Summary
Burada optik temizleyerek, ve kemirgen beyin dokusunda kronik implante Mikrocihazlarda çevresindeki görüntüleme sağlam beyin dokusuna arayüzü, etiketleme, yakalamak için bir histolojik yöntem sunuyoruz. Bu yöntem oluşan tekniklerden elde edilen sonuçlar, çevreleyen doku ile ilgili çeşitli nüfuz edici beyin-implant etkisini anlamak için yararlıdır.
Abstract
Tasarım ve bu mikroelektrot dizileri gibi beyne yerleştirilmiş Mikrocihazlarda, kullanımı üzerine araştırmalar, beyin dokusu çevresindeki kronik arayüz klinik cihazlar üretmeyi hedeflemektedir. Bu implantlar çevreleyen doku cihazlar etrafında bir yalıtım "glial yara izi" oluşumunu içeren saat boyunca cihazların varlığına tepki olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, bu doku değişikliklerin histolojik analiz tipik olarak ilgili doku morfolojisi bozabilir bir süreç içinde, aygıt eksplante sonra gerçekleştirilir.
Burada kortikal implante cihazlar kemirgen beyin dokusu çevresindeki bozulmamış toplandığı bir protokol göstermektedir. Bir kez sabitleştirici ile perfüze nasıl tarif beyinleri çıkartılmış ve eksplante cihazlar önlemek için olduğu gibi bu tür bir şekilde dilimlenmiş. Biz floresan antikor etiketleme ve bilgilendirici, ama kalın bir doku üretmek için kullanışlı optik temizleme yöntemleri ana hatlarıylabölüm. Son olarak, beyne yerleştirilmiş aygıtların çevresindeki biyolojik arayüzü araştırmak amacıyla bu doku bölümlerinin montaj ve görüntüleme göstermektedir.
Introduction
Neuroprosthetic araştırma alanında cihazlar 1,2 arabirim MSS yoluyla vücudun hastalıklı yada hasarlı yapıların atlayarak çeşitli engelli ve rahatsızlıkları olan kişilerde yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Böyle mikroelektrot diziler (ÇÇA'lar) gibi beyin-implante Mikrocihazlarda, kaydedebilir veya teşvik beyin yapıları, ve böylece elektronik ve MSS dokusu 3-5 arasında uzun dönemli arabirimler kurulmasına izin vermek için kullanılabilir. Penetran ÇÇA'lar, beyin dokusu içine sürülür cihazları, onlar yakın nöronlar 6 nispeten küçük bir dizi elektrot sunmak, içinde yakınlığı nedeniyle çift yönlü arayüzleri olarak özellikle sözü tutun.
Ancak, penetran ÇÇA'lar ve uzun vadeli implantasyonu kompleks yumuşak doku tepkileri sonucu, genellikle ay gün boyunca değişken ve giderek aşağılayıcı elektrofizyolojik sinyal-gürültü oranları ile sonuçlanan ve elektrik imped bir artışElektrot bölgelerinde ve toprak 7,8 arasındaki ance. Bu değişikliklerin olası kökenleri mikroglia aktivasyonu, Mikrocihazlarda boyunca reaktif astrositoz ve implante cihazlar 9-11 çevreleyen dokudan nöronların kaybı veya göç almaktadır. Kronik, penetrasyon ÇÇA'lar etrafında bu doku değişiklikleri anlamak için büyük bir meydan okuma kronik implante cihazlarda 12 çevredeki sağlam doku arayüzünün histolojik verileri yakalayan zorluk. Hala mevcut cihaz / doku arayüzü ile doku histolojik analizi Geçerli aygıt kaldırma histolojik protokolleri geliştirmek istiyorum. Doku içinde kalan deliksiz bir cihaz ile, bu gibi biyo uyumlu kaplama 13,14 ya da 15,16 elektrot yüzey arasında elektrik açıklığın kullanımı gibi nispeten ince etkileşim, biyolojik etki yansıması olabilir ve implant ile ilgili olarak incelenmiştir.
