Summary
Her presenterer vi en histologisk metode for å fange, merking, optisk fjerne og bildebehandling intakt hjernevev grensesnitt rundt kronisk implanterte microdevices i gnager hjernevev. Resultater fra teknikkene omfatter denne metoden er nyttig for å forstå virkningen av ulike penetrerende hjerneskade-implantater på deres omkringliggende vev.
Abstract
Forskning i design og bruk av hjerne-implanterte microdevices som microelectrode matriser, har som mål å produsere klinisk relevante enheter som grensesnitt kronisk med omkringliggende hjernevev. Vev rundt disse implantatene er tenkt til å reagere på tilstedeværelsen av enhetene over tid, som inkluderer dannelsen av et isolerende "glial arr" rundt enhetene. Imidlertid er histologisk analyse av disse vevsforandringer typisk utført etter eksplantasjon enheten, i en prosess som kan forstyrre morfologi av vevet av interesse.
Her viser vi en protokoll der kortikale-implanterte enheter er samlet intakt i omkringliggende gnager hjernevev. Vi beskriver hvordan, når perfused med fiksativ blir hjernene fjernet og skiver på en slik måte at man unngår eksplantere enheter. Vi skissere fluorescerende antistoff merking og optiske clearing metoder nyttige for å produsere en informativ, men tykk vevdelen. Til slutt viser vi montering og avbildning av disse vevsdelene for å undersøke den biologiske grensesnittet rundt hjernen-implanterte enheter.
Introduction
Feltet av neuroprosthetic forskning som mål å hjelpe personer som lider av ulike funksjonshemninger og lidelser ved å omgå syke eller skadde strukturer i kroppen gjennom CNS grensesnitt enheter 1,2. Hjerne-implanterte microdevices som mikroelektroden arrays (MEAs), kan brukes til å ta opp eller stimulere hjernestrukturer, og dermed tillate etablering av langsiktige grensesnittene mellom elektronikk og CNS vev 3-5. Gjennomtrengende MEAs, enheter som er drevet inn i hjernevevet, hold særlig lovende som toveis grensesnitt grunnet nærhet innen hvilke de presenterer elektrodene til et relativt lite sett med nærliggende nevroner 6.
Men komplekse vev svar resultat fra den langsiktige implantasjon av gjennomtrengende MEAs, ofte resulterer i variable og gradvis nedverdigende elektrofysiologiske signal-til-støy-forhold over dager til måneder, og en økning i elektrisk impedlom elektrodestedene og bakken 7,8. De antatte opphavet til disse endringene inkluderer aktivering av microglia, reaktiv astrocytosis langs microdevices, og et tap eller migrasjon av nerveceller fra vevet rundt til implanterte enheter 9-11. En stor utfordring å forstå disse vevsforandringer rundt kroniske, penetrasjon MEAs er vanskeligheten i å ta histologiske data intakt vev-grensesnitt rundt kronisk implanterte enheter 12. Histologisk analyse av vev med enheten / vev-grensesnitt fortsatt til stede ville forbedre dagens enhet-fjerning histologiske protokoller. Med en uforstyrret enhet igjen i vevet, kan den biologiske virkningen av relativt subtile interaksjoner, for eksempel utnyttelse av biokompatible belegg 13,14 eller den elektriske clearing av elektrodeoverflaten 15,16, bli avbildet og analysert med hensyn til implantatet.
