Summary
Aquí presentamos un método histológico para captar, etiquetar, limpiar óptica y las imágenes de la interfaz cerebro intacto el tejido alrededor de microdispositivos crónicamente implantados en el tejido cerebral de roedor. Los resultados de las técnicas que comprenden este método son útiles para comprender el impacto de diversos penetrantes del cerebro-implantes en su tejido circundante.
Abstract
La investigación sobre el diseño y la utilización de los microdispositivos implantados cerebro, tales como matrices de microelectrodos, apunta a producir dispositivos clínicamente relevantes que interactúan crónicamente con el tejido cerebral circundante. Tejido que rodea estos implantes se cree que reaccionan a la presencia de los dispositivos en el tiempo, que incluye la formación de un aislante "cicatriz glial" alrededor de los dispositivos. Sin embargo, el análisis histológico de estos cambios en el tejido se realiza normalmente después de la explantación del dispositivo, en un proceso que puede alterar la morfología del tejido de interés.
Aquí se demuestra un protocolo en el que corticales-implantados dispositivos se recogen intacta circundante en tejido cerebral de roedor. Se describe cómo, una vez que se perfundieron con fijador, los cerebros se retiran y rodajas de tal manera como para evitar dispositivos de explantación. Esbozamos etiquetado de anticuerpos fluorescentes y los métodos ópticos de compensación útiles para producir un tejido informativo, pero de espesorsección. Por último, demostrar el montaje y las imágenes de estas secciones de tejido con el fin de investigar la interfaz biológica alrededor cerebrales implantados dispositivos.
Introduction
El campo de la investigación neuroprosthetic objetivo es ayudar a personas que sufren de diferentes discapacidades y trastornos sin pasar por las estructuras dañadas o enfermas en el cuerpo a través de interfaz CNS 1,2 dispositivos. Microdispositivos implantados cerebro, tales como matrices de microelectrodos (MEA), se puede utilizar para grabar o estimular las estructuras del cerebro, y por lo tanto permitir el establecimiento de largo plazo interfaces entre la electrónica y el tejido del SNC 3-5. AMA penetrantes, dispositivos que son accionados en el tejido cerebral, mantienen la promesa particular como interfaces bidireccionales debido a la estrecha proximidad dentro de la que presentan electrodos para un conjunto relativamente pequeño de las neuronas cercanas 6.
Sin embargo, el tejido complejo resultado respuestas de la implantación a largo plazo de los AMA penetrantes, resultando a menudo en variables electrofisiológicas y degradantes gradualmente señal-a-ruido más de días a meses, y un aumento en la impedancia eléctricaequilibrio entre zonas de los electrodos de tierra y 7,8. Los orígenes putativos de estos cambios incluyen la activación de la microglia, astrocitosis reactiva a lo largo de los microdispositivos, y una pérdida o la migración de las neuronas desde el tejido que rodea a los dispositivos implantados 9-11. Un reto importante para la comprensión de estos cambios en el tejido alrededor de crónicas MEAs de penetración, es la dificultad en la captura de los datos histológicos de la interfaz de tejido intacto que rodea dispositivos implantados crónicamente 12. El análisis histológico de los tejidos con la interfaz de dispositivo / tejido todavía presente se mejora sobre los actuales protocolos de eliminación de dispositivo-histológicos. Con un dispositivo sin perturbaciones queda en el tejido, el efecto biológico de interacciones relativamente sutiles, tales como la utilización de recubrimientos biocompatibles 13,14 o la compensación eléctrica de la superficie del electrodo 15,16, podría ser reflejado y se analizaron con respecto al implante.