Here biz toplamak için yöntem, süreç ve görüntü çevreleyen beyin dokusunun ayrıntılı mikroskopi tabanlı analiz için sağlam microdevice arabirimi göstermelidir. Bu yöntem, aygıt ve beyin dokusu çevresindeki bir vibratome kullanılarak kalın (> 250 um) doku bölümü içinde toplanır. Bu kalın dilimler halinde histolojik etiketi penetrasyonunu artırmak için, floresan histokimyasal ve immünohistokimyasal etiket birden fazla gün için engelleme serum ve deterjan içeren solüsyonlar yüksek konsantrasyonlarda uygulanır. Bir optik temizleme solüsyonu mikroskobu görüntüleme derinliklerinde iyileştirmek için kullanılır ve doku konfokal mikroskopi 17 tarama sonraki lazer için 2 taraflı odalarına monte edilir. Tam histolojik arayüzü yakalamak için, bilgisayar kontrollü translasyon aşamasında implantların uzunluğu boyunca z yığın panoramalar toplamak için görüntüleme sırasında kullanılır. Görüntüleme yanı sıra implantlar geri lazer yansıma toplanması, doku etiketleri uygulananve doku yardımı ile her ikisi de transmisyon ışığı çevreleyen doku ile ilgili olarak, cihaz arabirimi yerleşir. Doku Bu "Aygıt Yakalama Histoloji" kullanılarak hazırlanmıştır (DCHist) protokolü morfolojik korunmuş doku / cihaz etkileşimler görüntüleme erişim sağlar ve böylece önceki aygıtın kaldırılması histolojik protokolleri 18 geliştirir.
Protocol
Çözümler
PH 7.4 'de 9 g NaCl, 0.144 g KH 2 PO 4, 0,795 g Na 2 HPO 4,; g / l - Fosfat Salin (PBS) Tamponlanmış
% 4 formaldehit - ml / l, 202 mL sodyum fosfat dibazik çözeltisi (0.4 M Na 2 HPO 4), 48 ml sodyum fosfat monobazik çözeltisi (0.4 M NaH 2 PO 4), 500 ml% 8 formaldehit çözeltisi, 250 ml Milli- pH 7.4 'te Q DDi su,
7.5 g NaCl, 0.3 g KCl, 0.06 g KH 2 PO 4, 0.13 g Na 2 HPO 4, 2 g glukoz, 2.4 g HEPES, 0.05 g MgCl2; g / l - Hepes Sodyum Azid (HBHS) ile Hank Tamponlu Salin 6 kısım H2O, 0.05 g MgSO4 7 kısım H2O, 0.165 g CaCl2, pH 7.4 'de 0.09 g NaN3
Yıkama Çözeltisi (WS) - 1% Vol / Vol, Normal Keçi Serum,% 0.3 Triton sodyum azid (NaN 3) ile HBHS X-100,. 4 ° C de daha sonraki adımda kullanım öncesinde WS buzdolabında.
U2 Sca l e Çözelti - 4 M üre,% 30 gliserol ve% 0.1 Triton X-100, 17
PROSEDÜRÜ
Tüm deneyler Purdue Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu ve Purdue Üniversitesi Laboratuar Hayvan Programı gözetiminde yapıldı.
1. Cerrahlık
- Çeşitli aseptik cerrahi yöntemler sunulmaktadır histolojik yöntem ile uyumludur. Bir stereotaksik çerçeve ve otomatik inserters kullanımı stereotaksik düzlemlerine göre tekrarlanabilirliği ve mikroelektrot diziler (MEA) kontrolünü implantasyonu açısını iyileştirmek için tavsiye edilir.
Not: aşağıdaki gibi bu tanıtımda bizim cerrahi yöntem: stereotaksik earbars whil kemirgen konu tutunizofluran anestezi altında e (% 1-3 arası) tıbbi sınıf oksijen taşıdı. Bir ayak tutam eksikliği için test hayvanın tamamen uyuşturulduktan onaylamak için fareyi bir kuyruk tutam refleks sıçan veya eksikliği yansıtıyor. Göz merhemi sürün ve Betadine ve etanol üç alternatif yıkar ile cerrahi alan temizleyin. Ellerinizi yıkayın, şafak cerrahi eldiven, saç filesi, yüz maskesi ve cüppe. , Cerrahi alanı uyuşturmak makas veya kemik kazıyıcı ve pamuk aplikatör ile bir neşter, net periost kullanarak bir kesi oluşturmak ve bir diş matkap Handpiece ve matkap ucu kullanarak bir kranyotomi oluşturmak için Lidokain bir bolus enjekte edilir. Bir mikromanipülatör kullanarak korteksin içine tek-şaft MEA sürün. Aseptik cerrahi koşulları sürdürmek bir cerrahi asistanı yardımı var ve ameliyat ilerleme belge.
- Beyin içine MEA implantasyonu takiben, b etrafında kafatası nihai kaldırılması bilgilendirmek için cerrahi bir mikroskop aracılığıyla görüntüler toplamakyağmur. Cihazları İmplante kısımları in situ olarak korunur.
Not: Yerinde cihazlar ile doku nihai koleksiyonu yakından doku kesit düzlemi ile cihazın yerleştirilmesi düzleminde eşleşen dayanmaktadır. Beyin göre aygıt ekleme düzlemi ile ilgili ayrıntılı notlar bu nedenle çok önemlidir.