Here vi demonstrere en metode for å samle inn, bearbeide og bilde intakt microdevice grensesnitt for detaljert mikroskopi-analyse av det omkringliggende hjernevev. I denne metoden, blir enheten og omkringliggende hjernevev tatt innenfor en tykk (> 250 um) ved hjelp av en vevsdeler vibratome. For å forbedre histologiske etikett penetrasjon inn i disse tykke skiver, er fluorescerende histokjemiske og immunhistokjemisk etiketter påføres i høye konsentrasjoner i løsninger som inneholder blokkering serum og vaskemiddel for flere dager. En optisk clearingløsning er ansatt for å forbedre mikroskopi bildebehandling dybder, og vevet er montert i to-sidige kamre for påfølgende laserskanning konfokalmikroskopi 17. Å fange opp hele histologiske grensesnittet, er en datastyrt translasjonsforskning scenen brukes under fotografering for å samle z-stack panoramaer langs implantater. I tillegg til avbildning anvendt vev etiketter, samle laser reflektans tilbake fra implantaterog overføring lys gjennom vevet både hjelpe lokalisere enheten grensesnittet i forhold til omgivende vev. Tissue utarbeidet etter dette "Device-Capture Histologi" (DCHist) protokollen gir bildebehandling tilgang til morfologisk bevarte vev / enhet interaksjoner, og dermed forbedrer på tidligere enhet-fjerning histologiske protokoller 18.
Protocol
Løsninger
Fosfatbufret saltvann (PBS) - i g / l, 9 g NaCl, 0,144 g KH 2 4 PO, 0,795 g Na 2 HPO 4, ved pH 7,4
4% formaldehyd - i ml / l; 202 ml natrium dibasisk løsning (0,4 M Na 2 HPO 4), 48 ml natrium monobasisk løsning (0,4 M NaH 2 PO 4), 500 ml 8% formaldehyd-løsning, 250 ml Milli- Q DDi vann, ved pH 7,4
HEPES-bufret Hank saltløsning med natriumazid (HBHS) - i g / l, 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,06 g KH 2 4 PO, 0,13 g Na 2 HPO 4, 2 g glukose, 2,4 g HEPES, 0,05 g MgCl 2 6 deler H 2 O, 0,05 g MgSO 4 7 deler H 2 O, 0,165 g CaCl 2, 0,09 g NaN 3 ved pH 7,4
Vaskeløsning (WS) - 1% Vol / Vol, Normal Geit Serum, 0,3% Triton X-100, i HBHS med natriumazid (NaN 3). Kjøle vrangen ved 4 ° C før bruk i etterfølgende trinn.
U2 Sca l e Solution - 4 M urea, 30% glycerol og 0,1% Triton X-100 17
PROSEDYRE
Alle forsøk ble gjort under tilsyn av Purdue Animal Care og bruk komité og Laboratory Animal Program ved Purdue University.
1. Kirurgi
- Ulike aseptiske kirurgiske metoder er kompatible med den fremlagte histologiske metoden. Bruk av en stereotaksisk ramme og automatiserte inserters anbefales for å forbedre reproduserbarheten og kontroll av mikroelektroden arrays (MEA) implantasjon vinkel med hensyn til stereotaksiske flyene.
Merk: I denne demonstrasjonen vår kirurgiske metoden er som følger: hold gnager faget i stereotaksiske earbars while henhold isofluran bedøvelse (mellom 1-3%) som bæres av medisinsk karakter oksygen. Test for mangelen på en tå-klype reflektere i rotte eller mangel på en hale klype refleks hos mus for å bekrefte at dyret er fullt bedøvet. Påfør øyesalve og rengjør det kirurgiske området med tre vekslende vasker av Betadine og etanol. Vask hender, daggry kirurgiske hansker, hårnett, ansiktsmaske og kappe. Injisere en bolus av Lidocaine til nummen kirurgiske området, skape et snitt med saks eller en skalpell, klar periosteum med bein skraper og bomull applikatorer, og lage en kraniotomi ved hjelp av en dental drill håndstykket og boret. Kjør en enkelt-shank MEA i cortex ved hjelp av en micromanipulator. Ha en kirurgisk assistent hjelpemiddel i å opprettholde aseptiske kirurgi forhold og dokumentere fremdriften av operasjonen.
- Etter implantering av MEA i hjernen, samle bilder gjennom et kirurgisk mikroskop å informere den eventuelle fjerning av skallen fra rundt bregn. Implantert deler av enhetene vil bli bevart in situ.
Merk: Den endelige samling av vev med in situ enheter avhengig godt overens planet enhet innsetting med planet av vev snitting. Detaljerte notater om enheten innsetting plan i forhold til hjernen er således meget viktig.