Here que demostrar un método para recopilar, procesar, y la imagen de la interfaz microdispositivo intacto para microscopía detallado basado en el análisis del tejido cerebral circundante. En este método, el dispositivo y el tejido circundante del cerebro se recogen dentro de una sección de tejido grueso (> 250 m) usando un vibratome. Para mejorar la penetración de etiqueta histológico en estas rodajas gruesas, las etiquetas fluorescentes histoquímicos e inmunohistoquímicos se aplican a altas concentraciones en soluciones que contienen suero de bloqueo y detergente para varios días. Una solución de aclaramiento óptico se emplea para mejorar profundidades de microscopía, y el tejido se monta en 2-caras cámaras de láser subsiguiente microscopía confocal de barrido 17. Para capturar la interfaz histológica completa, una etapa de traslación controlada por ordenador se utiliza durante la formación de imágenes para recoger pila Z panoramas a lo largo de la longitud de los implantes. Además de la proyección de imagen aplicado las etiquetas de tejido, recogiendo reflectancia láser de vuelta de los implantesy la transmisión de luz a través del tejido tanto ayudar a localizar el dispositivo de interfaz en relación al tejido circundante. Tejido elaborado con este "dispositivo de captura de Histología" (DCHist) protocolo proporciona acceso a imágenes de los tejidos conservados morfológicamente / dispositivo interacciones, y por lo tanto mejora las anteriores dispositivo de eliminación de los protocolos histológicos 18.
Protocol
Soluciones
Tampón fosfato salino (PBS) - en g / l; 9 g de NaCl, 0,144 g de KH 2 PO 4, 0,795 g de Na 2 HPO 4, a pH 7,4
4% de formaldehído - en ml / l; 202 ml de fosfato dibásico de sodio solución (0,4 M Na 2 HPO 4), 48 ml de solución de fosfato monobásico de solución (0,4 M NaH 2 PO 4), 500 ml de solución de formaldehído 8%, 250 ml Milli- Q DDi agua, a pH 7,4
HEPES solución salina tamponada de Hank con azida de sodio (HBHS) - en g / l; 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,06 g de KH 2 PO 4, 0,13 g de Na 2 HPO 4, 2 g de glucosa, 2,4 g de HEPES, 0,05 g de MgCl 2 6 partes de H 2 O, 0,05 g MgSO 4 7 piezas H 2 O, 0,165 g de CaCl 2, 0,09 g NaN 3 a pH 7,4
Solución de lavado (WS) - 1% vol / vol, NiEl suero normal de cabra, 0,3% Triton X-100, en HBHS con azida de sodio (NaN 3). Refrigerar la WS a 4 ° C antes de su uso en los pasos subsiguientes.
U2 Sca l solución E - 4 M de urea, 30% de glicerol y 0,1% de Triton X-100 17
PROCEDIMIENTO
Todos los experimentos se realizaron bajo la supervisión del Cuidado de Animales y el empleo Comisión de Purdue y el Programa de Animales de Laboratorio de la Universidad Purdue.
1. Cirugía
- Varios métodos quirúrgicos asépticos son compatibles con el método presentado histológico. El uso de un marco estereotáxico y insertadores automatizados se recomiendan para mejorar la reproducibilidad y el control de ángulo de las matrices de microelectrodos (MEA) de la implantación con respecto a los planos estereotáxica.
Nota: En esta demostración de este método quirúrgico es el siguiente: mantener el tema de roedores en estereotáxica noc earbarse bajo anestesia isoflurano (% entre 1-3) llevado por el oxígeno de grado médico. Prueba para la falta de un dedo del pie-aplastamiento reflejan en la rata o la falta de un reflejo de pinzamiento del rabo en el ratón para confirmar que el animal esté totalmente anestesiado. Aplicar ungüento para los ojos y limpiar el sitio quirúrgico con tres lavados alternos de Betadine y etanol. Lavarse las manos, guantes quirúrgicos, amanecer redecilla, mascarilla y bata. Se inyecta un bolo de lidocaína para adormecer el área quirúrgica, crea una incisión con tijeras o un bisturí periostio y claro con un raspador de hueso y aplicadores de algodón, y crear una craneotomía utilizando una pieza de mano taladro dental y la broca. Conducir un MEA solo vástago en la corteza utilizando un micromanipulador. Tener un asistente quirúrgico ayuda en el mantenimiento de las condiciones asépticas cirugía y documentar el progreso de la cirugía.
- Tras la implantación de la MEA en el cerebro, recoger imágenes a través de un microscopio quirúrgico para informar a la eliminación eventual del cráneo de todo el blluvia. Porciones de los dispositivos implantados se conservarán in situ.
Nota: La colección eventual del tejido con dispositivos en situ se basa en sigue muy de cerca al plano de la inserción del dispositivo con el plano de seccionamiento del tejido. Notas detalladas sobre el plano de la inserción del dispositivo en relación con el cerebro son, pues, muy importante.