- Cihaz yerleştirildikten sonra açıkta MEA Shanks veya kablo etrafına, silikon elastomer Kwik-Sil (TEFE) uygulayın ve kürlenmesini bekleyin. Böyle bir kesik bir pipet ucu gibi bir steril plastik bir parça, sertleştirme sırasında küçük bir kranyotomi iyi etrafında silikon elastomer içeren yardımcı olmak için kullanılabilir.
- İki parçalı bir katman Kwik-Sil fazla dental akrilik ("Jet Sıvı içinde" ve Lang Diş gelen "Jet Toz") ve açıkta kafatası uygulayın.
Not: daha sonraki bir adımda, headcap ayrılması için bir implant için izin vermek için eritilerek yoluyla olacaktırkafatası. Bu çok sert akrilik sonra kaldırmak için zor olduğu gibi UV ile kür alan akrilik, Kwik-Sil ve kraniotomi üzerinde kaçınılmalıdır. Implant çevresindeki Görme opak malzemeler de kaçınılmalıdır; net Kwik-Sil Bu protokolün müteakip adımları esnasında implantın bir görünüm sağlar.
- Hayvan refahı düzenlemeleri yerel protokol gereği gibi post-operatif bakım yordamlarını uygulayın ve tek yer kafes kutularına ambulatuar dönün.
2. Perfüzyon ve Doku Koleksiyonu
Not: Gage ve ark. sıçan hayvan modelinde 19 ayrıntılı bir perfüzyon prosedürü walkthrough için.
- Kurumun hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmış anestezi ve perfüzyon protokolü kullanın. Derinden kemirgen (fare ya da fare kuyruk tutam refleks ayak tutam refleksi eksikliği ile onaylanır) anestezi ve kalp açıkladıktan sonra, sığ makas kesim yapmaksol ventrikül ve sağ atrium. Sol ventrikül içine künt iğne takın ve oda sıcaklığında PBS teslim. Az ~ 10 ml PBS'lik toplam bir teslim ~ 5 ml / dak, farelerde ve ~ 200 ml PBS ~ az 100 ml / sıçan dak. Sırasında karaciğer kan izni için bak.
- Yani istenirse kabarcıkları tanıtma önlemek için alınan bakım ile şırınga ile, transkardiyal histolojik ilgili kimyasal etiketleri enjekte.
Not: Vasküler etiketler (örneğin, DII) ve nükleik asit counterstain boyalar (Hoechst 33342 gibi) perfüzyon sırasında verilebilir kimyasal etiket örnekleridir. Doğru uygulandığında, bu histolojik işaretleri tüm hayvan 20 etiketlemek gerekir.
- Tamponlu, oda sıcaklığında, hayvan düzeltmek için transkardiyal% 4 formaldehit sunun. Perfüzyon sırasında akciğer-burun drenajı ile kanıtlandığı edilebilir kalp genelinde septum perforasyonu kaçının. Büyük kaslar fiksasyon titreme arayıntam perfüzyon gösterir. Az ~ 10 ml sabitleştirici toplam sunun ~ 5 ml / dak ve farelerde de ~ ~ 200 ml sabitleştirici 100 ml / sıçan dak.
- Perfüzyon takiben, hayvan başını kesmek 4 ° C'de beyin sapı veya gece boyunca% 4 formaldehit solüsyonunda rongeurs veya makas ve bir yerde kafasını kullanarak beyincik kısmı açığa
- Yıkamalar arasında 1-4 saat ara ile PBS üç değişiklikleri kafa yıkayın.
- Günler veya aylar boyunca 4 ° C de sodyum azit içeren HBHS içinde sabit kafaları saklayın.
3. In situ Cihazlar ile Beyin Kaldırma
Not: Uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek bir davlumbaz bu bölümde gerçekleştirin. Periyodik çözüm HBHS için sabit kafa iade ederek doku kuruma kaçının.
- Forseps ve küçük makas kullanarak akrilik kafatası kap yerinden deri ve diğer dokular dikkatle uzak teşrih.
- Isı-i giyildiğinsensitive eldivenler, diş akrilik kaldırmak ve Kwik-Sil (Şekil 2a) açık yatan bir alanı göstermek için bir havya kullanın.
Not: Bu adımın amacı beyne yerleştirilmiş bileşenleri kafatası sabitlenmiş parçalar ayrı olabilir, böylece mikro makas implante cihazları beyin girmek pozisyonları erişim uygun bir açı sağlamaktır.
