå at berøre nogen områder omkring den implanterede enhed med børsten. Når det er muligt, tilføjer betydeligt mere opløsning end nødvendigt (> 2 ml) tillader en at manipulere og vende vævsskiver lettere.

Bemærk: Dette trin reducerer endogen autofluorescens, springe dette trin, hvis fluorescerende mærker blev anvendt under perfusion eller XFP transgene markører er til stede.

  1. Vask skiver 3x med 5 minutter per vask i vaskeopløsning ved stuetemperatur.

Bemærk: Agitation under vask og inkubation trin er valgfrit. Forfatterne spekulere, at subtile skurrende af den stive implantat i forhold til det omgivende hjernevæv kan forekomme under omrøring. Imidlertid kan en orbital mixer bevæger sig med en blid hastighed (<60 rpm) undgå dette og samtidig øge bevægelsen af ​​opløsninger.

  1. Blok i 2 timer i vaskeopløsning ved stuetemperatur (flip skiver efter en time).
  2. Inkuber i primære antistoffer (fortyndet i vaskeopløsning) i cirka 48 timer (24 timer på hver side af skiven) ved 4 ° C.
  3. Udfør 6 hurtige 3 min vaske med vaskeopløsning.
  4. Udfør 6, 1 time vaske (3 vaskes på hver side af vævet udsnit) i vaskeopløsning (opbevares ved 4 ° C, hvis vaskning natten over).
  5. Inkuber i sekundære antistoffer (fortyndet med vaskeopløsning) i cirka 48 timer (24 timer på hver side) i 4 ° C.
  6. Udfør 6 hurtige 3 min vaske med vaskeopløsning.
  7. Udfør 6, 1 time vaske (3 vaske på hver side) i vaskeopløsning, opbevares ved 4 ° C, hvis vask natten over.
  8. Fjern Vaskeopløsning og tilføje glycerol-baserede "U2 - Sca l e" clearing løsning. Tillad at fjerne cirka 1 uge for tykke skiver (250-500 um) eller 2-3 uger for meget tykke vævssnit (> 500 um) ved 4 ° C.
  9. Tildæk pladen med folie og opbevares ved 4 ° C.
  10. Monteres på objektglas imødekommende tykke vævssnit (figur 2b, 2c) under anvendelse af clearing opløsning som monteringsmedium og forsegling med klar neglelak. Opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys.

5. Panorama Imaging af Full Tissue og Device Interface

  1. Brug længere arbejdstid afstand mikroskop mål (> 2 mm), begynder billeddannelse med en laserscanning konfokal mikroskop eller 2-foton mikroskop. Vi vil demonstrere med et Zeiss LSM 710, Carl Zeiss "Zen" software (2010), og en computerstyret XY oversætte scene til billede en 3D panorama omkring et implantat.

Bemærk: Korrekt for brydningsindekset for clearing opløsning enten i software, ved hjælp af en korrigerende krave på målet, eller databehandling efter opsamling. I denne demonstration vi ind et brydningsindeks værdi for "U2" clearing opløsning af 1,4 til Leica Zen mikroskop software, denne indstilling subtilt justerer z-trins intervaller at tage højde for brydningsindeks mismatch.

  1. I væv i nærheden af ​​enheden, vurderer groft passende z-akse vindue og dataindsamling indstillinger i z-dimension for hver fluorescerende kanal ved hjælp af lav lasereffekt (~ 00,5 til 5%) og store z-trinstørrelser (> 25 um).

Bemærk: Medtag ekstra plads over og under ved indstilling af z-aksen, når du indstiller til panoramisk dataindsamling, da vævet ikke kan ligge helt fladt på objektglas (~ 20 pm hver retning).

  1. Sæt mål på xy centrum af eventuelt panorama, ved hjælp af Zen panorama software, bestemme antallet af indsamlingssteder stillinger kræves for hver akse (x og y) for at dække dit område af interesse.
  2. Revurdere og færdiggøre z-aksen samling vinduet.
  3. Manuel indstilling af detektorens følsomhed og lasereffekten at rampe hensigtsmæssigt med øget dybde, idet hensigten er typisk til at opretholde omtrent samme billedintensitet uanset imaging dybde ind i vævet skive, men også at undgå høj baggrundsstøj.
  4. Saml hver fluorescerende billede dataserier. Hvis det er nødvendigt for at undgå overlappende signaler, køre laserlinjens sekventielt.

Bemærk: Hvis det er tilgængeligt, skal du indstille softwaren til automatisk at gemme data til harddisken under indsamlingen.

