Summary
Hier presenteren we een histologische methode voor het vastleggen, etikettering, optisch opruimen, en het afbeelden van de intacte hersenen weefsel-interface rond chronisch geïmplanteerde Microdevices in knaagdieren hersenweefsel. Resultaten van de technieken die deze methode bruikbaar voor het begrijpen van de invloed van verschillende penetrerende brain-implantaten hun omringende weefsel.
Abstract
Onderzoek naar het ontwerp en het gebruik van de hersenen geïmplanteerde Microdevices, zoals micro-elektrode arrays, gericht op het produceren klinisch relevante apparaten die chronisch interface met omliggende hersenweefsel. Weefsel rondom deze implantaten wordt verondersteld te reageren op de aanwezigheid van inrichtingen tijd, die de vorming van een isolerend "glial scar" rond de apparaten omvat. Echter histologische analyse van deze weefselveranderingen typisch uitgevoerd na explanteren van het apparaat, in een proces dat de morfologie van het weefsel van belang kunnen verstoren.
Hier laten we zien een protocol waarin corticale-implantaten worden verzameld intact in knaagdieren omringende hersenweefsel. We beschrijven hoe eenmaal geperfundeerd met fixeermiddel, worden hersenen verwijderd en gesneden op zodanige wijze dat explanteren apparaten te voorkomen. We schetsen fluorescerend antilichaam etikettering en optische clearing methoden bruikbaar voor het produceren van een informatieve, maar toch dik weefselsectie. Tenslotte demonstreren wij de montage en beeldvorming van deze weefselcoupes om de biologische-interface in brain-implantaten onderzoeken.
Introduction
Het veld van neuroprosthetic onderzoek heeft als doel om te helpen individuen die lijden aan verschillende handicaps en stoornissen door het omzeilen van zieke of beschadigde structuren in het lichaam door middel van CNS interface apparaten 1,2. Brain geïmplanteerde Microdevices zoals microelectrode arrays (MEA), kunnen worden gebruikt voor het opnemen of stimuleren hersenstructuren en dus flexibele opstelling van langdurige interfaces tussen elektronica en CZS-weefsel 3-5. Doordringende MEA inrichtingen, die worden gedreven in het hersenweefsel, zijn buitengewoon veelbelovend als bidirectionele interfaces vanwege de nabijheid waarin zij elektroden vormen voor een relatief klein aantal nabijgelegen neuronen 6.
Echter complexe weefselreacties gevolg van de lange termijn implantatie van doordringende MEA, vaak resulterend in variabele geleidelijk verval elektrofysiologische signaal-ruisverhouding gedurende dagen tot maanden, en een toename in elektrische impedantiewicht tussen elektrode sites en gemalen 7,8. De vermoedelijke oorsprong van deze veranderingen omvatten de activering van microglia, reactieve astrocytose langs de microstructuren en een verlies of migratie van neuronen uit het weefsel rondom implantaten te 9-11. Een belangrijke uitdaging voor het begrijpen van deze weefsel veranderingen rond chronische, penetratie MEA is de moeilijkheid in het vastleggen van histologische onderzoek van het intacte weefsel-interface rondom chronisch geïmplanteerde apparaten 12. Histologische analyse van het weefsel met het apparaat / weefsel-interface nog steeds aanwezig zou verbeteren op de huidige apparaat-verwijdering histologische protocollen. Met vrij apparaat blijft in het weefsel, kan de biologische gevolgen van relatief subtiele interacties, zoals het gebruik van biocompatibele coatings 13,14 of de elektrische clearing van het elektrodeoppervlak 15,16, worden afgebeeld en geanalyseerd met betrekking tot het implantaat.
Hvoordat demonstreren we een methode voor het verzamelen, verwerken en het imago van de intacte microdevice interface voor gedetailleerde microscopie-gebaseerde analyse van het omliggende hersenweefsel. In deze werkwijze worden de inrichting en het omringende hersenweefsel verzameld in een dikke (> 250 pm) met een weefselsectie vibratome. Aan histologisch label penetratie verbeteren in deze dikke plakken worden fluorescent histochemische en immunohistochemische labels toegepast bij hoge concentraties in oplossingen die blokkeren serum en wasmiddel voor meerdere dagen. Een optische clearing oplossing wordt gebruikt om microscopie diepte te verbeteren en het weefsel is gemonteerd in 2-zijdig kamers voor latere laser scanning confocale microscopie 17. De volledige histologisch-interface vangen, wordt een computergestuurde translationele fase tijdens beeldvorming om z-stack panorama verzamelen langs de lengte van implantaten. Naast beeldvorming toegepast weefsel labels, verzamelen laser reflectie terug van implantatenen transmissie licht door het weefsel zowel hulp lokaliseren van het apparaat-interface ten opzichte van het omringende weefsel. Tissue opgesteld op basis van deze "Device-Capture Histologie" (DCHist) protocol biedt beeldvorming toegang tot de morfologisch bewaard weefsel / apparaat interacties, en dus verbetert vorige apparaat voor het verwijderen van histologische protocollen 18.
Protocol
Oplossingen
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) - in g / l, 9 g NaCl, 0,144 g KH 2PO 4, 0,795 g Na 2 HPO 4, bij pH 7,4
4% Formaldehyde - in ml / l; 202 ml dibasisch oplossing (0,4 M Na 2 HPO 4), 48 ml monobasisch natriumfosfaat-oplossing (0,4 M NaH 2 PO 4), 500 ml 8% formaldehyde-oplossing, 250 ml Milli- Q water ddl, bij pH 7,4
HEPES gebufferde Hank's Saline met natriumazide (HBHS) - in g / l; 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,06 g KH 2PO 4, 0,13 g Na 2 HPO 4, 2 g glucose, 2,4 g HEPES, 0,05 g MgCl2 6 delen H2O, 0,05 g MgSO 4 7 delen H 2 O, 0,165 g CaCl2, 0,09 g NaN3 bij pH 7,4
Wash Solution (WS) - 1% vol / vol, ook nietmal Goat Serum, 0,3% Triton X-100, in HBHS met natriumazide (NaN3). Koel het WS bij 4 ° C voor gebruik in daaropvolgende stappen.
U2 Sca l e Solution - 4 M ureum, 30% glycerol en 0,1% Triton X-100 17
PROCEDURE
Alle experimenten werden uitgevoerd onder toezicht van de Purdue Animal Care en gebruik Comite en het Laboratory Animal Program aan de Purdue University.
1. Chirurgie
- Verschillende aseptische chirurgische methoden verenigbaar zijn met de gepresenteerde histologische methode. Het gebruik van een stereotactische frame en geautomatiseerde inbrengers wordt aanbevolen om reproduceerbaarheid en controle van de micro-elektrode arrays (MEA) implantatie hoek verbeteren met betrekking tot stereotaxische vlakken.
Opmerking: In deze demonstratie onze chirurgische methode is als volgt: houd de knaagdier onderwerp in stereotaxisch earbars while onder isofluraan anesthesie (tussen 1-3%), uitgevoerd door medische kwaliteit zuurstof. Test voor het ontbreken van een toe-pinch weerspiegelen in de rat of het ontbreken van een staart pinch reflex in de muis te bevestigen dat het dier volledig verdoofd. Breng oogzalf en reinig de chirurgische site met drie afwisselende wasbeurten van Betadine en ethanol. Was handen, dageraad chirurgische handschoenen, haarnetje, gezichtsmasker en toga. Injecteer een bolus van lidocaïne op de chirurgische te verdoven, een incisie met een schaar of een scalpel, duidelijke periost met been schraper en katoen applicators te creëren, en een craniotomie met behulp van een tandheelkundige boor handstuk en boor te creëren. Rijd een single-schacht MEA in de cortex met behulp van een micromanipulator. Heb een chirurgische assistent hulp bij het handhaven van aseptische chirurgie voorwaarden en documenteren het verloop van de operatie.
- Na implantatie van de MEA in de hersenen, beelden verzamelen door een chirurgische microscoop om de uiteindelijke verwijdering van de schedel hoogte van rond de bregen. Geïmplanteerde delen van de apparaten worden bewaard in situ.
Opmerking: De uiteindelijke verzameling van weefsel met in situ apparaten gebaseerd op dicht aansluit bij het vlak van inrichting insertie met het vlak van weefsel coupes. Gedetailleerde aantekeningen over het apparaat inbrengen vliegtuig ten opzichte van de hersenen zijn dus erg belangrijk.