- Cerrahi mikroskop altında, cihazların beyni girdiğiniz konuma cımbız ile Kwik-Sil küçük parçalar aşağı kaldırarak, kavisli mikro-makas ile silikon elastomer içine kesti.
- Beyin implante bileşenleri polisilikon ve kafatası bağlanan ayrı bir aygıt bileşenlerinin kavisli mikro makas ile kranyotomi yüzeyi boyunca kesme devam edin. Maruz kalan cihazın parçaları aracılığıyla keserken Yine imp itme veya sürükleyerek önlemek için dikkat çekici, mikroskop büyütme ve büyük bir dikkatle kullanınsabit doku içinde lants.
- Rongeurs kullanarak dikkatle headcap çevresindeki kemik çıkarın. Kafatası implante cihazlarıyla beyin ayırmak için bir spatula kullanın. Dilim hazır olana kadar HBHS çözüm beyin saklayın.
- HBHS ile dolu bir cam Petri kabındaki beyin yerleştirin ve cihazın implantasyonu konumunuza uygun olup olmamasına bağlı olarak, spinal kord, serebellum veya koku ampul gibi, yabancı doku kaldırmak için bir jilet kullanın. Bölüm beyin için bir beyin blok (Ted Pella) ve tıraş bıçağı kullanma ve yakından Kullanılan cihazların açı uygun düz bir düzlem oluşturma; bu gibi herhangi ki beyin yönlendirilmesi, bir uygun büyüklükte bir beyin blok beyin yerleştirilerek gerçekleştirilir İmplantın görünür kısmı jilet kılavuzu ile paralel olduğunu ve bir bıçak kılavuzu implant en az 2 mm bir jilet yerleştirerek. Doku ile jilet basın. Bir vibratome platformu için bu yüzeye monte edin. Alternatif olarak, bir jilet yakından implantın yönüne uygun bir düzlem oluşturmak üzere beyin blok olarak bir benzer bir şekilde kontrol edilen bir şekilde kullanılabilecek bir mikromanipülatör monte edilir.
- Sıra vibratome platform altında buz ve, doku yüzeyinin kısaca bir kağıt havlu üzerinde kurumaya izin verildikten sonra, Super Glue kullanarak vibratome için beyin uygun. Tutkal önceki adımda oluşturduğunuz düz doku uçağı sahne olduğunu. Asimetrik doku boyutlar ile, kablonun en geniş boyut potansiyel fazla doku vurma bıçak önlemek için vibratome bıçağın hareket yönüne paralel olarak yapıştırılmış, bu gibi numune. Tutkal setleri sonra (~ 1-2 dk), eklemek soğutulmuş (~ 4 ° C) doku çevresindeki vibratome çanak PBS.
- Ho 10 ° 'lik bir bıçak açısı ile maksimum titreşim hızı (~ 100 Hz) ve yavaş bir bıçak ilerleme hızı (saniye başına <0,2 mm) kullanarak, kontrol doku dahil 200-400 mikron arasında kalın bir doku dilim toplayınYHTKIP. 4 at 24 de plaka HBHS bir fırça veya kaşık spatula ve mağaza ile dikkatlice dilimleri toplayın ° C.
- Yerinde cihaz çıplak gözle veya cerrahi mikroskop görünür sonra, 100 mikron veya daha az dilim artışlarla cihazı yaklaşım ince kesitler toplamak.
Not: Tipik silikon mikro-implant cihazı yüzeyinden 300 ve 500 mm arasında formaldehit ile fikse kemirgen serebral korteks dokusunda çıplak gözle görülebilir.
- In situ cihaz şu anda doku yüzeyine yakın olan aygıt içinde içeren bir> 250 um doku dilim toplamak. Gerekli kalınlığa tahmini önceden toplanmış dilimleri referans ile destekli olabilir.
Not: Büyük cihazlar, multishank cihazları ve açılı cihazlar kalın doku dilim (> 500 mikron) bir doku parça yakalama aygıtı gerekebilir; yenidenuygulanan etiket penetrasyon ve mikroskobu görüntüleme derinliği de bu çok kalın dilimler gelen nihai veri toplama sınırlı olacağını üyesi. Eğer mümkünse bu doku ve morfolojik deformasyon sayesinde cihazın sürükleyerek neden olabilir, vibratome bıçak cihazı çarpıcı kaçının.