  1. Skift softwareindstillingerne at indsamle "reflektans" og "transmittans" data, og bruge en længere, mere penetrerende bølgelængde laser (fx 633 nm) til at fange disse kanaler. Bestem den passende laser magt og detektor følsomhed for "refleksion" og "transmittans" indsamling og gentage den samme kollektion serie omkring den implanterede enhed.
  2. Eksportere data til senere behandling, kvantificering og analyse.

Representative Results

Hjerne-implanterede MEA'er kan opsamles i vævssnit ved først at separere eventuelle kraniet-monterede komponenter fra hjerne-indlejrede komponenter. Figur 2a viser resultaterne af at fjerne en side af en dentalcement headcap og en del af Kwik-Sil omgiver en MEA kabel på en rotte kranium. En loddekolbe blev anvendt til at fjerne dental cement og Kwik-Sil i et stinkskab. Kabelføringen og eventuelle ikke-implanterede MEA strukturer blev dernæst skåret med mikrosakse ved langsomt at grave gennem Kwik-Sil ned til overfladen af ​​det faste hjernen.

Efter udskæring, mærkning og rydde væv simple skræddersyede slides er nyttige til montering af tykke vævssnit (figur 2b). En monteret hjerne skive indeholdende en implanteret microdevice er vist i figur 2c. Imaging gennem hver side af slæden kan give dig mulighed for at vurdere grænsefladen omkring en enhed, som demonstreret i figur 3 (fig. 3a) og mikroglia langs elektrodestederne og spor er synlige på den anden side (fig. 3b).

Når monteret, kan væv afbildes under anvendelse af en XY-translation stage. Oversigter over fluorescerende mærker på tværs af hele vævssnit kan genereres ved den ønskede opløsning (fig. 4). En detaljeret gennemgang af morfologisk bevarede vævsgrænsefladen omkring implanterede microdevices kan indsamles under stor forstørrelse til analyse af det lokale væv respons (figur 5).

Figur 1
Figur 1. Oversigt over proceduren. (Ac) Brain mikro-implantat operationer er finaEgenproduktionen med et lag af Kwik-Sil polymer umiddelbart omgiver indretningen, efterfulgt af en acrylisk cement belægning. (D og e) Efter eutanasi er acryllag brændt væk, og kranie-monterede komponenter i enheden er adskilt fra implanterede komponenter ved at skære gennem silikoneelastomer. (F, g) hjernen fjernes derefter fra kraniet og er udskåret og monteret på vibratome fase. (HK) vævssnit opsamles, herunder et væv skive indeholdende indretningen. (L) Væv kan derefter behandles og monteres i brugerdefinerede kamre til detaljeret mikroskopi. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. (A) Ryd Kwik-Sil siliconeelastomer surrounding en elektrode-array-kabel (pil) er blevet eksponeret ved at brænde væk et vindue i dentalcement hætte på en perfuseret gnaver hoved med en loddekolbe. (B) at imødekomme billeddannelse til hver side af en tyk væv skive, simple "slide-kamre" kan fremstilles ved at skære et plastglideleje og vedhængende dækglas til hver side omkring vævet og monteringsløsning. (C) En rotte hjernevæv skive med intakt implantat (rød pil) er vist efter montering. Begge sider af vævet er hurtigt tilgængelige for mikroskopi billeddannelse med denne opsætning. For skala, er panelet (a) 25 mm på tværs i bunden, mens paneler (b, c) er 80 mm på tværs i bunden.

Figur 3
Fig. 3. Maksimal intensity z-projektioner af 40 um tykke billedstakke, indsamlet omkring bagsiden (a) og forreste (b) i en implanteret mikroelektrode array. Mikroglia (mærket med anti-Iba1 og Alexa Fluor 633, hvid) og laser lysrefleksion (rød), opsamlet fra overfladen af ​​indretningen, blev sekventielt afbildet fra begge sider af en 400 um tykt væv skive. Da hjernen implantater er ofte uigennemsigtig, montering med optisk adgang til begge sider giver en klar visning af mærkede vævsstrukturer "bag" implantatet i forhold til mikroskopobjektiv. Scale bar 50 pm.

Figur 4
Fig. 4. Et mærket DCHist skive afbildes under anvendelse af en computerstyret fase på en laserscanning konfokal mikroskop. (A) Cellekerner (farvet med Hoechst 33342) og (b) monocytter / microglia(Mærket med anti-Iba1) blev samtidigt afbildes på separate kanaler. (C) Transmission lys og reflektansen blev også opsamlet, der viser placeringen af den 4-ugers implantat med hensyn til Hoechst og Iba1 data. (D) overlejring af alle kanaler, men transmissioner er også vist. Den hvide firkant område er udvidet i de billeder, der vises til højre. Scale bar 1mm.