- Después de la implantación del dispositivo, aplicar el elastómero de silicona Kwik-Sil (WPI), en torno a cualquier vástagos expuestos MEA o cableado, y deje curar. Una pieza de plástico esterilizada, tal como una punta de pipeta de corte, se puede utilizar para ayudar a contener el elastómero de silicona en un pequeño pozo alrededor de la craneotomía mientras que el curado.
- Aplique una capa de dos piezas de acrílico dental ("Liquid Jet" y "Polvo Jet" de Lang Dental) en el Kwik-Sil y cualquier cráneo expuesto.
Nota: En un paso posterior, el casquete se funde a través para permitir que el implante se separadel cráneo. De curado UV acrílico debe ser evitado durante el Kwik-Sil y la craneotomía, como esta acrílico muy duro es difícil de eliminar después. Materiales visualmente opaco alrededor del implante también deben ser evitados; claro Kwik-Sil proporciona una vista del implante durante los pasos posteriores de este protocolo.
- Lleve a cabo después de la operación los procedimientos de atención de acuerdo con el protocolo local de las normas de bienestar animal, y volver a sujetos ambulatorios alojados individualmente jaula cajas.
2. Perfusión y la recogida de tejidos
Nota: Consulte Gage et al. para un recorrido de perfusión procedimiento detallado en el modelo animal de rata 19.
- El uso de la anestesia y el protocolo de perfusión aprobado por el cuidado de animales de la institución y el empleo. Después de anestesiar profundamente el roedor (confirmado por la falta de reflejo dedo del pie-pinch en rata o estricción de rabo reflejo en ratones) y exponer el corazón, hacer cortes poco profundos en tijerahasta el ventrículo izquierdo y la aurícula derecha. Insertar una aguja roma en el ventrículo izquierdo y entregar temperatura de la habitación PBS. Entregar un total de ~ 10 ml de PBS a ~ 5 ml / min en ratones y ~ 200 ~ ml de PBS a 100 ml / min en las ratas. Busque depuración de la sangre desde el hígado durante.
- Inyectar las etiquetas químicas histológicamente pertinentes transcardially, si así se desea, mediante la entrega jeringa con cuidado de evitar la introducción de burbujas.
Nota: Las etiquetas vasculares (por ejemplo, Dil) y contratinción nucleicos colorantes ácidos (por ejemplo, Hoechst 33342) son ejemplos de etiquetas de los químicos a entregar durante la perfusión. Cuando se administra correctamente, estos marcadores histológicos debe etiquetar el animal entero 20.
- Entregar tamponada, temperatura ambiente, 4% de formaldehído transcardially para fijar el animal. Evitar la perforación del tabique a través del corazón, que puede ser evidenciada por el drenaje de pulmón nariz durante la perfusión. Busque temblores de fijación de los músculos grandespara indicar perfusión completa. Entregar un total de 10 ml fijador ~ en ~ 5 ml / min en ratones y 200 ml de fijador ~ en ~ 100 ml / min en las ratas.
- Después de la perfusión, decapitar al animal, exponer parte del tronco cerebral o cerebelo con gubia o tijeras, y la cabeza en lugar de una solución de formaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C.
- Lavar la cabeza en tres cambios de PBS con uno a cuatro intervalos de horas entre cada lavado.
- Guarde cabezales fijos en HBHS contienen azida de sodio a 4 ° C durante días o meses.
3. Brain Extracción con Dispositivos situ
Nota: Realice esta sección en una campana de humos al usar el equipo de protección personal. Evitar la desecación del tejido mediante la devolución de la cabeza fija a HBHS solución periódica.
- Diseccionar cuidadosamente la piel y otros tejidos de alrededor de la tapa del cráneo acrílico utilizando pinzas y tijeras pequeñas.
- Si bien usar calor-insensitive guantes, use un soldador para quitar acrílico dental y exponer un área de subyacente claramente Kwik-Sil (Figura 2a).
Nota: El objetivo de este paso es permitir micro-tijeras un ángulo apropiado de acceso a posiciones en las que los dispositivos implantados entrar en el cerebro, de modo que el cerebro-implantados componentes pueden ser separados de los componentes fijados al cráneo.
- Bajo un microscopio quirúrgico, se corta en el elastómero de silicona con micro-tijeras curvadas, la eliminación de pequeñas piezas de Kwik-Sil con unas pinzas hacia abajo a la posición en la que los dispositivos de entrar en el cerebro.
- Continuar cortando a lo largo de la superficie de la craneotomía con curvas micro-tijeras a los componentes del dispositivo separados unidos a polisilicio y el cráneo de los componentes implantados en el cerebro. Una vez más utilizar microscopio óptico y el gran cuidado al cortar a través de los componentes del dispositivo expuestos, teniendo cuidado de no empujar o arrastrar el implants en el tejido fijado.
- Retirar el hueso alrededor del casquete con cuidado utilizando gubia. Utilice una espátula para separar el cerebro con dispositivos implantados desde el cráneo. Guarde el cerebro en solución HBHS hasta que esté listo para cortar.
- Coloque el cerebro en una placa de Petri de vidrio lleno de HBHS, y el uso de una hoja de afeitar para eliminar el tejido extraño, tal como la médula espinal, cerebelo, bulbo olfatorio o, dependiendo de si son relevantes para la ubicación de la implantación del dispositivo. Use un bloque de cerebro (Ted Pella) y las hojas de afeitar a la sección del cerebro y crear un plano llano sigue muy de cerca al ángulo de los dispositivos implantados, lo que se logra colocando el cerebro en un bloque de cerebro de tamaño adecuado, orientando el cerebro de tal manera que cualquier porción visible del implante es paralela con la guía de cuchilla de afeitar, y la colocación de una hoja de afeitar en una guía de cuchilla al menos 2 mm desde el implante. Pulse la cuchilla de afeitar a través del tejido. Montar esta superficie hasta una plataforma vibrátomo. Alternarespectivamente, una cuchilla de afeitar montado en un micromanipulador se puede utilizar de una manera igualmente controlado como el bloque de cerebro para crear un plano muy de cerca la dirección del implante.
- Lugar de hielo bajo la plataforma vibratome, y, después de permitir que la superficie del tejido para secar brevemente sobre una toalla de papel, se adhieren al cerebro a un vibratome utilizando Super Glue. Pegamento el plano de tejido plano creado en el paso anterior es para la etapa. Con dimensiones de tejidos asimétricos, orientar la muestra de tal manera que la dimensión más ancha está pegado abajo paralelo con la dirección de movimiento de la cuchilla de vibratome para ayudar a evitar que la hoja potencialmente golpeando el tejido acabado. Después de que seque el pegamento (~ 1-2 min), añadir refrigerada (~ 4 ° C) PBS al plato vibratome alrededor del tejido.
- Recoger rodajas gruesas de tejido entre 200-400 micras, incluyendo el tejido de control, utilizando la velocidad de vibración máxima (~ 100 Hz) y una velocidad de la cuchilla progresión lenta (<0,2 mm por segundo), con un ángulo de pala de 10 ° a partir de horizontal. Recoger con cuidado las rebanadas con una espátula o cepillo redondo y guardar en HBHS en una placa de 24 pocillos a 4 ° C.
- Una vez que el dispositivo en situ es visible a simple vista o un microscopio quirúrgico, recoger las secciones más finas para acercarse al dispositivo en incrementos rebanada de 100 micras o menos.
Nota: típicos de silicio micro-implantes son visibles a simple vista en formaldehído tejido fijado roedor corteza cerebral entre 300 y 500 micras desde la superficie del dispositivo.
- Con el dispositivo en situ ahora cerca de la superficie del tejido, se recoge una lámina de tejido> 250 micras que contiene el dispositivo dentro. Estimación del espesor necesario puede ser ayudado por referencia a las rebanadas previamente recogidos.
Nota: los dispositivos más grandes, dispositivos multirejón y dispositivos en ángulo puede requerir más gruesas rodajas de tejido (> 500 micras) para capturar el dispositivo en la pieza de tejido de uno; remiembro de que tanto la penetración de etiquetas aplicadas y la profundidad de imágenes de microscopía se limitará en la recogida de datos eventual de estas rebanadas muy gruesas. Si es posible, evitar golpear el dispositivo con la cuchilla vibratome, ya que esto puede causar el arrastre del dispositivo a través de la deformación de los tejidos y morfológicas.
4. Tejido Tratamiento y Eliminación
- Lávese las rebanadas de 3x a los 5 minutos por lavado en HBHS
- Incubar en borohidruro de sodio (5 mg NaBH 4/1 ml de HBHS) para el total min 30 (15 min cada lado de la porción). Voltee las rebanadas usando un acero inoxidable o teflón recubierta micro cuchara y un pincel pequeño (Ted Pella). Los movimientos lentos y reflexivo mejorar el éxito de cada flip rebanada. Evite tocar las áreas alrededor del dispositivo implantado con el cepillo. Cuando sea posible, la adición de solución significativamente más de lo necesario (> 2 ml) permite manipular y girar las secciones de tejidos con más facilidad.
Nota: Este paso reduce endógeno autofluorescencia, omita este paso si las etiquetas fluorescentes se aplicaron durante la perfusión o XFP marcadores transgénicos están presentes.
- Lavar 3x rebanadas en 5 min por lavado en solución de lavado a temperatura ambiente.
Nota: Agitación durante los pasos de lavado y la incubación es opcional. Los autores especulan que sutil sacudida del implante rígido con respecto al tejido cerebral circundante puede ocurrir con agitación. Sin embargo, un mezclador orbital que se mueve a una velocidad suave (<60 rpm) puede evitar este tiempo que aumenta el movimiento de las soluciones.
- Bloquear durante 2 horas en solución de lavado a temperatura ambiente (rodajas tirón después de una hora).
- Incubar en anticuerpos primarios (diluido en solución de lavado) durante aproximadamente 48 h (24 h en cada lado de la rebanada) a 4 ° C.
- Realice rápidas 6 3 min lavados con solución de lavado.
- Realizar 6, 1 hora (3 lavados de lavadoes en cada lado de la lámina de tejido) en solución de lavado (almacenar a 4 ° C durante la noche si lavado).
- Incubar en anticuerpos secundarios (diluido con solución de lavado) durante aproximadamente 48 h (24 h en cada lado) en 4 ° C.
- Realice rápidas 6 3 min lavados con solución de lavado.
- Realizar 6, 1 hr lavados (3 lavados en cada lado) en la solución de lavado, se almacena a 4 º C durante la noche si va a lavar.
- Retire la solución de lavado y añadir el glicerol-based "U2 - Sca l e" solución de compensación. Permitir a borrar aproximadamente 1 semana para rodajas gruesas (250-500 micras) o semanas 2-3 para secciones de tejido muy grueso (> 500 m) a 4 ° C.
- Cubra el plato con papel de aluminio y se almacena a 4 ° C.
- Montar en diapositivas con capacidad para secciones gruesas de tejido (Figura 2b, 2c) utilizando la solución de compensación como medio de montaje y sellado con esmalte transparente. Conservar a 4 ° C, protegido de la luz.
5. Panorama completo de imágenes de Tincidencia y Device Interface
- Usando más largo que trabajan los objetivos del microscopio a distancia (> 2 mm), comenzará a marcar con un microscopio de barrido láser confocal microscopio o 2-fotón. Vamos a demostrar con un Zeiss LSM 710, Carl Zeiss "Zen" de software (2010), y una etapa de XY controlada por ordenador que se traduce en una imagen panorámica en 3D alrededor de un implante.
Nota: correcta para el índice de refracción de la solución de limpieza, ya sea en software, a través de un collar correctivo en el objetivo, o en el procesamiento de datos después de la recogida. En esta demostración nos adentramos en un valor del índice de refracción de la solución "U2" clearing de 1,4 en el software del microscopio Leica Zen, esta configuración se ajusta sutilmente z paso intervalos para dar cuenta de desajuste del índice de refracción.
- En el tejido cerca del dispositivo, aproximadamente evaluar los apropiados eje z los valores de recogida de ventana y los datos en la dimensión z para cada canal fluorescente mediante láser de baja potencia (~ 0.5 A 5%) y grandes z paso tamaños (> 25 micras).
Nota: Incluir espacio adicional por encima y por debajo de la hora de establecer el eje z cuando se configura para la recogida de datos panorámica, como el tejido puede no estar situado totalmente plana en el portaobjetos de vidrio (~ 20 m en cada dirección).
- Establecer el objetivo en el centro xy de su eventual panorama, por medio del software panorama Zen, determinar el número de puestos de recogida necesarios para cada eje (x, y) para cubrir su zona de interés.
- Vuelva a evaluar y concluir la ventana colección eje z.
- Ajuste manualmente la sensibilidad del detector y la potencia del láser a la rampa apropiadamente con mayor profundidad, siendo el objetivo general de mantener aproximadamente la misma intensidad de la imagen independientemente de la profundidad de imagen en la lámina de tejido, pero también para evitar el ruido de fondo.
- Recoge cada imagen fluorescente serie de datos. Si es necesario para evitar la superposición de señales, ejecute la línea lásers secuencialmente.
Nota: Si está disponible, configure el software para guardar automáticamente los datos en el disco duro durante la recogida.
- Cambie la configuración de software para recoger la "reflexión" y datos "transmitancia", y el uso más largo, el láser de longitud de onda más penetrante (por ejemplo, 633 nm) para captar estos canales. Determinar la potencia del láser adecuada y la sensibilidad del detector para "reflectancia" y colección "transmitancia" y repetir la serie misma colección alrededor del dispositivo implantado.
- Exportar los datos para su procesamiento posterior, la cuantificación y el análisis.
Representative Results
AMA implantados Brain-se pueden recoger en cortes de tejido separando primero los componentes montados cráneo-de los componentes integrados de cerebro. Figura 2a muestra los resultados de la eliminación de uno de los lados de un casquete cemento dental y una parte de Kwik-Sil rodea un cable MEA en un cráneo de rata. Un soldador se utiliza para eliminar el cemento dental y Kwik-Sil en una campana de humos. El cableado y los no implantados estructuras MEA se cortaron siguiente con micro-tijeras por lentamente a través de la excavación de la Kwik-Sil a la superficie del cerebro fijo.
Después de cortar, clasificar y limpiar los tejidos, simples hechos a medida diapositivas son útiles para el montaje de las secciones de tejidos gruesos (Figura 2b). Una rebanada de cerebro montado que contiene un microdispositivo implantado se muestra en la Figura 2c. Formación de imágenes a través de cualquiera de los lados de la corredera puede permitir la evaluación de la interfaz alrededor de un dispositivo, como se demuestra en la Figura 3 (Figura 3a) y microglia a lo largo de zonas de los electrodos y los rastros son visibles en el otro lado (Figura 3b).
Una vez montado, el tejido puede formar una imagen utilizando una etapa de traslación XY. Panorama de las etiquetas fluorescentes en los segmentos de tejido entero puede ser generado en la resolución deseada (Figura 4). El examen detallado de la interfaz de tejido morfológicamente preservada alrededor de microdispositivos implantados se pueden recoger con gran aumento para el análisis de la respuesta local del tejido (Figura 5).
Figura 1. Resumen del procedimiento. (Ac) Brain micro-implantes son cirugías finalizado con una capa de Kwik-Sil polímero que rodea inmediatamente el dispositivo, seguido por un recubrimiento de cemento acrílico. (D, e) Después de la eutanasia, la capa acrílica se quema, y montados cráneo-componentes del dispositivo están separados de los componentes implantados cortando a través del elastómero de silicona. (F, g) El cerebro es entonces removido del cráneo y se corta y se monta en la etapa vibratome. (Hk) rodajas de tejido se recogen, incluyendo una lámina de tejido que contiene el dispositivo. (L) El tejido puede ser procesado y montado en cámaras personalizadas para Microscopía detallada. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 2. (A) Borrar Kwik-Sil Su elastómero de siliconarrounding un cable de electrodo de matriz (flecha) ha sido expuesto por la quema de distancia de una ventana en la tapa de cemento dental en una cabeza de roedor perfundido usando un soldador. (B) Para acomodar formación de imágenes en cualquiera de los lados de una lámina de tejido grueso, simple "slide-cámaras" se puede hacer cortando una corredera de plástico y adherirse cubreobjetos a cada lado alrededor del tejido y solución de montaje. (C) Una lámina de tejido de cerebro de rata con implante intacta (flecha roja) se muestra después del montaje. A cada lado del tejido es rápidamente accesible a las imágenes de microscopía con esta configuración. Para la escala, el panel (a) es de 25 mm de diámetro en la parte inferior, mientras que los paneles (b, c) son 80 mm de ancho en la parte inferior.
Figura 3. Int máximoensity z proyecciones de pilas 40 micras de espesor, la imagen recogieron alrededor de la parte trasera (a) y frontal (b) de una matriz de microelectrodos implantados. Microglia (marcadas con anti-Iba1 y Alexa Fluor 633, blanco) y la reflectancia de luz láser (rojo), obtenida de la superficie del dispositivo, se obtuvieron imágenes de forma secuencial desde ambos lados de una rodaja 400 micras de espesor de tejido. Como los implantes en el cerebro son a menudo opaco, de montaje con acceso óptico a ambos lados proporciona una vista clara de las estructuras de tejido etiquetadas "detrás" del implante con respecto al objetivo del microscopio. Barra de nivel 50 micras.
Figura 4. Una rebanada DCHist etiquetados imágenes utilizando una fase controlada por ordenador en un microscopio de barrido láser confocal. (A) la célula núcleos (tiñeron con Hoechst 33342) y (b) los monocitos / microglia(Marcadas con anti-Iba1) fueron imágenes simultáneamente por canales separados. (C) transmisión de la luz y la reflectancia se recogieron también, que muestra la ubicación del implante 4 semanas con respecto a Hoechst y datos Iba1. (D) superposición de todos los canales de transmisión, pero también se muestra. El área del rectángulo blanco se expande en las imágenes que aparecen a la derecha. Barra de escala 1 mm.
Figura 5. Uso de una platina de microscopio controlado por ordenador y un software apropiado, los datos de formación de imágenes panorámicas se pueden recoger alrededor del implante. Reflectancia (a) y transmitancia (b) permitir la localización del dispositivo, mientras que las etiquetas de anticuerpos fluorescentes o químicos (c, anti-Iba1 etiquetado de microglia y macrophages) permiten obtener imágenes detalladas de los componentes del tejido a lo largo de la interfaz tejido intacto. Barra de escala 200 m.
Discussion
El "dispositivo de captura de Histología" (DCHist) método ha demostrado aquí permite la evaluación histológica de cerca las interacciones morfológicamente conservadas entre los tejidos del cerebro y los implantes de tejidos. Colección DCHist tejido requiere cuidadosa separación de los componentes del dispositivo montados cráneo-de los componentes implantados en el cerebro. DCHist también requiere la recolección de una rebanada gruesa capa de tejido histológico (> 250 m). Estas secciones de tejido, una vez etiquetados, aclaró, montado y fotografiado, puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la implantación o lesión posterior respuesta crónica a los dispositivos permanentes. El uso de herramientas avanzadas de microscopía, la interfaz entre el tejido y el dispositivo se pueden obtener imágenes y analizadas en detalle alta como se muestra en las Figuras 3-5.
Las técnicas que se presentan en su forma actual se basan en la capacidad de excavar lentamente el casquete hecho de dos partes de cemento dental y Kwik-Sil hasta el punto de implantación del dispositivo.Utilizando cemento dental que puede ser quemado o eliminado de otro modo y un elastómero de silicona transparente a través del cual unas tijeras pequeñas se puede guiar visualmente ayudan en gran medida en separar con éxito el dispositivo implantado a partir de sus componentes montados en el cráneo-. Intentar cortar el dispositivo bajo el cráneo y el cerebro anterior con el fin de recoger in situ no es recomendable, ya que el implante cráneo-montada se sacó del cerebro una cantidad significativa.
Aunque más delgadas, los implantes más pequeños, tales como MEA vástago individuales de Tecnologías NeuroNexus, son más susceptibles de DCHist, los principios no se limitan a vástagos de dispositivos individuales o matrices de microelectrodos. Recogida y estrategias de formación de imágenes son ampliamente aplicables a dispositivos de vástagos múltiples y los implantes más grandes, tales como cánulas, con los requisitos de ser que debe ser separado de cualquier montaje cráneo y se recoge dentro de una sección de tejido grueso. Aunque los autores se centran en el análisis de tejidorodean los implantes corticales, dispositivos impulsados más profundamente en el cerebro también puede ser recogida y fotografiado. La profundidad de inserción del implante no debe afectar a la captura del implante en una rebanada siempre que el dispositivo no se desvía violentamente desde el ángulo conocido de inserción.
Existen limitaciones para la aplicación útil del método DCHist. Secciones de tejido cerebral son difíciles de imagen a través de cientos de micrómetros, especialmente en áreas de materia blanca, aunque las soluciones ópticas de compensación puede mejorar mucho la profundidad de imagen en diversos tejidos 21. Para mejorar aún más la profundidad de imagen, de dos fotones microscopía de excitación se pueden emplear junto con la compensación óptica descrito.
Otra limitación potencial del método descrito pueden ser los métodos fluorescentes específicos de inmunohistoquímica y anticuerpos empleados por los investigadores. La difusión pasiva típicamente conduce a la incorporación de estos marcadores a través del tejido fijoy en los sitios de unión al antígeno. Las concentraciones finales de anticuerpo de trabajo debe ser determinado por los investigadores sobre una base de caso por caso para maximizar la penetración etiqueta evitando al mismo tiempo altos niveles de etiquetado fondo. Anticuerpo etiquetado no debe ser variable entre las rebanadas que se procesan de forma idéntica, pero diferentes anticuerpos pueden variar considerablemente en su capacidad para penetrar y la etiqueta de su antígeno, con algunos anticuerpos fácilmente etiquetado antígenos muchos cientos de micrómetros de profundidad y otros antígenos de etiquetado sólo unas decenas de micrómetros de profundidad. Se describe la mejora de esta difusión mediante la aplicación de etiquetas de anticuerpos a los mayores que las concentraciones típicas, para múltiples días de aplicación, y en una solución que contiene detergente diluido y suero de bloqueo. Periódicamente volteando las rodajas también promueve incluso el etiquetado. Pasos de recuperación de antígeno y procesos alternativos de fijación (por ejemplo, glutaraldehído, microondas, etc) puede ser apropiada para antígenos específicos. Anticuerpo secundario-fluorochroma conjugados también pueden variar en su rendimiento de etiquetado secciones gruesas, aunque esto no se ha observado por los autores con Alexa Fluor etiquetas de Invitrogen. Alternativamente, los sujetos animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en los tipos de células de interés puede ser utilizado para evitar problemas con la penetración anticuerpo etiqueta, ya que muchas proteínas fluorescentes, tales como eGFP, conservan su fluorescencia después de tratamiento con formaldehído, y puede ser visualizado inmediatamente en secciones de tejido.
DCHist es un poderoso conjunto de técnicas para capturar y analizar el impacto de los microdispositivos implantados en el tejido cerebral. Acoplamiento de este protocolo histológico con evaluación in vivo de calidad electrofisiología y datos impedancia de los electrodos 22 podría mejorar nuestra comprensión de los orígenes biológicos de la variabilidad fisiología y la degradación. El campo de los dispositivos protésicos implantados neuronales en particular, pueden beneficiarse de la ima detallada DCHistging del intacta dispositivo / interfaz de tejido para informar a un mayor desarrollo de los dispositivos de MEA biológicamente neutros.
Disclosures
Los autores no tienen información significativa para declarar, financieros o de otro tipo.
Acknowledgments
Todos los experimentos se realizaron bajo la supervisión del Cuidado de Animales y el empleo Comisión de Purdue y el Programa de Animales de Laboratorio de la Universidad Purdue.
Este trabajo ha sido patrocinado por la Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Tecnología de Microsistemas Office (MTO), bajo los auspicios del Dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) como parte del Programa de Tecnología Neural fiable, a través de la Guerra Espacial y Naval Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant N º N66001-11-1-4013.
Los autores desean agradecer a Mikhail Slipchenko, Ready Don, Greg Richter, Taylor Aaron, y Eliceiri Kevin por compartir su experiencia microscopía.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| H–chst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
| Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
| Equipment | |||
| Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
| Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
| Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
| Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
| Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
| Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
| Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
| 24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
| Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ’Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
| Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap | |
References
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