4. Doku İşleme ve Takas
- HBHS içinde yıkama başına 5 dk 3x dilim yıkayın
- 30 dakika toplam (15 dakika dilim her iki tarafında) (5 mg NaBH4 / HBHS, 1 ml) içinde sodyum borohidrid inkübe edin. Paslanmaz çelik veya Teflon kaplı mikro kaşık ve küçük bir fırça (Ted Pella) kullanarak dilimleri çevirin. Yavaş ve düşünceli hareketleri her dilim flip başarısını artırmak. Fırça ile implante cihaz etrafında herhangi alanlar dokunmaktan kaçının. Mümkün olduğunda, gerekli (> 2 ml) göre anlamlı olarak daha çözeltisi ilave bir daha kolay doku dilimleri işlemek ve çevirmek için izin verir.
Not: Bu adım otofloresans endojen azaltır; floresan etiketler perfüzyon sırasında uygulanan veya xFP transgenik işaretleri mevcut olsaydı bu adımı atlayın.
- Oda sıcaklığında Yıkama Çözüm yıkama başına 5 dk 3x dilimleri yıkayın.
Not: yıkama ve İnkübasyon sırasında Ajitasyon isteğe bağlıdır. Yazarlar çevredeki beyin dokusu ile ilgili sert implantın sarsıcı ince ajitasyon oluşabilir spekülasyon. Çözümler hareket kabiliyetini arttıran Bununla birlikte, bir yumuşak oranı (<60 rpm) hareket eden bir orbital karıştırıcı bu önlemek olabilir.
- Oda sıcaklığında (kapak dilimler bir saat sonra) yıkama çözeltisi içinde 2 saat için engelleme.
- 4 ° C'de yaklaşık 48 saat (dilim her iki tarafında 24 saat) için primer antikorlar (yıkama çözeltisi içinde seyreltilmiş) içinde inkübe
- Yıkama Çözeltisi ile 6 hızlı 3 dk yıkama yapın.
- 6, 1 saat yıkar (3 yıkama gerçekleştirmeYıkama Çözüm doku dilim her tarafında es) (4 mağaza ° C yıkama gecede varsa).
- 4 ° C'de yaklaşık 48 saat (her bir yan üzerinde 24 saat) için ikincil antikor (yıkama çözeltisi ile seyreltilmiş) içinde inkübe
- Yıkama Çözeltisi ile 6 hızlı 3 dk yıkama yapın.
- Gecede yıkama eğer 4 mağaza ° C; Yıkama Çözüm 6, 1 saat yıkar (her tarafta 3 yıkar) gerçekleştirin.
- Takas çözümü - Çözüm yıkayın ve gliserol tabanlı "Sca l e U2" Kaldır eklentisi. 4 ° C'de çok kalın doku kesitlerinde (> 500 mikron) için kalın dilim (250-500 mikron) veya 2-3 hafta boyunca yaklaşık 1 hafta temizlemek için izin ver
- 4 ° C'de folyo ve mağaza ile Rozet
- Montaj medya olarak takas çözümü kullanarak ve net oje ile sızdırmazlık kalınlığında doku kesitleri (Şekil 2b, 2c) accomodating slaytlar monte edin. ° C ışıktan uzak 4. depolayın.
5. Tam Ti Panorama Görüntülemessue ve Aygıt Arabirimi
- Uzun çalışma mesafesi mikroskop hedefleri (> 2 mm) kullanarak, konfokal mikroskop veya 2-foton mikroskop tarama lazer görüntüleme başlar. Biz Zeiss LSM 710, Carl Zeiss "Zen" yazılım (2010), ve görüntü bir implant etrafında 3D panorama için bir bilgisayar kontrollü XY çeviri aşaması ile gösterecektir.
Not: objektif bir düzeltici yaka yoluyla yazılım temizleme solüsyonu, kırılma indeksi için doğru ya da toplandıktan sonra veri işleme. Bu gösteri biz Leica Zen mikroskop yazılımı içine 1.4 "U2" takas çözümü için bir kırılma indisi değer girin; bu ayar kurnazca kırılma endeksi uyuşmazlığı için hesap z adım aralıklarla ayarlar.
- Cihazın yanına dokusunda, kabaca düşük lazer güç (~ 0 kullanarak her floresan kanal için z boyutu uygun z ekseni pencere ve veri toplama ayarlarını değerlendirmek0,5-5%) ve büyük z-adım boyutları (> 25 mikron).
Not: Panoramik veri toplama için kurarken doku cam dia (~ 20 mikron her yöne) tamamen düz bir yalan olabilir, z-ekseni ayarlarken üstünde ve altında ek boşluk ekleyin.
- Sizin nihai panorama xy merkezinde hedefi ayarlayın; Zen panorama yazılımı kullanarak, ilgi bölgenizdeki kapsayacak şekilde her bir eksen (x ve y) için gerekli toplama pozisyonların sayısını belirlemek.
- Yeniden değerlendirmek ve z ekseni toplama penceresinden sonuçlandırmak.