Figur 5
Figur 5. Ved hjælp af en computerstyret mikroskop fase og passende software, kan panoramiske billeddata blive indsamlet omkring implantatet. Reflektans (a) og transmittans (b) tillade lokalisering af indretningen, medens fluorescerende antistof eller kemiske etiketter (c, anti-Iba1 mærkning af mikroglia og macrophages) tillader detaljerede billeder af vævskomponenter langs intakt væv interface. Scale bar 200 pm.

Discussion

Den "Device-Capture Histologi" (DCHist) metoden vist her muliggør tætte histologisk vurdering af morfologisk bevarede interaktioner mellem hjernevæv og vævsimplantater. DCHist væv samling kræver omhyggelig adskillelse af skull-monteret enhed komponenter fra komponenter implanteret i hjernen. DCHist kræver også samling af en tyk histologisk væv skive (> 250 um). Disse vævssnit, når mærket, ryddet, monteret, og afbildes, kan give ny viden ind i implantation skade eller efterfølgende kronisk reaktion på katetre og lignende udstyr. Anvendelse af avancerede mikroskopi værktøjer, kan grænsefladen mellem vævs-og anordning afbildes og analyseres i høj detalje som vist i figur 3-5.

De præsenterede teknikker i deres nuværende form beror på evnen til langsomt at udgrave væk headcap fremstillet af todelte dentalcement og Kwik-Sil ned til det punkt af indretningen implantation.Udnytte dental cement, der kan brændes væk eller på anden måde fjernes og en klar silicium elastomer, hvorigennem en lille saks kan styres visuelt høj grad støtte en vellykket adskillelse af implanterede enhed fra dens kranium-monterede komponenter. Forsøg på at skære indretningen under kraniet og over hjernen for at indsamle det in situ anbefales ikke, som skallen monteret implantat vil blive trukket ud af hjernen en betydelig mængde.

Selv tyndere, mindre implantater som enlige skaft MEA'er fra NeuroNexus Technologies, der er mest modtagelige for DCHist, er de principper ikke begrænset til én enhed skafter eller mikroelektrode arrays. Indsamling og billeddiagnostiske strategier er bredt anvendelige til multi-skaft enheder og større implantater, såsom kanyler, med de krav er, at de skal være adskilt fra ethvert kraniet mount og indsamles inden en tyk vævssnit. Selv om forfatterne er fokuseret på analyse af vævomgivende corticale implantater, kan indretninger drives dybere ind i hjernen også indsamles og afbildes. Dybden af ​​implantatindsættelse bør ikke påvirke indfangning af implantatet i en skive, forudsat at enheden ikke afviger meget fra den kendte vinkel indsættelse.

Findes der begrænsninger til nyttig anvendelse af DCHist metoden. Brain vævssnittene er udfordrende at billedet gennem hundredvis af mikrometer, især i områder med hvid substans, selvom optiske clearing-løsninger i høj grad kan forbedre billeddannelse dybder i forskellige væv 21. For yderligere at forbedre billeddannelse dybde, kan to-foton excitation mikroskopi anvendes sammen med den optiske beskrevne clearing.

En anden potentiel begrænsning af den beskrevne fremgangsmåde kan være de specifikke fluorescerende immunhistokemi metoder og antistoffer anvendes af forskere. Passiv diffusion typisk driver inkorporering af disse markører ved hjælp af fikseret vævog på antigenbindingssteder. Afsluttende antistof arbejder Koncentrationen skal måles med forskere på en sag til sag for at maksimere label penetration samtidig undgå høje niveauer af baggrunden mærkning. Antistof mærkning bør ikke være variabel mellem skiver, der behandles ens, men forskellige antistoffer kan variere betydeligt i deres evne til at trænge ind og tagge deres antigen, med nogle antistoffer nemt mærkning antigener mange hundrede mikrometer dybe og andre mærkning antigener kun ti mikrometer dyb. Vi beskriver forbedre denne diffusion ved at anvende antistof etiketter ved højere end typiske koncentrationer, for flere dage efter påføring, og i en opløsning indeholdende fortyndet opvaskemiddel og blokering serum. Periodisk vende skiver fremmer også selv mærkning. Antigen hentning trin og alternative fiksering processer (f.eks glutaraldehyd, mikrobølgeovn, etc.) kan være passende for specifikke antigener. Sekundært antistof-fluorochrome konjugater kan også variere i deres præstationer mærkning tykke sektioner, selv om dette ikke er blevet overholdt af forfatterne anvender Alexa Fluor etiketter fra Invitrogen. Alternativt kan transgene dyr fag, der udtrykker fluorescerende proteiner i celletyper af interesse anvendes til at undgå problemer med antistof label penetration, da mange fluorescerende proteiner, såsom eGFP, deres fluorescens bevarer efter formaldehydbehandling, og kan være det samme visualiseres i vævssnit.