- Etter at enheten implantasjon, bruke silikon elastomer Kwik-Sil (WPI), rundt utildekket MEA Shanks eller kabling, og la det herde. En sterilisert plastdelen, for eksempel et kutt pipettespiss, kan brukes til å bidra til å inneholde silikonelastomer i en liten godt rundt kraniotomi mens herding.
- Påfør et lag med to delers dental akryl ("Jet Flytende" og "Jet Powder" fra Lang Dental) over Kwik-Sil og utildekket skallen.
Merk: I et senere trinn, vil ventilen være smeltet gjennom for å tillate implantatet som skal separeresfra skallen. UV-herding akryl bør unngås over Kwik-Sil og kraniotomi, som dette svært vanskelig akryl er vanskelig å fjerne senere. Visuelt ugjennomsiktige materialer rundt implantatet bør også unngås, klar Kwik-Sil gir en visning av implantatet under etterfølgende trinn i denne protokollen.
- Utfør postoperative omsorg prosedyrer som per den lokale protokoll over de dyrevelferdsmessige regelverket, og returnere ambulerende fag til single-huset bur-bokser.
2. Perfusjon og Tissue Collection
Merk: Se Gage et al. for en detaljert perfusjon prosedyre gjennomgang i rotte dyremodell 19.
- Bruk anestesi og perfusjon protokoll godkjent av institusjonens dyr omsorg og bruk komité. Etter dypt bedøvelse gnager (bekreftet av en mangel på tå-pinch refleks i rotte eller hale-pinch refleks hos mus) og utsette hjertet, gjør grunne scissor kutt itil venstre ventrikkel og høyre atrium. Sett inn en stump nål inn i venstre hjertekammer og levere rom temp PBS. Totalt levere ~ 10 ml PBS ved ~ 5 ml / min i mus og ~ 200 ml PBS ved ~ 100 ml / min i rotter. Se etter blodclearance fra leveren under.
- Injiser histologisk relevante kjemiske etiketter transcardially, hvis det er ønskelig, med sprøyte levering med omtanke for å unngå å introdusere bobler.
Merk: Vaskulær merker (f.eks DII) og nukleinsyre counterstain fargestoffer (f.eks Hoechst 33342) er eksempler på kjemiske etiketter leveringspliktig under perfusjon. Når administrert riktig, bør disse histologiske markører merke hele dyret 20.
- Lever bufret, romtemperatur, 4% formaldehyd transcardially å fikse dyret. Unngå septum perforering gjennom hjertet, noe som kan bekreftes ved lunge-nese drenering under perfusjon. Se etter fiksering skjelv i de store muskleneå indikere komplett perfusjon. Totalt levere ~ 10 ml fiksativ på ~ 5 ml / min hos mus og ~ 200 ml fiksativ på ~ 100 ml / min hos rotter.
- Etter perfusjon, halshogge dyret, eksponere en del av hjernestammen eller cerebellum hjelp Rongeurs eller saks, og sted hodet i 4% formaldehyd-løsning for natten ved 4 ° C.
- Vask hodet i tre endringer av PBS med 1-4 timers intervaller mellom hver vask.
- Lagre faste hoder i HBHS inneholder natriumazid ved 4 ° C i flere dager til måneder.
3. Brain Removal med in situ enheter
Merk: Utfør denne delen i et avtrekksskap mens iført egnet personlig verneutstyr. Unngå vev uttørking ved å returnere fast hodet til HBHS løsning med jevne mellomrom.
- Nøye dissekere bort huden og annet vev fra hele akryl skull cap med pinsett og små saks.
- Mens iført varme-insensitive hansker, bruke en loddebolt for å fjerne dental akryl og avsløre et område av underliggende klar Kwik-Sil (Figur 2a).
Merknad: Målet med dette trinnet er å tillate mikro-saks passende vinkel av tilgang til posisjoner hvor de implanterte enheter inn i hjernen, slik at hjerne-implanterte komponenter kan skilles fra komponenter festet til skallen.