- Elle artan derinliği ile uygun rampa dedektör hassasiyeti ve lazer gücünü ayarlamak, amacı doku dilim içine bakılmaksızın görüntüleme derinliği yaklaşık aynı görüntü yoğunluğunu korumak için, ancak yüksek arka plan gürültü önlemek için de tipik olarak.
- Her floresan görüntü veri serisi toplayın. Sinyalleri çakışmasını önlemek için gerekirse lazer satırını çalıştırınsırayla s.
Not: Eğer mümkünse, otomatik toplama sırasında sabit disk verileri kaydetmek için yazılım ayarlanır.
- "Yansıma" ve "geçirgenlik" veri toplamak için yazılım ayarlarını değiştirin ve bu kanallar yakalamak için daha uzun, daha keskin dalga boyunda lazer (örneğin 633 nm) kullanın. "Yansıtma" ve "geçirgenlik" koleksiyonu için uygun lazer güç ve dedektör hassasiyeti belirleyin ve implante cihaz etrafında aynı koleksiyon serisi tekrarlayın.
- Daha sonra işleme, ölçme ve analiz için veri verir.
Representative Results
Beyin implante ÇÇA'lar birinci beyin gömülü bileşenleri herhangi bir kafatası monte bileşenlerini ayırmak göre doku kesitlerine toplanır. Şekil 2a, bir diş, bir çimento headcap yan ve bir MEA kablo çevreleyen Kwik-Sil bir kısmının çıkarılıp sonuçlarını gösterir Sıçan kafatası üzerinde. Bir havya bir davlumbaz diş çimento ve Kwik-Sil çıkarmak için kullanılmıştır. Kablo ve uygun olmayan yapıların implante MEA sonraki yavaş yavaş sabit beyin yüzeyine Kwik-Sil boyunca aşağı kazılarak mikro makasla kesilmiştir.
Dilimleme sonra, etiketleme, ve doku temizleme, basit bir ölçüye slaytlar kalın dilimler doku (Şekil 2b) monte edilmesi için yararlıdır. Implante microdevice ihtiva eden bir monte edilmiş beyin kesit Şekil 2c 'de gösterilmiştir. Şekil 3 'de gösterildiği gibi sürgünün her iki tarafı ile Görüntüleme, bir cihaz arabirimi etrafında değerlendirmek için izin verebilir (Şekil 3a) ve mikroglia diğer tarafında (Şekil 3b) üzerinde görünür.
Bir kez monte doku bir XY çeviri aşamasında kullanılarak görüntülenebilir. Tüm doku dilimleri boyunca floresan etiket Özetler istediğiniz çözünürlüğü (Şekil 4) oluşturulabilir. Implante Mikrocihazlarda etrafında morfolojik korunmuş doku arayüzü Detaylı incelemede lokal doku yanıtı (Şekil 5) analizi için yüksek büyütme altında toplanabilir.
Şekil 1. Prosedürün genel bakış. (Ac) Beyin mikro-implant ameliyatları fina vardırhemen cihaz çevreleyen Kwik-Sil polimer bir tabaka ile lized, bir akrilik çimento kaplama izledi. (D, e) Aşağıdaki ötenazi, akrilik tabaka uzaklıkta yandığı, ve kafatası cihazın monte edilen bileşenler silikon elastomer ile kesme ile implante edilen bileşenleri ayrılır. (F, g) daha sonra beyin kafatası kaldırılır ve kesilmiş ve vibratome aşama için monte edilir. (HK) Doku dilimler cihaz ihtiva eden bir dilim içeren doku toplanır. (L) Doku ardından işlenir ve detaylı mikroskopi için özel odalarına monte edilebilmektedir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. (A) Kwik-Sil silikon elastomer su temizlemebir elektrot-dizi kablosu (ok) rrounding bir havya kullanarak perfüze kemirgen baş diş çimento kap içinde bir pencere uzak yakarak maruz kalmıştır. (B) bir dilim kalınlığında doku bölgesinin her iki tarafında içine görüntüleme yerleştirmek için basit bir "kayar bölmelere" plastik bir slayt kesme ve doku etrafında her iki tarafına coverglass yapışan ve çözelti montaj yapılabilir. (C) sağlam implant (kırmızı ok) ile sıçan beyin dokusu dilim montajdan sonra gösterilir. Doku iki tarafında bu kurulum ile mikroskobu görüntüleme için hızla erişilebilir. Panelleri (b, c) alt kısmında çapında 80 mm iken ölçek için, panel (a), taban boyunca da 25 mm 'dir.