- Na implantatie, breng het silicone elastomeer Kwik-Sil (WPI), rond een bloot MEA schachten of bekabeling, en laten uitharden. Een gesteriliseerd plastic stuk, zoals een snee pipetpunt, kan worden gebruikt om de silicone-elastomeer bevatten in een klein putje in de craniotomie het uitharden.
- Breng een laag van twee-delige tandheelkundige acryl ("Jet Liquid" en "Jet Powder" van Lang Dental) over de Kwik-Sil en blootgestelde schedel.
Opmerking: In een latere stap wordt de headcap worden gesmolten door om het implantaat te scheidenvan de schedel. UV-uithardende acryl worden vermeden gedurende de Kwik-Sil en craniotomie, aangezien dit zeer moeilijk acryl is later moeilijk te verwijderen. Visueel ondoorzichtige materialen rondom het implantaat moet ook worden vermeden; duidelijke Kwik-Sil geeft een beeld van het implantaat tijdens de volgende stappen van dit protocol.
- Post-operatieve zorg procedures volgens het lokale protocol van het welzijn van dieren regelgeving, en terug te keren ambulante patiënten met single-gehuisvest kooi-dozen.
2. Perfusie en Tissue Collection
Opmerking: Zie Gage et al.. voor een gedetailleerde perfusie procedure walkthrough bij de rat diermodel 19.
- Gebruik de anesthesie en perfusie protocol goedgekeurd door dier van de instelling zorg en gebruik comite. Na diep verlamming van de knaagdieren (bevestigd door een gebrek aan toe-snuifje reflex in ratten of staart-snuifje reflex bij muizen) en het blootstellen van het hart, maken ondiepe schaar bezuinigingen opde linkerventrikel en rechter atrium. Plaats een stompe naald in de linker ventrikel en leveren kamertemperatuur PBS. Leveren in totaal ongeveer 10 ml PBS bij ~ 5 ml / min in muizen en ~ 200 ml PBS bij ~ 100 ml / min bij ratten. Kijk voor het bloed te zuiveren van de lever tijdens.
- Transcardiaal injecteren histologisch relevante chemische labels, indien gewenst, door spuit productietijd met zorg te voorkomen dat er luchtbellen.
Opmerking: Vasculaire labels (bijv. DiI) en nucleïnezuur tegenkleuring kleurstoffen (bijvoorbeeld Hoechst 33342) zijn voorbeelden van chemische labels leverbaar tijdens perfusie. Bij een juiste toediening, moeten deze histologische markers label het hele dier 20.
- Lever gebufferd, kamertemperatuur, 4% formaldehyde transcardiaal om het dier op te lossen. Vermijd septum perforatie over het hart, die kan door long-nose drainage worden aangetoond tijdens de perfusie. Kijk voor fixatie trillingen in de grote spierenvolledige perfusie geven. Leveren in totaal ~ 10 ml fixeermiddel bij ~ 5 ml / min in muizen en ~ 200 ml fixeermiddel bij ~ 100 ml / min bij ratten.
- Na perfusie onthoofden het dier bloot deel van de hersenstam of cerebellum met rongeurs of schaar en place kop in 4% formaldehyde oplossing overnacht bij 4 ° C.
- Was de kop in drie veranderingen van PBS met een tot vier uur intervallen tussen wasbeurten.
- Bewaar vaste koppen in HBHS bevattende natriumazide bij 4 ° C gedurende dagen tot maanden.
3. Brain verwijderen met in situ apparaten
Opmerking: Voer deze sectie in een zuurkast tijdens het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Vermijd weefsel uitdroging door terugzending van de vaste kop om periodiek HBHS oplossing.
- Voorzichtig ontleden weg huid en andere weefsels uit de hele acryl schedelkap behulp van een tang en een kleine schaar.
- Terwijl het dragen van warmte-insensitive handschoenen, gebruik maken van een soldeerbout om tandheelkundige acryl te verwijderen en een oppervlakte van ten grondslag liggen aan duidelijke Kwik-Sil (figuur 2a) bloot te leggen.
Opmerking: Het doel van deze stap is om micro-schaar een geschikte hoek toegang tot posities waar de geïmplanteerde apparaten in de hersenen, waardoor de hersenen geïmplanteerde componenten worden gescheiden van componenten bevestigd aan de schedel.
- Onder een chirurgische microscoop, gesneden in de silicone-elastomeer met gebogen micro-schaar, het verwijderen van kleine stukjes Kwik-Sil met een pincet naar de positie waar de inrichtingen in de hersenen.
- Verder zagen langs het oppervlak van de craniotomie met gebogen micro-schaar afzonderlijk apparaat onderdelen die aan polysilicium en schedel van componenten in de hersenen geïmplanteerd. Opnieuw te gebruiken microscoop vergroting en grote zorg bij het snijden door middel van de blootgestelde onderdelen van het systeem en zorg ervoor om te voorkomen dat duwen of slepen van de implanten in de vaste weefsel.
- Verwijder het bot rond de headcap met zorg met behulp van rongeurs. Gebruik een spatel om de hersenen te scheiden met geïmplanteerde apparaten van de schedel. Bewaar de hersenen in HBHS oplossing totdat klaar om te snijden.
- Plaats de hersenen in een glazen petrischaal gevuld met HBHS en met een scheermesje om vreemde weefsel te verwijderen, zoals ruggenmerg, cerebellum of bulbus olfactorius, naargelang zij relevant zijn voor de locatie van de implantatie. Gebruik hersenen blokkeren (Ted Pella) en scheermesjes punt de hersenen en een plat vlak nauw overeenkomt met de hoek van de geïmplanteerde apparaten, dit wordt bereikt door het brein in een geschikte grootte brain blok oriënteren de hersenen, dat zichtbare gedeelte van het implantaat is parallel met het scheermesje gids en plaatsen van een scheermesje in een bladgeleiding ten minste 2 mm van het implantaat. Op het scheermes door het weefsel. Monteer dit oppervlak tot een vibratome platform. Alternalijk, een scheermesje gemonteerd op een micromanipulator kan worden gebruikt in een soortgelijke manier als de controle hersenen blok een vlak nauw overeenkomt met de richting van het implantaat te creëren.
- Plek ijs onder de vibratome platform en, nadat men de weefseloppervlak kort drogen op een papieren handdoek, de hersenen zich aan een vibratome met Super Glue. Lijm het platte vlak weefsel aangemaakt in de vorige stap is naar het podium. Met asymmetrische weefsel afmetingen, oriënteren de steekproef zodanig dat de breedste afmeting is gelijmd parallel naar beneden met de bewegingsrichting van de vibratome blad om te helpen voorkomen dat het blad potentieel kloppen het weefsel over. Nadat de lijm sets (~ 1-2 min), voeg gekoeld (~ 4 ° C) PBS vibratome de schaal rond het weefsel.
- Verzamel dikke weefselcoupes tussen 200-400 pm, met inbegrip van controle weefsel, met de maximale trillingssnelheid (~ 100 Hz) en een langzame mes progressie (<0,2 mm per seconde), met een blad hoek van 10 ° van horizontal. Zorgvuldig verzamelen plakken met een borstel of spatel schep en op te slaan in HBHS in een 24 wells plaat bij 4 ° C.
- Zodra het in situ apparaat zichtbaar met het blote oog of een chirurgische microscoop verzamelen dunnere secties van het apparaat benaderen slice stappen van 100 urn of minder.
Opmerking: Typische micromachining implantaten zichtbaar met het blote oog in formaldehyde gefixeerde knaagdier cerebrale cortex weefsel tussen 300 en 500 urn van het apparaat oppervlak.
- Met de in situ apparaat nu dicht bij het oppervlak van het weefsel, verzamel a> 250 urn weefsel slice met het apparaat binnen. Schatting van de noodzakelijke dikte kan worden ondersteund door verwijzing eerder verzamelde plakjes.
Opmerking: Grotere apparaten, meertands apparaten en schuine apparaten vereisen dikker weefsel plakjes (> 500 um) om het apparaat vast te leggen in een stuk weefsel; relid dat zowel de penetratie van de toegepaste labels en de microscopie beeldvorming diepte zal worden beperkt in de uiteindelijke dataverzameling van deze zeer dikke plakken. Indien mogelijk, vermijd het slaan van de inrichting met de vibratome mes, omdat dit kan leiden tot het slepen van het apparaat door het weefsel en morfologische vervorming.
4. Tissue Verwerking en Clearing
- Was de plakjes 3x op 5 min per wasbeurt in HBHS
- Incubeer in natriumboorhydride (5 mg NaBH4 / 1 ml van HBHS) gedurende 30 min totale (15 min elke zijde van het segment). Draai de plakjes met behulp van een roestvrij staal of teflon gecoat micro lepel en kleine penseel (Ted Pella). Langzaam en bedachtzaam bewegingen verbeteren van het succes van elke plak flip. Vermijd het aanraken van alle gebieden rond de geïmplanteerde apparaat met de borstel. Indien mogelijk, het toevoegen van aanzienlijk meer oplossing dan nodig is (> 2 ml) maakt het mogelijk om te manipuleren en klap de weefselcoupes gemakkelijker.
Opmerking: Deze stap endogene vermindert autofluorescentie; deze stap overslaan als fluorescerende labels werden toegepast tijdens perfusie of XFP transgene markers aanwezig zijn.
- Was 3x plakken op 5 min per wasbeurt in wasoplossing bij kamertemperatuur.
Opmerking: Agitatie tijdens het wassen en incubatiestappen is optioneel. De auteurs speculeren dat subtiele stoten van de stijve implantaat ten opzichte van het omringende hersenweefsel kan optreden onder roeren. Echter, een orbital mixer beweegt met een zachte snelheid (<60 rpm) vermijden en tegelijk de beweging van oplossingen.
- Blokkeren 2 uur in wasoplossing bij kamertemperatuur (flip plakken na een uur).
- Incubeer in primaire antilichamen (verdund in wasoplossing) gedurende ongeveer 48 uur (24 uur aan elke kant van het deel) bij 4 ° C.
- Voer 6 snelle 3 minuten wassen met Wash Solution.
- Voer 6, 1 uur wassen (3 washes aan elke kant van het weefsel slice) in wasoplossing (bewaar bij 4 ° C indien wassen nachts).
- Incubeer in secundaire antilichamen (verdund met wasoplossing) gedurende ongeveer 48 uur (24 uur per kant) in 4 ° C.
- Voer 6 snelle 3 minuten wassen met Wash Solution.
- Voer 6, 1 uur wassen (3 wasbeurten aan elke kant) in wasoplossing, bewaar bij 4 ° C of overnacht wassen.
- Verwijder wasoplossing en voeg de glycerol-based "U2 - Sca l e" clearing oplossing. Laat ongeveer 1 week duidelijk voor dikke plakken (250-500 um) of 2-3 weken bij zeer dikke coupes (> 500 um) bij 4 ° C.
- Afdekplaat met folie en bewaar bij 4 ° C.
- Monteer in dia's opvang dikke coupes (Figuur 2b, 2c) met behulp van clearing oplossing als de montage media en afdichten met duidelijke nagellak. Bewaren bij 4 ° C buiten invloed van licht.
5. Panorama Imaging van Full Tissue en Device Interface
- Met behulp van langere werkafstand microscoop doelstellingen (> 2 mm), beginnen beeldvorming met een laser scanning confocale microscoop of 2-foton microscoop. We zullen aantonen met een Zeiss LSM 710, Carl Zeiss "Zen"-software (2010), en een computer-gestuurde XY vertalen podium om het imago van een 3D-panorama rondom een implantaat.
Opmerking: Correcte de brekingsindex van de clearing oplossing ofwel in software, door een corrigerende kraag op het doel of in gegevensverwerkende na collectie. In deze demonstratie gaan we een brekingsindex waarde voor de "U2" clearing oplossing van 1,4 in de Leica Zen microscoop software; deze instelling subtiel past z-stappen van om rekening te houden brekingsindex mismatch.
- In weefsel bij het apparaat ongeveer het passende z-as venster en gegevensverzameling instellingen in de z-afmeting van elk kanaal met fluorescerende laag laservermogen (~ 00,5 tot 5%) en grote z-stapgrootte (> 25 pm).
Opmerking: aanvullende ruimte boven en onder het instellen van de z-as bij het opzetten voor panoramische gegevensverzameling, het weefsel niet volledig vlak op de objecthouder (~ 20 urn elke richting).
- Stel de doelstelling op het xy centrum van je uiteindelijke panorama, het gebruik van de Zen panorama-software, bepalen het aantal collectie posities die nodig is voor elke as (x en y) voor uw regio van belang zijn.
- Opnieuw te evalueren en afronding van de z-as collectie venster.
- Handmatig de detector gevoeligheid en laservermogen adequaat opvoeren met grotere diepte, het doel is typisch ongeveer handhaven hetzelfde beeld intensiteit ongeacht imaging diepte in het weefsel slice, maar ook voorkomen hoge achtergrondruisniveaus.
- Verzamel elke fluorescerende beeldgegevens serie. Indien nodig om te voorkomen dat overlappende signalen, voert laserlijns sequentieel.
Opmerking: Indien beschikbaar, moet u de software voor het automatisch opslaan van gegevens op de harde schijf tijdens het verzamelen.
- Verander de software-instellingen om de "reflectie" en "transmissie" gegevens te verzamelen, en gebruik een langere, meer penetrerende golflengte laser (bijv. 633 nm) om deze kanalen vast te leggen. Bepaal de juiste laservermogen en gevoeligheid van de melder voor "reflectie" en "transmissie" collectie en herhaal dezelfde collectie serie rond het geïmplanteerde apparaat.
- Exporteer de gegevens voor latere verwerking, kwantificering en analyse.
Representative Results
Brain-MMO geïmplanteerd kunnen worden verzameld in weefselcoupes door eerst scheiden elke schedel gemonteerde componenten uit de hersenen ingesloten onderdelen. Figuur 2a toont de resultaten van het verwijderen van een zijde van een tandheelkundig cement headcap en een gedeelte van Kwik-Sil rondom een kabel MEA een rat schedel. Een soldeerbout gebruikt om de tandheelkundig cement en Kwik-Sil verwijderen in een zuurkast. De bekabeling en niet-geïmplanteerde MEA structuren volgende geknipt met microscharen door langzaam uitgraven door de Kwik-Sil naar het oppervlak van de vaste hersenen.
Na het snijden, etikettering, en clearing weefsel, eenvoudig op maat gemaakte dia's zijn nuttig voor de montage van de dikke weefselcoupes (Figuur 2b). Een gemonteerde hersenen slice met een geïmplanteerde microdevice is weergegeven in figuur 2c. Imaging door weerszijden van de schuif kan toestaan om de interface te beoordelen in een inrichting, zoals in figuur 3 (fig. 3a) en microglia langs elektrodeplaatsen en sporen zijn zichtbaar op de andere zijde (figuur 3b).
Eens gemonteerd, kan weefsel worden afgebeeld met een XY translatietafel. Overzichten van fluorescerende labels in hele weefselcoupes kunnen worden gegenereerd op de gewenste resolutie (figuur 4). Gedetailleerd onderzoek van de morfologisch bewaard weefsel-interface rond geïmplanteerd Microdevices kunnen worden verzameld onder hoge vergroting voor de analyse van de lokale weefsel respons (Figuur 5).
Figuur 1. Overzicht van de procedure. (Ac) Brain micro-implantaat operaties zijn finaseerd met een laag Kwik-Sil polymeer onmiddellijke nabijheid van het apparaat, gevolgd door een botcement bekleding. (D, e) Na euthanasie wordt de acryllaag weggebrand en schedel gemonteerde onderdelen van de inrichting zijn gescheiden van geïmplanteerde onderdelen door door de silicone-elastomeer. (F, g) de hersenen wordt dan verwijderd uit de schedel en gesneden en gemonteerd op de stage vibratome. (Hk) weefselcoupes worden verzameld, zoals een tissue slice met het apparaat. (L) Weefsel kan dan worden verwerkt en gemonteerd in aangepaste kamers voor gedetailleerde microscopie. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. (A) Schakel Kwik-Sil siliconenelastomeer surrounding een elektrode-array kabel (pijl) is aangetoond door wegbranden een venster in de tandheelkundige cement dop op een geperfundeerde knaagdier kop met een soldeerbout. (B) geschikt in imaging weerszijden van een dikke plak weefsel, eenvoudig "slide-kamers" worden gemaakt door snijden van een plastic dia en aanhangend dekglaasje aan weerszijden in het weefsel en montage oplossing. (C) Een rat hersenweefsel segment met intact implantaat (rode pijl) wordt na montage. Aan weerszijden van het weefsel is snel toegankelijk is voor microscopie beeldvorming met deze setup. Voor schaal paneel (a) is 25 mm in de bodem, terwijl panels (b, c) zijn 80 mm in onderaan.
Figuur 3. Maximale intensity z-projecties van 40 urn dik afbeeldingsstapels, verzameld in de achterzijde (a) en voor (b) van een geïmplanteerde micro-elektrode array. Microglia (gelabeld met anti-Iba1 en Alexa Fluor 633, wit) en laser lichtreflectie (rood), vanuit het oppervlak van de inrichting, werden achtereenvolgens afgebeeld aan weerszijden van een 400 urn dikke plak weefsel. De hersenimplantaten vaak ondoorzichtig, montage met optische toegang tot beide zijden een duidelijk zicht gemerkte weefselstructuren "achter" het implantaat ten opzichte van het microscoopobjectief. Schaalbalk 50 pm.
Figuur 4. Een gelabelde DCHist slice afgebeeld met een computer gestuurde fase op een laser scanning confocale microscoop. (A) celkern (gekleurd met Hoechst 33342) en (b) monocyten / microglia(Gelabeld met anti-Iba1) gelijktijdig afgebeeld op een apart kanaal. (C) Transmission licht reflectie werden ook verzameld, die de plaats van de 4 weken implantaat ten opzichte van Hoechst en Iba1 data. (D) Overlay van alle kanalen maar de overdracht wordt ook getoond. De witte rechthoek gebied wordt uitgebreid in de beelden verschijnen aan de rechterkant. Scale bar 1 mm.
Figuur 5. Met een computergestuurde microscoop fase en geschikte software kunnen panoramisch beeld data worden verzameld rond het implantaat. Reflectie (a) en het doorlaten (b) het lokaliseren van de inrichting, terwijl fluorescent antilichaam of chemische labels (c, anti-Iba1 etikettering van microglia en macmacrofagen) kunnen gedetailleerde beeldvorming van weefsel componenten langs de intact weefsel interface. Scale bar 200 pm.
Discussion
De "Device-Capture Histologie" (DCHist) methode gedemonstreerd hier kan de nauwe histologische beoordeling van morfologisch bewaard interacties tussen hersenweefsel en weefsel implantaten. DCHist weefsel collectie vereist een zorgvuldige scheiding van de schedel te monteren interface componenten van componenten geïmplanteerd in de hersenen. DCHist vereist ook verzameling van een dikke histologische weefsel slice (> 250 pm). Deze weefselcoupes, eenmaal gelabeld, gewist, gemonteerd, en verbeelde, kan nieuwe inzichten in de implantatie letsel of de daaropvolgende chronische reactie op inwonende apparaten. Met geavanceerde microscopie gereedschap kan de interface tussen weefsel en inrichting worden afgebeeld en geanalyseerd hoge detail zoals getoond in figuren 3-5.
De gepresenteerde technieken in hun huidige vorm berusten op het vermogen om langzaam weg te graven headcap uit twee delen tandheelkundig cement en Kwik-Sil tot het punt van implantatie.Gebruik te maken van tandheelkundig cement dat kan worden verbrand of op andere wijze verwijderd en een duidelijke silicium elastomeer waardoor kleine schaar kan worden geleid visueel sterk helpen bij het succesvol scheiden van het geïmplanteerde apparaat uit zijn schedel gemonteerde componenten. Proberen het apparaat snijden onder de schedel en boven de hersenen om het op te halen in situ wordt niet aanbevolen, omdat de schedel gemonteerde implantaat zal worden getrokken uit de hersenen een aanzienlijk bedrag.
Hoewel dunnere, kleinere implantaten, zoals een enkele schacht MEA uit NeuroNexus Technologies, zijn het meest vatbaar voor DCHist, worden de principes niet beperkt tot enkel apparaat schachten of micro-elektrode arrays. Verzamelen en beeldvorming strategieën zijn breed toepasbaar om multi-schacht apparaten en grotere implantaten zoals canules, aan de eisen is dat ze moeten gescheiden zijn van de schedel mount en verzameld binnen een dikke weefselsectie. Hoewel de auteurs zijn gericht op de analyse van weefselsomliggende corticale implantaten, kunnen inrichtingen dieper in de hersenen ook worden verzameld en afgebeeld. De diepte van het inzetten van implantaten dienen het afvangen van het implantaat niet van invloed in een plakje mits het apparaat niet wild niet af van de bekende hoek van inbrengen.