- Under et kirurgisk mikroskop, kutt i silikonelastomer med buede mikro-saks, fjerne små biter av Kwik-Sil med pinsett ned til den stilling hvor enhetene inn i hjernen.
- Fortsett sagingen langs overflaten av kraniotomi med buede mikro-saks til separat enhet komponenter festet til polysilisium og skallen fra komponenter implantert i hjernen. Igjen bruke mikroskop forstørrelse og stor forsiktighet når du skjærer gjennom de utsatte enhetens komponenter, ta vare å unngå å skyve eller dra implants i fast vev.
- Fjern bein rundt ventilen med forsiktighet ved hjelp Rongeurs. Bruk en slikkepott til å skille hjernen med implanterte enheter fra skallen. Oppbevar hjernen i HBHS løsning inntil klar til å skjære.
- Plasser hjernen i et glass Petriskål fylt med HBHS, og bruke et barberblad for å fjerne overflødig vev, så som ryggmarg, lillehjernen eller luktelappen, avhengig av om de er relevante for plasseringen av enheten implantasjon. Bruk en hjerne blokk (Ted Pella) og barberblad § hjernen og opprette et flatt plan som stemmer godt overens vinkelen på implanterte enheter, og dette oppnås ved å plassere hjernen i en passende størrelse hjerne blokk, orientere hjernen slik at enhver synlige delen av implantatet som er parallell med barberblad guide, og plassere et barberblad i en Knivbladbeskyttelsen minst 2 mm fra implantatet. Trykk på barberbladet gjennom vevet. Montere denne overflate til en vibratome plattform. Alternaholdsvis montert et barberblad for å en mikromanipulator kan brukes i en tilsvarende kontrollert måte som hjernen blokken for å opprette en plan godt overens retningen av implantatet.
- Sted isen under vibratome plattformen, og etter slik at vevet overflaten kort tørk på et papirhåndkle, holder hjernen til en vibratome hjelp superlim. Lim flat vev flyet ble opprettet i forrige trinn er å scenen. Med asymmetriske vev dimensjoner, orientere prøven slik at den bredeste dimensjon limes ned parallelt med bevegelsen retning vibratome bladet å unngå bladet potensielt banket vevet over. Etter at limet settene (~ 1-2 min), tilsett avkjølt (~ 4 ° C) PBS til vibratome parabolen rundt vevet.
- Utlevering tykke vevet stykker mellom 200-400 um, inkludert kontroll vev, ved hjelp av den maksimale vibrasjons hastighet (~ 100 Hz) og en langsom blad progresjonshastigheten (<0,2 mm per sekund), med et blad vinkel på 10 ° fra horizontal. Samle skivene forsiktig med en børste eller scoop spatel og lagre i HBHS i en 24 brønners plate ved 4 ° C.
- Når in situ enheten er synlig for det blotte øye eller en kirurgisk mikroskop, samle tynnere seksjoner å nærme enheten i slice trinn på 100 mikrometer eller mindre.
Merk: Typiske silisium mikro-implantater er synlige med det blotte øye i formaldehyd-fast gnager cerebral cortex vev mellom 300 og 500 mikrometer fra utstyrets overflate.
- Med in situ enheten nå nær overflaten av vevet, samler en> 250 mikrometer vev stykke inneholder enheten innen. Beregning av den nødvendige tykkelsen kan bli hjulpet ved å referere tidligere innsamlede skiver.
Merk: Større enheter, multishank enheter og vinklede enheter kan kreve tykkere vev skiver (> 500 mikrometer) for å fange enheten i én vev stykke; remedlem som både inntrengning av anvendt etiketter og mikroskopi bildebehandling dybde vil være begrenset i den endelige datainnsamlingen fra disse svært tykke skiver. Hvis det er mulig, unngå å slå enheten med vibratome bladet, da dette kan føre dra av enheten gjennom vevet og morfologiske deformasjon.
4. Tissue Processing og Clearing
- Vask skiver 3x på 5 min per vask i HBHS
- Inkuber i natriumborhydrid (5 mg NaBH 4/1 ml HBHS) i 30 min totalt (15 min hver side av stykket). Vend skivene ved hjelp av en rustfritt stål eller Teflon belagt mikro skje og liten pensel (Ted Pella). Langsomme og gjennomtenkt bevegelser forbedre suksessen av hver skive flip. Unngå å berøre områder rundt den implanterte enheten med børsten. Når det er mulig, og legger betydelig mer løsning enn nødvendig (> 2 ml) gjør det mulig å manipulere og snu vev skiver lettere.
Merk: Dette trinnet reduserer endogen autofluorescens; hoppe over dette trinnet hvis fluorescerende etiketter ble brukt under perfusjon eller XFP transgene markører er til stede.
- Vask skiver 3x på 5 min per vask i vaskeløsning ved romtemperatur.
Merknad: Agitasjon under vask og inkubering skritt er valgfritt. Forfatterne spekulerer i at subtile risting av stiv implantatet med hensyn til det omgivende hjernevev kan forekomme med omrøring. Imidlertid kan en orbital mixer i bevegelse på en skånsom hastighet (<60 rpm) unngå dette samtidig øke bevegelsen av løsninger.
- Blokker i 2 timer i vaskeløsning ved romtemperatur (flip stykker etter en time).
- Inkuber i primære antistoffer (fortynnet i vaskeløsning) i ca 48 timer (24 timer på hver side av stykket) ved 4 ° C.
- Gjør 6 raske 3 min vasker med vaskeløsning.
- Gjør 6, 1 hr vasker (3 vaskes på hver side av vevet stykke) i vaskeløsning (oppbevares ved 4 ° C dersom vasking over natten).
- Inkuber i sekundære antistoffer (fortynnet med vaskeløsning) i ca 48 timer (24 timer på hver side) i 4 ° C.
- Gjør 6 raske 3 min vasker med vaskeløsning.
- Gjør 6, 1 hr vasker (3 vasker på hver side) i vaskeløsning, oppbevar ved 4 ° C hvis vask over natten.
- Fjern Vaskeløsning og legg til glyserol-baserte "U2 - Sca l e" clearing løsning. Tillat å fjerne ca 1 uke for tykke skiver (250-500 um), eller 2-3 uker for svært tykke vevssnitt (> 500 um) ved 4 ° C.
- Dekkplate med folie og oppbevar ved 4 ° C.
- Montere i lysbilder imøtekommende tykke vevet seksjoner (Figur 2b, 2c) bruker clearing løsning som montering media og forsegling med klar neglelakk. Oppbevar ved 4 ° C vekk fra lys.
5. Panorama Imaging of Full Tissue og Device Interface
- Bruke lengre arbeidsavstand mikroskopet mål (> 2 mm), begynner avbildning med en laser scanning confocal mikroskop eller to-foton mikroskop. Vi vil demonstrere med en Zeiss 710 LSM, Carl Zeiss "Zen"-programvaren (2010), og en datastyrt XY oversette scenen til bilde en 3D panorama rundt et implantat.
Merknad: Correct for brytningsindeksen av clearing løsningen enten i programvare, gjennom en korrigerende krage på et mål eller på databehandlings etter oppsamling. I denne demonstrasjonen går vi en brytningsindeks verdi for "U2" clearing løsning på 1,4 i Leica Zen mikroskop programvare, denne innstillingen subtilt justerer z-trinn mellomrom å ta hensyn til brytningsindeks mismatch.
- I vev i nærheten av enheten, omtrent vurdere de aktuelle z-aksen vindu og datainnsamling innstillinger i z-dimensjon for hver fluoriserende kanal med lav laser makt (~ 00,5 til 5%) og store z-trinn størrelser (> 25 um).
Merk: har ekstra plass over og under ved innstilling z-aksen når sette opp for panoramisk datainnsamling, som vevet ikke kan ligge helt flatt på lysbildet glass (~ 20 mikrometer hver retning).
- Setter som mål på xy sentrum av eventuelt panorama, med Zen panorama programvare, bestemme antall samlingen stillinger kreves for hver akse (x og y) for å dekke din region av interesse.
- Revurdere og sluttføre z-aksen samling vinduet.
- Manuelt stille detektorens følsomhet og laser makt til rampen hensiktsmessig med større dybde, målet er typisk for å opprettholde tilnærmet samme bildeintensitet uansett bildebehandling dybde i vevet stykke, men også å unngå høy bakgrunnsstøy.
- Samle alle fluorescerende bilde dataserier. Om nødvendig for å unngå overlapping signaler, kjøre laserlinjes sekvensielt.
Merk: Hvis tilgjengelig, satt opp programvaren for automatisk å lagre data til harddisken under innsamling.
- Endre programvareinnstillingene å samle "refleksjon" og "transmisjon" data, og bruke en lengre, mer gjennomtrengende bølgelengde laser (f.eks 633 nm) for å fange disse kanalene. Avgjøre hvilken laser makt og detektorens følsomhet for "refleksjon" og "transmittans" samling og gjenta den samme samlingen serie rundt den implanterte enheten.
- Eksportere dataene for senere behandling, kvantifisering og analyse.
Representative Results
Hjerne-implanterte MEAs kan samles i vev skiver etter hverandre først noen skull-monterte komponenter fra hjerne-innebygde komponenter. Figur 2A viser resultatene av å fjerne en side av en dental sement ventilen og en del av Kwik-Sil omgir en MEA kabel på en rotte skallen. En loddebolt ble brukt til å fjerne dental sement og Kwik-Sil i et avtrekksskap. Kablene og noen ikke-implantert MEA strukturer ble neste kuttet med mikro-saks ved langsomt utgraving gjennom Kwik-Sil ned til overflaten av den faste hjernen.
Etter kutting, merking og rydding vev, enkle skreddersydde lysbilder er nyttige for montering av tykke vevet skiver (Figur 2b). En montert hjerne stykke inneholdende en implantert microdevice er vist i figur 2c. Imaging gjennom hver side av lysbildet kan tillate deg å vurdere grensesnittet rundt en enhet, som vist i Figur 3 (figur 3a) og mikroglia langs elektrodestedene og spor er synlige på den andre siden (figur 3b).
Når montert, kan vev avbildes ved hjelp av en XY oversettelse scenen. Oversikter over fluorescerende etiketter på tvers hele vev skiver kan genereres på ønsket oppløsning (figur 4). Detaljert undersøkelse av morfologisk bevarte vev grensesnitt rundt implanterte microdevices kan samles under høy forstørrelse for analyse av den lokale vevsrespons (figur 5).
Figur 1. Oversikt over prosedyren. (Ac) Brain mikro-implantatet surgeries er finalized med et lag av Kwik-Sil polymer umiddelbart rundt enheten, etterfulgt av en akryl sement dekker. (D, e) Etter eutanasi, er akryl laget brent bort, og skull-monterte komponenter på enheten er adskilt fra implantert komponenter ved å kutte gjennom silikonelastomer. (F, g) Hjernen fjernes deretter fra skallen og er skåret og montert til vibratome scenen. (Hk) Tissue skiver er samlet inn, blant annet en vev skive som inneholder enheten. (L) Vev kan deretter bli behandlet og montert i tilpassede rom, for detaljert mikroskopi. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. (A) Fjern Kwik-Sil silikonelastomer surrounding en elektrode-array kabel (pil) har vært utsatt ved å brenne bort et vindu i dental sement hetten på en perfusjon gnager hodet med en loddebolt. (B) for å imøtekomme avbildning til enten side av en tykk vev skive, enkel "slide-kamre" kan gjøres ved å kutte en plast lysbilde og man følger coverglass til hver side rundt vevet og montering løsning. (C) En rotte hjernevev stykket med intakt implantat (rød pil) er vist etter montering. Hver side av vevet er raskt tilgjengelig for mikroskopi bildebehandling med dette oppsettet. For målestokk, er panel (a) 25 mm over på bunnen, mens paneler (b, c) er 80 mm på tvers nederst.
Figur 3. Maksimum intensity z-projeksjoner av 40 mikrometer tykke image stakker, samlet rundt baksiden (A) og fremre (b) av en implantert mikroelektroden matrise. Microglia (merket med anti-Iba1 og Alexa 633 Fluor, hvit) og laser lysrefleksjon (rød), oppsamlet fra overflaten av enheten, ble sekvensielt avbildes fra begge sider av en 400 um tykk vev skive. Som hjernen implantater er ofte ugjennomsiktig, montering med optisk adgang til begge sider gir en klar visning av merkede vevsstrukturer "bak" implantatet med hensyn til mikroskopet målet. Målestokk 50 mikrometer.
Figur 4. En merket DCHist stykke avbildes ved hjelp av en datastyrt scenen på en laserskanning confocal mikroskop. (A) cellekjerner (farget med Hoechst 33342) og (b) monocytter / microglia(Merket med anti-Iba1) ble samtidig avbildes på separate kanaler. (C) Overføring lys og reflektans ble også oppsamlet, som viser plasseringen av den 4-ukers implantat med hensyn til Hoechst og Iba1 data. (D) Overlegg av alle kanaler, men overføring er også vist. Det hvite rektangel område utvides i bildene vises til høyre. Skala bar 1 mm.
Figur 5. Ved hjelp av en datastyrt mikroskop scenen og passende programvare, kan panoramautsikt imaging data samles rundt implantatet. Refleksjon (a) og transmittans (b) tillate lokalisering av enheten, mens fluorescerende antistoff eller kjemiske etiketter (c, anti-Iba1 merking av mikroglia og macrophages) muliggjør detaljert avbildning av vevskomponenter langs intakt vev. Målestokk 200 mikrometer.
Discussion
"Enhet-Capture Histologi" (DCHist) metoden demonstrert her gjør den nære histologiske undersøkelser av morfologisk bevarte interaksjoner mellom hjernevev og vev implantater. DCHist vev samlingen krever nøye separasjon av skallen takmonterte enhetens komponenter fra komponenter implantert i hjernen. DCHist krever også samling av en tykk histologisk vev skive (> 250 mm). Disse vev seksjoner, en gang merket, ryddet, montert, og avbildes, kan gi ny innsikt i implantering skade eller påfølgende kronisk respons på inneliggende enheter. Bruk av avanserte mikroskopi verktøy, kan grenseflaten mellom vev og enheten avbildes og analysert i høy detalj som vist i fig 3-5.
De presenterte teknikkene i sin nåværende form stole på evnen til å langsomt utgrave bort ventilen laget todelte dental sement og Kwik-Sil ned til et punkt på enheten implantasjon.Utnytte dental sement som kan brennes bort eller på annen måte fjernet, og en klar silisium elastomer hvorigjennom liten saks kan ledes visuelt stor hjelp i vellykket skille implanterte enheten fra dens skull-monterte komponenter. Forsøk på å kutte enheten under skallen og over hjernen for å samle det i situ anbefales ikke, da skallen montert implantat vil bli trukket ut av hjernen et betydelig beløp.
Selv tynnere, mindre implantater, som for eksempel enkelt skaft MEAs fra NeuroNexus Technologies, er mest mottagelig for DCHist er prinsippene ikke begrenset til én enhet shanks eller mikroelektroden matriser. Innsamling og bildebehandling strategier er bredt gjeldende for multi-shank enheter og større implantater som kanyler, med de krav er at de må skilles fra noen skallen mount og samlet i en tykk vev delen. Selv om forfatterne er fokusert på analyse av vevomkringliggende corticale implantater, kunne enheter drevet dypere inn i hjernen også samles og avbildes. Dybden av implantatet innsetting bør ikke påvirke fangst av implantatet i et stykke, forutsatt at enheten ikke avviker vilt fra den kjente vinkelen innsetting.