DCHist er en kraftfuld række teknikker til at indfange og analysere virkningerne af implanterede microdevices på hjernevæv. Kobling dette histologisk protokol med in vivo vurdering af elektrofysiologi kvalitet og elektrodeimpedans data 22 kunne i høj grad forbedre vores forståelse af de biologiske kilder til fysiologi variabilitet og nedbrydning. Feltet af implanterede neurale proteser især kan drage fordel af den detaljerede DCHist imaging af den intakte indretning / vævsgrænseflade at informere yderligere udvikling af biologisk neutrale MEA-enheder.

Disclosures

Forfatterne har ingen relevante oplysninger til at erklære, økonomisk eller på anden måde.

Acknowledgments

Alle forsøg blev udført under tilsyn af Purdue Animal Care og brug Udvalg og Laboratory Animal Program på Purdue University.

Dette arbejde blev støttet af Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Technology Office (MTO), under ledelse af Dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) som en del af de pålidelige Neural Technology Program, gennem Space og Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No N66001-11-1-4013.

Forfatterne vil gerne takke Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor, og Kevin Eliceiri for at dele deres mikroskopi ekspertise.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
H–chst 33342 Invitrogen 14533 DNA marker
Rabbit anti-Iba1 Wako (Japan) 019-19741 Monocyte antibody
Dental acrylic Lang Dental (various distributors) Jet Denture Repair Powder & Liquid Headcap construction
Kwik-Sil World Precision Instruments KWIK-SIL Covering exposed cranial implants
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121 Tissue processing
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ml Tissue processing
Urea Sigma-Aldrich U4883 Clearing solution
Glycerol Sigma-Aldrich G20225 Clearing solution
Equipment
Curved micro-scissors World Precision Instruments 14208 Cutting implant before removing brain
Razor blades Ted Pella (various sizes) For use with Brain Block
Acrylic Brain Matrice Ted Pella 15054 Brain Block to create initial plane in tissue
Plastic slides Ted Pella 260225 Mounting tissue
Cover glass Ted Pella (various sizes) Mounting tissue
Electrode arrays NeuroNexus Technologies (various designs) Example MEAs
Vibratome Leica VT1000 S Specific system used in presented method
Vibratome blades (various suppliers) Collecting slices
24-well plates (various suppliers) Storing and processing tissue slices
Confocal microscope with motorized XY-scanning stage Carl Zeiss Microscopy Zeiss LSM 710 and ’Zen 2010’ software Specific system used in presented method
Soldering iron (various suppliers) Excavating headcap

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schwartz, A. B. Cortical Neural Prosthetics. Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).
  2. Normann, R. A. Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system. Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).
  3. Rousche, P., Normann, R. A. Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex. Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).
  4. Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation. Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).
  5. Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors. Hearing Research. 210, 112-117 (2005).
  6. Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).
  7. Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).
  8. Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants. J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).
  9. Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).
  10. Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Research. 983, 23-35 (2003).
  11. McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. J. Neural Eng. 6, 056003 (2009).
  12. Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays. J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).
  13. Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes. J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).
  14. Wilks, S. Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation. Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).
  15. Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances. IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).
  16. Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes. IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).
  17. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).
  18. Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology. Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).
  19. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  20. Li, Y., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).
  21. Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).
  22. Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces. J. Vis. Exp. (60), e3566 (2012).

Tags

Neurobiologisk Neuroscience Biomedical Engineering Medicine Central Nervous System Brain neuroglia Neuroner Immunhistokemi (IHC) Histocytological Forberedelse Techniques Microscopy Confocal ikke-destruktiv prøvning bioteknik (mand-maskine-systemer) bionik histologi hjerne implantater mikroelektrode arrays immunhistokemi neuroprosthetics hjerne Machine Interface mikroskopi tykt væv optisk clearing dyr model
Intakt Histologisk Karakterisering af Brain-implanterede Microdevices og det omgivende væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woolley, A. J., Desai, H. A., Gaire, … More

Woolley, A. J., Desai, H. A., Gaire, J., Ready, A. L., Otto, K. J. Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue. J. Vis. Exp. (72), e50126, doi:10.3791/50126 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter