Elektroporation af baghjerne at spore axonale baner og Synaptic Mål i Chick Embryo
Summary
Hvor neuronale netværk er etableret i embryonale hjernen er et grundlæggende spørgsmål i udviklingspsykologi neurobiologi. Her har vi kombineret en elektroporation teknik med nye genetiske værktøjer, såsom Cre / Lox-plasmider og PiggyBac-medieret DNA gennemførelse system i aviær baghjerne at mærke dorsale interneuroner og spore deres axonale fremskrivninger og synaptiske mål på forskellige udviklingsstadier.
Abstract
Elektroporation af kylling embryonale neuralrøret har mange fordele, såsom at være hurtig og effektiv for ekspressionen af fremmede gener i neuronale celler. I dette manuskript giver vi en metode, der viser entydigt, hvordan man elektroporere DNA i aviær baghjerne på E2.75 for at specifikt mærke en delmængde af neuronale stamceller og hvordan man følge deres axonale fremskrivninger og synaptiske mål til meget fremskredne stadier af udvikling, op til E14.5. Vi har udnyttet nye genetiske værktøjer, herunder specifikke enhancerelementer, Cre / Lox – baserede plasmider og PiggyBac-medieret DNA gennemførelse system til at drive GFP udtryk i en undertype af baghjernen celler (dorsale mest undergruppe af interneuroner, DA1). Axonale baner og mål for DA1 axoner følges på tidlige og sene embryonale stadier på forskellige hjernestammen regioner. Denne strategi bidrager avancerede teknikker til at målrette celler af interesse i den embryonale baghjerne og trasiering kredsløb dannelse på flere stadier af udvikling.
Introduction
Baghjerne repræsenterer en vigtig relay hub af nervesystemet ved at kommunikere mellem de centrale og perifere nervesystem via stigende og faldende neuronale netværk. Det regulerer de grundlæggende funktioner, herunder respiration, bevidsthed, hørelse og motorik 1-3. I den tidlige fosterudvikling, er hvirveldyr baghjerne forbigående opdelt langs dens anterior-posterior (AP) akse i gentagne rhombomeres, hvor distinkte neuronale celletyper dannes og generere flere hjernestammen kerner centre 4.. Baghjerne er også opdelt langs dens ryg-ventrale (DV) akse i et basal og Alar plade, hvor diskrete neuronale forfædre bliver specificeret og differentiere forskellige DV steder 3,5,6. Hvordan den tidlige AP og DV-specifikke neuronale mønstre for oprettelse af funktionelle hjernestammen circuitries er stort set ukendt.
At få viden om denne grundlæggendeSpørgsmålet er værktøjer der kræves for at mærke specifikke delmængder af neuroner i den tidlige baghjerne og spore deres axonale baner og tilslutningsmuligheder til mere fremskredne stadier. Vi har tidligere anvendt specifikke enhancerelementer, og en Cre / LoxP-baserede betinget ekspressionssystem til sporing axonal bane af dorsale spinale interneuroner i det tidlige hønseembryo 7-9. I den nuværende manuskript, vi har målrettet baghjerne og opgraderet den eksperimentelle paradigme for mærkning sene embryonale baghjernen interneuroner, axoner og deres synaptiske mål, ved hjælp af en modificeret elektroporation strategien og PiggyBac – medieret DNA gennemførelse. Vores nye strategi giver mulighed for mærkning af distinkte neuronale undertyper i den ene side af baghjerne og sporing af deres axonale fremskrivninger og synaptiske sites på forskellige fosterstadiet, fra 2 op til 12 dage efter elektroporation. Baseret på denne metode, mærkede vi den dorsale-de fleste undergruppe af baghjernen interneuroner (dA1/Atoh1 + </sup> celler) og afslørede to kontralaterale opstigende axonale projektion mønstre, der hver stammer fra en anden AP placering og elongates i en særskilt funiculus. DA1 axoner blev fundet projekt og danner synapser i den auditive kerner, midthjernen og i flere lag af cerebellum 10..
Kombinationen af chick elektroporation, genetiske sporing af neuroner og analyse af projektions steder på meget fremskredne stadier af udvikling giver en unik platform for at studere dannelsen af neuronale netværk i hjernen og at belyse molekylære mekanismer, som regulerer kredsløb dannelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
I ovo elektroporation er en realistisk, pålidelig og effektivt redskab til at undersøge celle specifikation og axonal vejledning i chick nervesystem udvikling 20.. I denne protokol beskriver vi en tilstand af elektroporation i chick baghjerne på E2.75 hjælp enhancerelementer som muliggør den betingede mærkning af specifikke interneuroner. Denne strategi er kombineret med det PiggyBac-medierede gennemførelse system til at indsætte fremmede gener i chick genomet, hvilket muliggør sporing af ax…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
- Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
- Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
- Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
- Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
- Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
- Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
- Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
- Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
- Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
- Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
- Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
- Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
- Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
- Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
- Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
- Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