Begrensninger eksisterer til nyttige anvendelse av DCHist metoden. Hjernevev seksjoner er utfordrende å bilde gjennom hundrevis av mikrometer, spesielt i områder med hvit substans, selv om optiske clearing løsninger kan forbedre bildebehandling dyp i ulike vev 21. For ytterligere å forbedre avbildning dybde, kan to-foton eksitasjon mikroskopi anvendes sammen med den optiske clearing beskrevet.
En annen potensiell begrensning av den beskrevne metoden kan være den spesifikke fluorescerende immunhistokjemi metoder og antistoffer ansatt av forskere. Passiv diffusjon stasjoner vanligvis inkorporering av disse markørene gjennom fast vevog bort antigenbindende områder. Endelige antistoff arbeider konsentrasjoner må bestemmes av forskere på en sak til sak for å maksimere etiketten penetrasjon samtidig unngå høye nivåer av bakgrunnen merking. Antistoff merking bør ikke være variabel mellom skiver som behandles identisk, men forskjellige antistoffer kan variere betydelig i deres evne til å penetrere og tagge antigen, med noen antistoffer lett merking antigener mange hundre mikrometer dype og andre merking antigener bare titalls mikrometer dype. Vi beskriver forbedre denne diffusjon ved å påføre Antistoffet merker på høyere enn typiske konsentrasjoner, for flere dager for påføring, og i en oppløsning som inneholder fortynnet vaskemiddel og blokkerer serum. Periodisk å vippe skiver fremmer også selv merking. Antigen henting trinn og alternative fiksering prosesser (f.eks glutaraldehyd, mikrobølgeovn, etc.) kan være hensiktsmessig for spesifikke antigener. Sekundært antistoff-fluorochrome konjugater kan også variere i resultatene deres merking tykke seksjoner, selv om dette ikke har blitt observert av forfatterne bruker Alexa Fluor etiketter fra Invitrogen. Alternativt kan transgene dyr fag uttrykker fluorescerende proteiner i celletyper av interesse anvendes til å unngå problemer med antistoff etikett penetrasjon, som mange fluorescerende proteiner, slik som eGFP, beholder sin fluorescens etter formaldehyd behandling, og kan være umiddelbart visualisert i vevssnitt.
DCHist er et kraftig sett med teknikker for å fange opp og analysere virkningen av implanterte microdevices på hjernevev. Kopling dette histologiske protokoll med in vivo vurdering av elektrofysiologi kvalitet og elektrode impedans data 22 kunne forbedre vår forståelse av de biologiske kilder fysiologi variasjon og fornedrelse. Feltet av implanterte neural proteser særlig kan ha nytte av den detaljerte DCHist imaging av det intakte enhet / vev grensesnitt for å informere videre utvikling av biologisk nøytrale MEA enheter.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante opplysninger for å erklære, økonomisk eller på annen måte.
Acknowledgments
Alle forsøk ble gjort under tilsyn av Purdue Animal Care og bruk komité og Laboratory Animal Program ved Purdue University.
Dette arbeidet ble sponset av Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Technology Office (MTO), i regi av Dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) som en del av Pålitelig Neural Technology Program, gjennom Space and Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No N66001-11-1-4013.
Forfatterne ønsker å takke Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor og Kevin Eliceiri for å dele sine mikroskopi kompetanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| H–chst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
| Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
| Equipment | |||
| Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
| Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
| Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
| Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
| Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
| Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
| Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
| 24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
| Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ’Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
| Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap | |
References
- Schwartz, A. B. Cortical Neural Prosthetics. Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).
- Normann, R. A. Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system. Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).
- Rousche, P., Normann, R. A. Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex. Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).
- Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation. Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).
- Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors. Hearing Research. 210, 112-117 (2005).
- Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).
- Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).
- Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants. J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).
- Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Research. 983, 23-35 (2003).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. J. Neural Eng. 6, 056003 (2009).
- Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays. J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).
- Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes. J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).
- Wilks, S. Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation. Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).
- Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances. IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).
- Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes. IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).
- Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology. Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Li, Y., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).
- Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces. J. Vis. Exp. (60), e3566 (2012).