Beperkingen bestaan de nuttige toepassing van de methode DCHist. Hersenweefsel secties zijn uitdagend om de afbeelding door honderden micrometers, in het bijzonder op het gebied van witte stof, hoewel optische clearing-oplossingen kan sterk verbeteren van beeldvorming diepten in verschillende weefsels 21. Ter verbetering van beeldvorming diepte, kunnen twee-foton excitatie microscopie worden gebruikt samen met de beschreven optische clearing.
Andere potentiële beperking van de beschreven methode kan de specifieke fluorescente immunohistochemie methoden en antilichamen die door onderzoekers. Passieve diffusie drijft meestal de integratie van deze markers door middel van vaste weefselen op antigeenbindingsplaatsen. Final antilichaam werken concentraties moeten worden bepaald door onderzoekers van geval tot geval te labelen penetratie te maximaliseren, terwijl het vermijden van een hoog niveau van achtergrond etikettering. Antilichaam labeling niet variabel tussen segmenten die identiek zijn verwerkt, maar verschillende antilichamen kunnen aanzienlijk variëren in hun vermogen om binnendringen en taggen hun antigeen met sommige antilichamen eenvoudig labelen antigenen honderden micrometers en andere antigenen etiketteren enkele tientallen micrometers. We beschrijven verbetering deze diffusie door toepassing antilichaam labels bij hogere dan normale concentraties voor meerdere dagen na het aanbrengen, en in een oplossing die verdund reinigingsmiddel en blokkeren serum. Periodiek flipping de plakjes bevordert ook nog labelen. Antigenen stappen en alternatieve fixatie processen (bijvoorbeeld glutaraldehyde, magnetron, etc.) kunnen geschikt zijn voor specifieke antigenen. Secundair antilichaam-fluorochrome conjugaten kunnen ook variëren in hun prestaties etikettering dikke secties, hoewel dit niet waargenomen door de auteurs met Alexa Fluor etiketten van Invitrogen. Als alternatief kunnen transgene proefdieren expressie fluorescerende eiwitten in de cel types van belang worden gebruikt om problemen met antilichaam label penetratie te vermijden, zoveel fluorescerende eiwitten, zoals eGFP hun fluorescentie verloren na formaldehyde therapie en onmiddellijk zichtbaar in weefselcoupes.
DCHist is een krachtige set van technieken om vast te leggen en te analyseren de impact van de geïmplanteerde microstructuren op hersenweefsel. Koppeling deze histologische protocol met in vivo evaluatie van de elektrofysiologie kwaliteit en impedantie van de elektrode gegevens 22 kan sterk verbeteren van ons begrip van de biologische bronnen van de fysiologie variabiliteit en afbraak. Het gebied van geïmplanteerde neurale prothesen in het bijzonder kunnen profiteren van de gedetailleerde DCHist imaGing van de intacte apparaat / weefsel interface voor de verdere ontwikkeling van biologisch neutrale MEA-apparaten op de hoogte.
Disclosures
De auteurs hebben geen relevante toelichtingen te verklaren, financieel of anderszins.
Acknowledgments
Alle experimenten werden uitgevoerd onder toezicht van de Purdue Animal Care en gebruik Comite en het Laboratory Animal Program aan de Purdue University.
Dit werk werd gesponsord door het Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Technology Office (MTO), onder auspiciën van dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) als onderdeel van de Betrouwbare Neural Technology Program, door middel van de Ruimte en Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No N66001-11-1-4013.
De auteurs willen graag Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor en Kevin Eliceiri bedanken voor het delen van hun microscopie expertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| H–chst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
| Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
| Equipment | |||
| Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
| Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
| Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
| Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
| Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
| Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
| Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
| 24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
| Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ’Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
| Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap | |
References
- Schwartz, A. B. Cortical Neural Prosthetics. Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).
- Normann, R. A. Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system. Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).
- Rousche, P., Normann, R. A. Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex. Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).
- Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation. Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).
- Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors. Hearing Research. 210, 112-117 (2005).
- Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).
- Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).
- Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants. J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).
- Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Research. 983, 23-35 (2003).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. J. Neural Eng. 6, 056003 (2009).
- Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays. J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).
- Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes. J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).
- Wilks, S. Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation. Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).
- Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances. IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).
- Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes. IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).
- Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology. Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Li, Y., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).
- Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces. J. Vis. Exp. (60), e3566 (2012).
