Summary
Här presenterar vi en histologisk metod för att fånga, märkning, optiskt rensa och bildhantering den intakta gränssnittet hjärnvävnad runt kroniskt implanterade Microdevices i hjärnvävnad hos gnagare. Resultat från de tekniker innefattande denna metod är användbar för att förstå effekterna av olika penetrerande brain-implantat på sin omgivande vävnad.
Abstract
Forskning om design och användning av hjärnan implanterade Microdevices som mikroelektrod arrayer, syftar till att framställa kliniskt relevanta enheter som gränssnitt kroniskt med omgivande hjärnvävnad. Vävnad som omger dessa implantat är tänkt att reagera på närvaron av anordningarna över tiden, vilket inkluderar bildandet av ett isolerande "glial ärr" runt anordningarna. Emellertid histologisk analys av dessa vävnadsförändringar vanligen utförs efter explantation anordningen, i en process som kan störa morfologin hos vävnaden av intresse.
Här visar vi ett protokoll där kortikala-implantat samlas intakta i omgivande vävnad gnagare hjärnan. Vi beskriver hur, när perfunderas med fixativ är hjärnor avlägsnades och skivades på ett sådant sätt att man undviker explantation enheter. Vi beskriva fluorescerande antikroppar märkning och optiska metoder clearing användbara för att producera en informativ, men tjock vävnadavsnitt. Slutligen visar vi montering och avbildning av dessa vävnadssnitt för att undersöka den biologiska gränssnitt runt hjärnan implanterade anordningar.
Introduction
Området neuroprosthetic forskning syftar till att hjälpa personer som lider av olika funktionshinder och sjukdomar genom att kringgå sjuka eller skadade strukturer i kroppen genom CNS gränssnitt enheter 1,2. Brain-implanterade Microdevices såsom mikroelektrod arrayer (MEA), kan användas för att spela in eller stimulera hjärnans strukturer, och därmed göra det möjligt att upprätta långsiktiga gränssnitt mellan elektronik och CNS-vävnad 3-5. Penetrerande multilaterala miljöavtal, enheter som drivs i hjärnvävnaden, håller särskilt löfte som bidirektionella gränssnitt på grund av närheten där de presenterar elektroderna till en relativt liten uppsättning av närliggande neuroner 6.
Emellertid komplexa vävnad svar resulterar från långvarig implantation av penetrerande MEA, resulterar ofta i variabla och gradvis förnedrande elektrofysiologiska signal-till-brusförhållanden under dagar till månader, och en ökning i elektrisk impedansning mellan elektroderna och jord 7,8. De förmodade ursprunget till dessa förändringar är aktivering av mikroglia, reaktiv astrocytos längs Microdevices, och en förlust eller migration av neuroner från den vävnad som omger till implanterade enheter 9-11. En stor utmaning att förstå dessa vävnadsförändringar runt kroniska, penetration MEA är svårigheten att fånga histologiska data intakt vävnadskontaktytan kring kroniskt implanterade enheter 12. Histologisk analys av vävnaden med enheten / vävnadsgränssnittet kvar skulle förbättra den nuvarande enhet-borttagning histologiska protokoll. Med en ostörd anordning kvar i vävnaden, kan den biologiska effekten av relativt subtila interaktioner, såsom utnyttjande av biokompatibla beläggningar 13,14 eller elektriska clearing av elektrodytan 15,16, avbildas och analyseras med avseende på implantatet.
Here visar vi en metod för att samla in, bearbeta och bild intakt mikroanordning gränssnittet för detaljerad mikroskopi-analys av den omgivande hjärnvävnaden. I denna metod enheten och omgivande hjärnvävnad in inom ett tjockt (> 250 nm) vävnadssnitt med hjälp av en vibratome. För att förbättra histologisk etikett inträngning i dessa tjocka skivor, är fluorescerande histokemiska och immunhistokemiska etiketter appliceras vid höga koncentrationer i lösningar innehållande blockerande serum och tvättmedel för flera dagar. En optisk clearing lösning används för att förbättra djup mikroskopi imaging, och vävnaden är monterad i 2-sidiga kammare för efterföljande laserskanning konfokal mikroskopi 17. För att fånga den fullständiga histologiska gränssnittet, är en datorstyrd translationell stadiet användes under avbildning för att samla z-stack panoramor längs implantat. Förutom avbildning används vävnad etiketter, samla laser reflektans tillbaka från implantatoch transmission ljus genom vävnaden både hjälp lokalisera enhetens gränssnitt i förhållande till omgivande vävnad. Vävnad med användning här "Device-Capture Histologi" (DCHist) protokollet ger avbildning tillgång till morfologiskt bevarade vävnad / enhet interaktioner och därmed förbättrar tidigare enhet-borttagning histologiska protokoll 18.
Protocol
Lösningar
Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) - ig / l, 9 g NaCl, 0,144 g KH 2 PO 4, 0,795 g Na 2 HPO 4, vid pH 7,4
4% Formaldehyd - i ml / l, 202 ml natriumfosfat dibasisk lösning (0,4 M Na 2 HPO 4), 48 ml natriumfosfat monobasisk lösning (0,4 M NaH 2 PO 4), 500 ml 8% formaldehydlösning, 250 ml Milli- Q-ddl vatten, vid pH 7,4
HEPES-buffrad Hanks saltlösning med natriumazid (HBHS) - ig / l, 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,06 g KH 2 PO 4, 0,13 g Na 2 HPO 4, 2 g glukos, 2,4 g HEPES, 0,05 g MgClj 2 6 delar H 2 O, 0,05 g MgSO 4 7 delar H 2 O, 0,165 g CaCl 2, 0,09 g NaN 3 vid pH 7,4
Tvättlösning (WS) - 1% vol / vol, NorMal getserum, 0,3% Triton X-100, i HBHS med natriumazid (NaN 3). Kylförvara WS vid 4 ° C före användning i efterföljande steg.
U2 Sca l e Lösning - 4 M urea, 30% glycerol och 0,1% Triton X-100 17
FÖRFARANDE
Alla experiment utfördes under överinseende av Purdue Animal Care och användning kommittén och Laboratory Animal programmet vid Purdue University.
1. Kirurgi
- Olika aseptiska kirurgiska metoder är kompatibla med den presenterade histologiska metoden. Användningen av en stereotaktisk ram och automatiserade införingsanordningar rekommenderas att förbättra reproducerbarhet och kontroll av mikroelektrod arrayer (MEA) implantering vinkel med avseende på stereotaktiska plan.
Observera: I denna demonstration vår kirurgisk metod är som följer: håll gnagare ämnet i stereotaxisk earbars while enligt isofluran anestesi (mellan 1-3%) bärs av medicinsk kvalitet syre. Test för avsaknaden av en tå-nypa reflektera hos råtta eller brist på en svans nypa reflex i musen för att bekräfta att djuret är helt sövda. Applicera ögonsalva och rengör operationsområdet med tre alternerande tvättar av Betadine och etanol. Tvätta händerna, gryning kirurgiska handskar, hårnät, ansiktsmask och klänning. Injicera en bolus av lidokain för att bedöva det kirurgiska området, skapa ett snitt med sax eller skalpell, klar periostet med ben skrapa och applikatorer bomull, och skapa en kraniotomi med en tandläkarborr handstycke och borr. Kör en enda skaft MEA i hjärnbarken med hjälp av en mikromanipulator. Ha en kirurgisk assistent hjälp att upprätthålla aseptiska kirurgi förhållanden och dokumentera genomförandet av operationen.
- Efter implantation av MEA i hjärnan, samla bilder via ett kirurgiskt mikroskop för att informera den slutliga avlägsnandet av skallen från runt Bregn. Implanterade delar av enheterna kommer att bevaras på plats.
Anmärkning: Den eventuella samling av vävnad med in situ-enheter bygger på nära matchning plan enhetens införande med planet av vävnad snittning. Detaljerade anteckningar om enhetens införande plan relativt hjärnan är därför mycket viktigt.