Şekil 3. Maksimum intdensite 40 mikron kalınlığında görüntü yığınlarını z-projeksiyonlar, ters (a) ve implante mikroelektrot dizinin ön (b) etrafında toplanmıştır. Mikroglia (anti-Iba1 ve Alexa Fluor 633, beyaz etiketli) ve cihazın yüzeyinde toplanmış lazer ışık yansıtma (kırmızı), sıralı olarak bir 400 mikron kalınlığındaki bir doku dilim her iki yüzünden görüntülenmiştir. Beyin implantları çoğunlukla opak olduğundan, her iki taraf için optik erişim montaj mikroskop objektif açısından implant "arkasında" etiketli doku yapıları net bir görünüm sağlar. Ölçek çubuğu 50 mikron.
Şekil 4. Konfokal mikroskop tarama bir lazer üzerinde bilgisayar kontrollü sahne kullanarak görüntülü A etiketli DCHist dilim. (A) hücre çekirdekleri (Hoechst 33342 ile boyanmış) ve (b) monositler / mikroglia(Anti-Iba1 etiketli) aynı anda ayrı kanallarda görüntülendi. (C) Transmisyon ışığı yansıtma ve aynı zamanda Hoechst ve Iba1 veri göre 4-haftalık implant yerini gösteren toplanmıştır. (D) tüm kanalları ama iletim Overlay de gösterilir. Beyaz dikdörtgen alanı sağ görünen görüntüler genişletilir. Ölçek çubuğu 1 mm.
Şekil 5. Bilgisayar kontrollü mikroskop sahne ve uygun yazılımı kullanarak, panoramik görüntüleme verileri implant çevresindeki toplanabilir. Yansıtma (a) ve geçirgenlik (b), cihaz lokalizasyonu izin verirken, floresan antikor ya da kimyasal etiketler (c, mikroglia ve yağmurluk anti-Iba1 etiketleme) rophages sağlam doku arayüz boyunca doku bileşenlerinin ayrıntılı görüntüleme sağlar. Ölçek çubuğu 200 mikron.
Discussion
Burada gösterilen "Cihaz Yakalama Histoloji" (DCHist) yöntemi, beyin dokusu ve doku implantları arasındaki morfolojik korunmuş etkileşimlerin yakın histolojik değerlendirmesine olanak tanır. DCHist doku toplama beyin implante bileşenleri kafatası monte edilmiş bir aygıt bileşenlerinin dikkatli bir şekilde ayrılması gerekir. DCHist de, kalın bir histolojik doku dilim (> 250 um) toplanması gerekmektedir. Bu doku kesitlerinde, bir kez, etiketli temizlenmiş, monte, ve görüntülü, implantasyon yaralanma veya kalıcı cihazlar izleyen kronik tepkisi konusuna yeni bakış açıları sağlayabilir. Şekil 3-5 de gösterildiği gibi ileri mikroskopi araçları kullanarak, doku ve cihaz arasındaki arayüz imaged olabilir ve yüksek detaylı olarak incelenmiştir.
Mevcut formunda sunulan teknikler yavaş yavaş aşağı cihazın implantasyonu noktasına iki parçalı diş çimento ve Kwik-Sil yapılan headcap uzakta kazmaya yeteneğine güveniyor.Uzaklıkta yanmış veya başka çıkarılabilir diş çimento ve küçük makas görsel ölçüde başarıyla kafatası monte bileşenleri implante cihaz ayıran yardımcı rehberlik hangi aracılığıyla açık bir silikon elastomer kullanılması. In situ onu toplamak için kafatası altı ve beyin yukarıda cihaz kesmek çalışmak kafatası monte edilmiş bir implant beyin, önemli miktarda çıkardı edileceği gibi, tavsiye edilmez.
Böyle NeuroNexus Technologies tek saplı ÇÇA'lar gibi ince, daha küçük implantlar, DCHist en müsait olmasına rağmen, ilkeleri tek bir cihaz Shanks veya mikroelektrot diziler ile sınırlı değildir. Toplama ve görüntüleme stratejilerini gereksinimleri herhangi bir kafatası montaj ayrılmış ve kalın bir doku bölüm içinde toplanması gerektiğini olmanın, multi-şaft cihazları ve kanüller gibi büyük implantlar geniş uygulanabilir. Yazarlar doku analizi üzerinde duruldu rağmenÇevre kortikal implantlar, beynin derinliklerine tahrik cihazları da toplanan ve yansıması olabilir. Implant yerleştirme ve derinlik cihaz ekleme bilinen açıdan vahşice sapma şartıyla bir dilim içinde implant yakalama etkilememelidir.