- Efter enhet implantation tillämpa silikonelastomeren Kwik-Sil (WPI), runt synligt MEA skaft eller kablage, och låt bota. En steriliserad plaststycke, såsom en skuren pipettspets, kan användas för att bidra till att hålla den silikonelastomer i en liten väl runt kraniotomi medan härdning.
- Applicera ett lager tvådelad dental akryl ("Jet Liquid" och "Jet Powder" från Lang Dental) över Kwik-Sil och alla utsatta skalle.
Obs: I ett senare steg kommer headcap smältas genom att möjliggöra för implantatet som skall separerasfrån skallen. UV-härdande akryl bör undvikas över Kwik-Sil och kraniotomi, eftersom detta mycket hårt akryl är svårt att avlägsna senare. Visuellt ogenomskinliga material runt implantatet bör också undvikas, klar Kwik-Sil ger en vy av implantatet under efterföljande steg i detta protokoll.
- Utför postoperativ vård förfaranden enligt den lokala protokollet av gällande djurskyddsbestämmelser och återgå ambulatoriska patienter till en enda inrymt bur-boxar.
2. Perfusion och Tissue Collection
Obs: Se Gage et al. för en detaljerad perfusion genomgång i rått djurmodell 19.
- Använd anestesi och perfusion protokoll som godkänts av institutionens djuromsorg och användning kommitté. Efter djupt anestetisering gnagaren (bekräftad genom en brist på tå-nypa reflex i råtta eller svans-nypa reflex hos möss) och exponera hjärtat, göra grunt scissor snitt itill vänster ventrikel och höger förmak. Sätt i en trubbig nål in i den vänstra ventrikeln och leverera rumstemperatur PBS. Leverera totalt ~ 10 ml PBS vid ~ 5 ml / min i möss och ~ 200 ml PBS vid ~ 100 ml / min hos råttor. Leta efter blodclearance från levern under.
- Injicera histologiskt relevanta kemiska etiketter transkardiellt, om så önskas, genom spruta leverans med omsorg för att undvika att införa bubblor.
Obs: Vaskulära etiketter (t.ex. Dil) och nukleinsyra färgämnen motfärg (t.ex. Hoechst 33342) är exempel på kemiska etiketter avges under perfusionen. Vid administrering korrekt bör dessa histologiska markörer märka hela djuret 20.
- Leverera buffrad, rumstemperatur, 4% formaldehyd transkardiellt att fixera djuret. Undvik septum perforering över hjärtat, vilket kan styrkas genom lung-näsa dränering under perfusionen. Leta efter fixering skakningar i de stora musklernaatt indikera fullständig perfusion. Leverera totalt ~ 10 ml fixativ vid ~ 5 ml / min i möss och ~ 200 ml fixativ vid ~ 100 ml / min hos råttor.
- Efter perfusion halshugga djuret, exponera en del av hjärnstammen eller cerebellum med rongeurs eller sax och plats huvud i 4% formaldehyd lösning för natten vid 4 ° C.
- Tvätta huvudet i tre byten av PBS med 3:59 timmars intervall mellan tvättar.
- Förvara fasta huvuden i HBHS innehåller natriumazid vid 4 ° C i flera dagar till månader.
3. Brain Borttagning med in situ-enheter
Obs: Utför detta avsnitt i ett dragskåp iklädd lämplig personlig skyddsutrustning. Undvik vävnad uttorkning genom att returnera den fasta huvudet HBHS lösning regelbundet.
- Försiktigt dissekera bort hud och andra vävnader från hela akryl kalott med pincett och små saxar.
- Iklädd värme-Insensitive handskar, använd en lödkolv för att ta bort tand akryl och exponera ett område av underliggande klara Kwik-Sil (Figur 2a).
Obs: Målet med detta steg är att låta mikro-sax en lämplig vinkel tillgång till positioner där de implanterade anordningar in i hjärnan, så att hjärnan-implanterade komponenter kan separeras från komponenter fästa vid skallen.
- Enligt en operationsmikroskop, skuren i silikonelastomeren med krökta mikro-sax, ta bort små bitar av Kwik-Sil med pincett ned till det läge där anordningarna in i hjärnan.
- Fortsätt skärning längs ytan av kraniotomi med krökta mikro-sax till separata enhetens komponenter fästa till polykisel och skallen från komponenter implanterade i hjärnan. Återigen använder mikroskop förstoring och ytterst försiktig vid sågning genom de exponerade enhetens komponenter, var noga med att undvika att trycka eller dra implants i det fasta vävnaden.
- Ta benet runt headcap försiktigt med rongeurs. Använd en spatel att separera hjärnan med implanterade enheter från skallen. Förvara hjärnan i HBHS lösning tills den ska skära.
- Placera hjärnan i ett glas Petriskål fylld med HBHS, och använda ett rakblad för att avlägsna främmande vävnad, såsom ryggmärg, lillhjärnan eller luktloben, beroende på om de är relevanta för placeringen av anordningens implantering. Använd en hjärna blocket (Ted Pella) och rakblad till sektion hjärnan och skapa en plan yta nära matchar vinkeln av de implanterade anordningarna, vilket åstadkommes genom att placera hjärnan i en lämplig storlek hjärna blocket, orientera hjärnan så att varje synliga delen av implantatet är parallell med rakbladet guide, och placera ett rakblad i en lamellstöd minst 2 mm från implantatet. Tryck rakbladet genom vävnaden. Montera denna yta till en vibratom plattform. Alternativt, monterad ett rakblad till en mikromanipulator kan användas i ett liknande kontrollerad sätt som hjärnan blocket för att skapa en plan nära matcha riktningen av implantatet.
- Placera is under vibratom plattformen, och, efter att ha tillåtit vävnadsytan att kort torka på en pappershandduk, vidhäfta hjärnan till en vibratom med superlim. Limma den platta vävnad plan skapades i föregående steg är att scenen. Med asymmetriska vävnad dimensioner, orientera provet så att den bredaste dimensionen limmas ned parallellt med rörelsen riktning vibratome bladet för att undvika bladet eventuellt knackar vävnaden över. Efter limmet uppsättningarna (~ 1-2 minuter), tillsätt kyld (~ 4 ° C) PBS till vibratom skålen runt vävnaden.
- Samla tjocka vävnad skivor mellan 200-400 nm, inklusive kontroll vävnad, med maximal vibration ränta (~ 100 Hz) och en långsam blad progression rate (<0,2 mm per sekund), med ett blad vinkel 10 ° från Horizontal. Samla skivor försiktigt med en borste eller skopa spatel och förvara i HBHS i en 24 brunnar vid 4 ° C.
- När in situ enheten är synlig för blotta ögat eller en operationsmikroskop, samla tunnare sektioner att närma anordningen i slice steg om 100 ^ m eller mindre.
Obs: Typiska kisel mikro-implantat är synliga med blotta ögat i formaldehyd-fast gnagare hjärnbarken vävnad mellan 300 och 500 nm från enhetens yta.
- Med in situ-enheten nu nära ytan av vävnaden, samla en> 250 fim vävnad skiva innehållande enheten inom. Uppskattning av den nödvändiga tjockleken kan underlättas genom hänvisning till tidigare insamlade skivor.
Obs: Större enheter, enheter multishank och vinklade enheter kan kräva tjockare vävnad skivor (> 500 nm) för att fånga enheten i en vävnad stycke, reledamot att både penetration av tillämpade etiketter och mikroskopi avbildning djupet kommer att begränsas i den slutliga datainsamlingen från dessa mycket tjocka skivor. Om möjligt, undvika att slå enheten med vibratome blad, eftersom detta kan orsaka att dra av enheten genom vävnaden och morfologiska deformation.
4. Tissue Hantering och clearing
- Tvätta skivor 3x vid 5 min per tvätt i HBHS
- Inkubera i natriumborhydrid (5 mg NaBH 4/1 ml HBHS) under 30 min totalt (15 minuter varje sida av skivan). Vänd segment med en rostfritt stål eller Teflon-belagd mikro sked och liten pensel (Ted Pella). Långsamma och eftertänksamma rörelser förbättra resultaten för varje skiva flip. Undvik att röra alla områden runt den implanterade enheten med borsten. När det är möjligt, lägga betydligt mer lösning än krävs (> 2 ml) gör att man kan manipulera och vända vävnadsskivor lättare.
Obs: Detta steg minskar endogen autofluorescens, hoppa över detta steg om fluorescerande markörer har tillämpats under perfusion eller XFP transgena markörer är närvarande.
- Tvätta skivor 3x vid 5 min per tvätt i tvättlösning vid rumstemperatur.
Obs: Agitation vid tvätt och inkubation steg är valfritt. Författarna spekulerar att subtila skakning av styva implantatet med avseende på den omgivande hjärnvävnaden kan förekomma med omröring. Emellertid kan en orbitalblandare rör sig med en hastighet mild (<60 vpm) undvika detta samtidigt öka rörelsen av lösningar.
- Block under 2 timmar i tvättlösning vid rumstemperatur (flip segment efter en timme).
- Inkubera i primära antikroppar (utspädda i tvättlösning) under ca 48 timmar (24 timmar på varje sida av skivan) vid 4 ° C.
- Utför 6 snabba 3 min tvättar med tvättlösning.
- Utför 6, 1 tim tvättar (3 tvättes på varje sida av vävnaden skiva) i tvättlösning (förvaras vid 4 ° C om tvätt över natten).
- Inkubera i sekundära antikroppar (utspädd med tvättlösning) under ca 48 timmar (24 timmar på varje sida) i 4 ° C.
- Utför 6 snabba 3 min tvättar med tvättlösning.
- Utför 6, 1 tim tvättar (3 tvättar på varje sida) i tvättlösning, förvara vid 4 ° C om tvätt natten.
- Ta Tvättlösning och tillsätt glycerol-baserade "U2 - SCA l e" clearing-lösning. Låt att rensa ca 1 vecka för tjocka skivor (250-500 um) eller 2-3 veckor för mycket tjocka vävnadssektioner (> 500 | im) vid 4 ° C.
- Täck plattan med folie och förvara vid 4 ° C.
- Montera i bilder tillmötesgående tjocka vävnadssektioner (Figur 2b, 2c) med clearing-lösning som montering media och tätning med genomskinligt nagellack. Lagra vid 4 ° C i skydd mot ljus.
5. Panorama Imaging av Full Tissue och Device Interface
- Använda längre arbetar mål avstånd mikroskop (> 2 mm), börja avbildning med en laserskanning konfokalmikroskop eller 2-foton mikroskop. Vi kommer att visa med en Zeiss LSM 710, Carl Zeiss "Zen" programvara (2010), och en datorstyrd XY översätta skede bild en 3D Panorama runt ett implantat.
Obs: Korrekt för brytningsindex clearing lösningen antingen i mjukvara genom en korrigerande krage på målet, eller i databehandling efter insamlingen. I denna demonstration vi in ett brytningsindex värde för "U2" clearing lösning 1,4 till Leica Zen mikroskopet programvara, denna inställning subtilt justerar z-steg mellanrum att redovisa brytningsindex obalans.
- I vävnad nära enheten, ungefär bedöma den lämpliga z-axel fönster och datainsamling inställningar i z-dimensionen för varje fluorescerande kanal med låg lasereffekt (~ 0Från 0,5 till 5%) och stora z-stegstorlekar (> 25 | im).
Obs: Inkludera ytterligare utrymme ovanför och under när du z-axeln när du konfigurerar för panorama insamling, eftersom vävnaden inte kan ligga helt plant på objektglas (~ 20 nm vardera riktningen).
- Fastställdes målet vid xy mitten av din eventuella panorama, med Zen panorama programvara, bestämma antalet insamling positioner som krävs för varje axel (x och y) för att täcka din region av intresse.
- Ompröva och slutföra z-axeln samling fönstret.
- Manuellt ställa in detektorns känslighet och lasereffekt att rampa lämpligt med ökat djup, syftet är normalt att upprätthålla ungefär samma bild intensiteten oavsett avbildning djup i vävnaden skiva, men för att också undvika höga bakgrundsljud.
- Samla alla fluorescerande bild dataserier. Om det är nödvändigt för att undvika överlappande signaler, kör laserlinjes sekventiellt.
Obs: Om tillgängligt, ställ in programmet att automatiskt spara data till hårddisken under insamling.
- Ändra programinställningarna för att samla in "reflektans" och "transmittans" data och använda en längre och mer penetrerande våglängd laser (t.ex. 633 nm) för att fånga dessa kanaler. Bestämma lämplig lasereffekten och detektor känslighet för "reflektans" och "transmittans" insamling och upprepa samma samling serien runt den implanterade enheten.
- Exportera data för senare bearbetning, kvantifiering och analys.
Representative Results
Brain-implanterade MEA kan samlas i vävnader skivor genom att först separera eventuella skalle monterade komponenter från hjärnan inbäddade komponenter. Figur 2a visar resultaten av att ta bort en sida av en tandcement headcap och en del av Kwik-Sil kring en MEA-kabel på en råtta skalle. En lödkolv användes för att avlägsna tandcement och Kwik-Sil i ett dragskåp. Kablage och varje icke-implanterade MEA strukturer nästa skära med mikro-sax genom att långsamt gräva igenom Kwik-Sil ner till ytan av den fasta hjärnan.
Efter skivning, märkning och rensa vävnad, enkla skräddarsydda bilder är användbara för montering av tjocka vävnad skivor (Figur 2b). En monterad hjärna skiva innehållande en implanterad mikroanordning visas i figur 2c. Avbildning genom endera sidan av objektglaset kan tillåta dig att bedöma gränssnittet kring en anordning, såsom visas i figur 3 (figur 3a) och mikroglia längs elektroderna och spår är synliga på den andra sidan (figur 3b).
När monterad, kan vävnad avbildas med ett XY översättning skede. Översikter av fluorescerande markörer över hela vävnad skivor kan genereras vid önskad upplösning (Figur 4). Detaljerad granskning av morfologiskt bevarade vävnaden gränssnitt runt implanterade Microdevices kan samlas under hög förstoring för analys av den lokala vävnaden svar (Figur 5).
Figur 1. Översikt av förfarande. (AC) Brain mikro-implantat operationer är Finastabiliserats med ett skikt av Kwik-Sil polymeren omedelbart omger anordningen, följt av en akrylcement täckning. (D, e) Efter eutanasi, är akryl skiktet bränns bort, och skalle-monterade komponenter hos anordningen separeras från implanterade komponenter genom att skära igenom silikonelastomeren. (F, g) Hjärnan avlägsnas sedan från skallen och skärs och monteras på vibratom stadiet. (HK) Tissue skivor samlas, bland annat en vävnad skiva som innehåller enheten. (L) Vävnad kan sedan bearbetas och monteras i anpassade kammare för detaljerad mikroskopi. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. (A) Rensa Kwik-Sil silikon elastomer Surrounding en elektrod-array-kabel (pil) har utsatts genom att bränna bort ett fönster i tandcement locket på en perfunderad gnagare huvud med hjälp av en lödkolv. (B) att rymma avbildning i antingen sidan av en tjock vävnad skiva, enkla "slide-kammare" kan göras genom att skära en plast bild och vidhäftande täckglas till endera sidan runt vävnaden och montering lösning. (C) En råtta hjärnvävnad skiva med intakt implantat (röd pil) visas efter montering. Endera sidan av vävnaden är snabbt tillgänglig för mikroskopi avbildning med denna inställning. För skala, är panel (a) 25 mm över vid botten, medan panelerna (b, c) är 80 mm över nedtill.
Figur 3. Maximal intensity z-projektioner av 40 um tjocka bildstaplar, samlats runt baksidan (a) och främre (b) av en implanterad mikroelektrod array. Mikroglia (märkt med anti-Iba1 och Alexa Fluor 633, vit) och laserljus reflektans (röd), som samlats in från ytan av enheten, sekventiellt avbildades från båda sidor av en 400 nm tjock vävnad skiva. Eftersom hjärnimplantat ofta opaka, montering med optisk åtkomst till båda sidor ger en klar bild av märkta vävnadsstrukturer "bakom" implantatet i förhållande till mikroskopobjektivet. Skala bar 50 um.
Figur 4. En märkt DCHist skiva avbildas med en datorstyrd steget på en laser scanning konfokalmikroskop. (A) cellkärnor (färgade med Hoechst 33342) och (b) monocyter / mikroglia(Märkt med anti-Iba1) sattes samtidigt avbildas på separata kanaler. (C) Överföring ljus och reflektans uppsamlades också, visar placeringen av 4-veckors implantat med avseende på Hoechst och Iba1 uppgifter. (D) Överlagring av alla kanaler, men överföring är också visas. Den vita rektangeln Området expanderas i bilderna uppträder vid höger. Skala bar 1 mm.
Figur 5. Med hjälp av en dator-styrd mikroskop scenen och lämplig programvara, kan panorama bilddata samlas runt implantatet. Reflektans (a) och transmittans (b) tillåta lokalisering av enheten, medan fluorescerande antikropp eller kemiska etiketter (c, anti-Iba1 märkning av mikroglia och macrophages) tillåter detaljerad avbildning av vävnadskomponenter längs den intakta vävnaden gränssnittet. Skalstock 200 um.
Discussion
Den "Device-Capture Histologi" (DCHist) metod visade här möjliggör nära histologisk morfologiskt bevarade interaktioner mellan hjärnvävnad och implantat vävnad. DCHist vävnad samling kräver noggrann separation av skallen monterade enhetens komponenter från komponenter implanterade i hjärnan. DCHist kräver också insamling av en tjock histologisk vävnad skiva (> 250 nm). Dessa vävnadssnitt, när märkt, rensas, monterade, och avbildas, kan ge nya insikter i implantation skada eller senare kronisk reaktion på medicinsk utrustning. Med avancerade mikroskopi verktyg kan gränssnittet mellan vävnad och anordning avbildas och analyseras i hög detalj, såsom visas i figurerna 3-5.
De presenterade teknikerna i sin nuvarande form är beroende av förmågan att sakta gräva bort headcap gjord av två delar tandcement och Kwik-Sil ner till den punkt av enhet implantation.Använda dentalcement som kan brännas bort eller avlägsnas på annat sätt och en klar silikonelastomer genom vilka små sax kan styras visuellt kraftigt underlätta framgångsrikt separera den implanterade enheten från dess skalle-monterade komponenter. Försök att skära enheten under skallen och över hjärnan för att samla den på plats rekommenderas inte, eftersom skallen-monterade implantat kommer att dras ut ur hjärnan en betydande mängd.
Även tunnare, mindre implantat, såsom enstaka skaft MEA från NeuroNexus Technologies, är mest mottagliga för DCHist är principerna inte begränsade till enda enhet skaft eller matriser mikroelektrod. Insamling och strategier avbildning är brett tillämpbar på flera skaft enheter och större implantat som kanyler, med de krav är att de måste skiljas från någon skalle montera och samlas i en tjock vävnadssnitt. Även om författarna är fokuserade på analys av vävnadomgivande kortikala implantat, kan enheter som drivs djupare in i hjärnan också samlas in och avbildas. Djupet av implantatinföring bör inte påverka fångst av implantatet i en skiva som apparaten inte avviker vilt från den kända vinkeln för insättning.