Sınırlamalar DCHist yöntemin yararlı bir uygulama için mevcuttur. Optik temizleme çözümleri büyük ölçüde çeşitli dokularda 21 görüntüleme derinlikleri artırabilir ancak Beyin doku kesitlerinde, özellikle beyaz cevher alanlarında, mikrometre yüzlerce görüntü meydan okuyorlar. İlave görüntüleme derinlik arttırmak için, iki-foton uyarılması tarif edilen optik mikroskopi temizleme ile birlikte kullanılabilir.
Tarif edilen yöntemin bir başka potansiyel sınırlama araştırmacılar tarafından kullanılan özel floresan immünohistokimya yöntemler ve antikorları olabilir. Pasif difüzyon genellikle sabit dokusu ile bu belirteçlerin eklenmesi sürücülerve antijen bağlama siteleri üzerine. Final antikor çalışma konsantrasyonları arka etiketleme yüksek düzeylerde kaçınarak etiketi penetrasyonu maksimize vaka bazında bir durumda ilgili araştırmacılar tarafından tespit edilmelidir. Antikor etiketleme aynı işlenir dilimleri arasında değişken olmamalıdır, ancak farklı antikorları bazı antikorlar kolayca antijenleri mikrometre sadece onlarca derin antijenleri etiketlenmesi birçok derin yüz mikrometre ve diğer etiketleme ile antijen nüfuz ve etiketlemek için yeteneklerini önemli ölçüde değişebilir. Biz uygulama birden fazla gün için, tipik konsantrasyonları daha yüksek de antikor etiketler ekleyerek bu difüzyon iyileştirilmesi ve seyreltik deterjan içeren ve serum engelleyen bir çözüm. Tanımlayınız Periyodik dilimleri saygısız dahi etiketleme destekler. Antijen alma adımları ve alternatif fiksasyon süreçler (örneğin glutaraldehid, mikrodalga, vb) belirli antijenleri için uygun olabilir. İkincil antikor-fluorochBu Invitrogen Alexa Fluor etiketleri kullanarak yazarlar tarafından gözlenmemiştir olsa rome konjugatları da kalın kesitler etiketleme performans değişebilir. Alternatif olarak, ilgi hücre tiplerinde floresan protein eksprese eden transgenik hayvan deneklerin, antikor etiket penetrasyon ile ilgili sorunları önlemek için kullanılan olabilir örneğin eGFP gibi birçok floresan protein olarak, formaldehit ile tedavi sonrası floresan korumak ve doku kesitlerinde hemen görüntülenebilir.
DCHist beyin dokusu üzerine implante Mikrocihazların etkisini yakalamak ve analiz etmek için teknikler güçlü bir kümesidir. Elektrofizyoloji kalitesi ve elektrot empedans verileri 22 in vivo değerlendirilmesi ile bu histolojik protokol Coupling ölçüde fizyolojisi değişkenliği ve bozunma biyolojik kaynaklarının anlayışımızı artırabilir. Özellikle implant sinir protez cihazları alanında detaylı DCHist ima yararlanabilirbiyolojik nötr MEA cihazların geliştirilmesi bilgilendirmek için sağlam cihaz / doku arayüzünün ging.
Disclosures
Yazarlar, mali ya da başka ilan etmek hiçbir ilgili açıklamaları var.
Acknowledgments
Tüm deneyler Purdue Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu ve Purdue Üniversitesi Laboratuar Hayvan Programı gözetiminde yapıldı.
Bu çalışma sayesinde, Güvenilir Sinir Teknolojisi Programı kapsamında Dr Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) himayesinde Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) Microsystems Teknoloji Ofisi (MTO) tarafından sponsor oldu Uzay ve Deniz Harp Sistemleri Komutanlığı (SPAWAR) Sistemleri Merkezi (SSC) Pasifik Hibe No N66001-11-1-4013.
Yazarlar mikroskopi uzmanlık paylaşımı için Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor, ve Kevin Eliceiri teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| H–chst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
| Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
| Equipment | |||
| Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
| Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
| Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
| Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
| Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
| Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
| Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
| 24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
| Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ’Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
| Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap | |
References
- Schwartz, A. B. Cortical Neural Prosthetics. Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).
- Normann, R. A. Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system. Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).
- Rousche, P., Normann, R. A. Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex. Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).
- Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation. Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).
- Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors. Hearing Research. 210, 112-117 (2005).
- Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).
- Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).
- Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants. J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).
- Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).
- Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Research. 983, 23-35 (2003).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. J. Neural Eng. 6, 056003 (2009).
- Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays. J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).
- Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes. J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).
- Wilks, S. Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation. Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).
- Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances. IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).
- Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes. IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).
- Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology. Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Li, Y., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).
- Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces. J. Vis. Exp. (60), e3566 (2012).