Begränsningar finns till användbar tillämpning av metoden DCHist. Brain vävnadssnitt utmanar till bild genom hundratals mikrometer, särskilt i områden med vit substans, även optiska clearing-lösningar kan förbättra avbildning djup i olika vävnader 21. För att ytterligare förbättra avbildning djup, kan tvåfotonexcitering mikroskopi användas tillsammans med den beskrivna optiska clearing.
En annan potentiell begränsning av den beskrivna metoden kan vara de specifika fluorescerande immunohistokemi metoder och antikroppar används av forskare. Passiv diffusion driver typiskt införlivandet av dessa markörer genom fast vävnadoch på antigenbindande ställen. Slutliga antikroppar arbetar Halterna måste bestämmas av forskare från fall till fall för att maximera etikett penetrering samtidigt undvika höga nivåer av bakgrunden märkning. Antikropp Märkningen bör inte vara variabel mellan skivor som behandlas identiskt, men olika antikroppar kan variera avsevärt i sin förmåga att tränga in och tagga sitt antigen, med vissa antikroppar lätt märkning antigener många hundra mikrometer djup och andra märkning antigener endast tiotals mikrometer djup. Vi beskriver förbättra denna spridning genom att antikroppar etiketter vid högre än typiska koncentrationer, för flera dagar av ansökan och i en lösning som innehåller utspädd rengöringsmedel och blockera serum. Periodvis vända skivorna också befrämjar jämn märkning. Antigenåtervinning steg och alternativa processer fixering (t.ex. glutaraldehyd, mikrovågsugn, etc.) kan vara lämpligt för specifika antigener. Sekundär antikropp-fluorochrome konjugat kan också variera i sina prestationer märkning tjocka sektioner, även om detta inte har observerats av författarna använder Alexa Fluor etiketter från Invitrogen. Alternativt kan transgena djur försökspersoner uttrycker fluorescerande proteiner i celltyper av intresse användas för att undvika problem med antikropp etikett penetration, eftersom många fluorescerande proteiner, såsom EGFP, behålla sin fluorescens efter formaldehyd behandling, och kan vara omedelbart visualiseras i vävnadssnitt.
DCHist är en kraftfull uppsättning tekniker för att fånga och analysera hur implanterade Microdevices på hjärnvävnad. Koppling denna histologisk protokoll med in vivo utvärdering av elektrofysiologi kvalitet och elektrod data Impedans 22 kan avsevärt förbättra vår förståelse av de biologiska källorna fysiologi variabilitet och nedbrytning. Området implanterade neurala proteser i synnerhet kan dra nytta av den detaljerade DCHist imaging av den intakta anordningen / vävnadsgränssnittet att informera vidareutveckling av biologiskt neutrala MEA-enheter.
Disclosures
Författarna har inga relevanta upplysningar för att förklara ekonomisk eller på annat sätt.
Acknowledgments
Alla experiment utfördes under överinseende av Purdue Animal Care och användning kommittén och Laboratory Animal programmet vid Purdue University.
Detta arbete sponsrades av Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Mikrosystemteknik Office (MTO), under ledning av Dr Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) som en del av tillförlitlig Neural Technology Program, genom Space och Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) System Center (SSC) Pacific Grant No N66001-11-1-4013.
Författarna vill tacka Michail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor och Kevin Eliceiri för att dela sin mikroskopi expertis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| H–chst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
| Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
| Equipment | |||
| Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
| Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
| Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
| Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
| Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
| Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
| Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
| 24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
| Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ’Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
| Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap | |
References
- Schwartz, A. B. Cortical Neural Prosthetics. Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).
- Normann, R. A. Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system. Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).
- Rousche, P., Normann, R. A. Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex. Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).
- Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation. Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).
- Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors. Hearing Research. 210, 112-117 (2005).
- Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).
- Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).
- Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants. J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).
- Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Research. 983, 23-35 (2003).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. J. Neural Eng. 6, 056003 (2009).
- Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays. J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).
- Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes. J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).
- Wilks, S. Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation. Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).
- Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances. IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).
- Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes. IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).
- Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology. Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Li, Y., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).
- Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces. J. Vis. Exp. (60), e3566 (2012).
