皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

Summary

ニューロンにおける経験依存的分子変化は行動の課題に応じて適応する脳の能力のために不可欠である。アン

Abstract

経験に応じて変更することが脳の能力は、健康な脳機能に不可欠であり、この過程で異常が脳障害の^1,2の様に貢献しています。より良い脳の回路は、動物の経験に反応するメカニズムを理解するために生きている動物で、長期間にわたってニューロンの指定されたセットの中で経験依存分子の変化を監視する機能が必要です。経験と関連した神経活動は神経細胞^1,2における遺伝子発現の変化を引き起こすことが知られているが^、そのような変化を検出する方法のほとんどは、複数日にわたって同じニューロンの繰り返し観測を許可していないか、または個々のニューロン^3を観察するのに十分な解像度を持っていない^、4。ここでは、以上の個々の皮質ニューロンにおける経験依存性の遺伝子発現の変化を追跡するために遺伝的にコードされた蛍光レポーターを用いた in vivo二光子顕微鏡に組み合わせた方法を記載する日々の経験のコース。

定評のある経験依存性遺伝子の一つが活性調節細胞骨格関連タンパク質（ARC）は^5,6です。アークの転写は急速であり、非常に激化神経活動³により誘導され^、そのタンパク質産物は、グルタミン酸受容体との長期的なシナプス可塑性⁷のエンドサイトーシスを調節する。アークの発現は広く³特定の行動に関与する神経回路をマッピングするための分子マーカーとして使用されてきた。これらの研究の大部分では、アーク式は固定の脳切片におけるin situハイブリダイゼーションや免疫組織化学によって検出した。これらのメソッドはArcの発現が調べていなかったアーク発現の細胞パターン日間反復または一味違った体験の複数のエピソードに変更される可能性がありますどのように、行動の経験の後、興奮性ニューロンのサブセットに局在していたことが明らかになっていますが。

ntentが"> 生体内では 2光子顕微鏡は、生きている脳^8,9における経験依存的細胞の変化を調べるための強力な方法を提供しています。2光子顕微鏡による生きた神経細胞におけるアーク式の検査を有効にするには、我々は、以前に生成されたノックをGFPレポーターが内因性アークプロモーター¹⁰の制御下に置かれているマウス系統インチこのプロトコルでは、生きた動物におけるニューロンのアンサンブルにおける経験依存アーク-GFPの発現パターンを追跡するための手術の準備と撮像法について説明していますこの方法では、慢性頭蓋窓は最初の利息の皮質領域にわたってアーク-GFPマウスに移植した。これらの動物は、その後、繰り返し数日間にわたって所望の行動パラダイム後の2光子顕微鏡で撮像した。このメソッドは、帳簿動物に一般的に適用することができる経験依存性分子の変化の他の蛍光レポーター^4。

Protocol

後述の実験手順は、メンタルヘルス動物のケアと使用委員会の国立研究所によって承認され、 実験動物の管理と使用のための健康ガイドの国立研究所に合わせてあった。

1。術前準備

1. 無菌手術前にホットビーズ滅菌器ですべてのツールをきれいにし、70％エタノールで手術部位を掃除し、きれいなドロップ布を下に置く。滅菌手袋を着用してください。 intraperitonially 0.02ミリリットル/ gであり、与えられた時に作りたての1.2パーセントAVERTIN溶液で動物を麻酔。あるいは、受動スカベンジャー回路付きノーズコーン、誘導のための5％、メンテナンスのために1.5％、イソフルランを通してガスと麻酔。完全鎮静状態を確保するためにテールやつま先ピンチを使用して麻酔レベルをチェックします。
2. 無菌の眼軟膏を用いて動物の目をカバーし、作りたてのデキサメタゾンを注入する（0.2 mg / kg）及びカルプロフェン（5 mg / kg）をsubcutaneousl脳の腫れや炎症^を防ぐために^、11 yである。耳の間の頭蓋骨の上の毛を剃ると、ベタジンスクラブと70％エタノール3交互綿棒で皮膚を消毒する。
3. earbarsと定位手術の段階で動物をマウントし、37℃に設定動物下水循環加熱パッド付き℃、定期的に動物の麻酔レベルをチェックし、必要に応じてオリジナルの麻酔量を補う。
4. エリアを麻痺させるために、頭皮の皮膚の下に0.5％Marcaineの200μlを注入します。皮膚を切開し、頭蓋骨の上に皮弁を取り外します。骨膜を取り外し、きれいな綿棒でその領域を乾燥させます。

2。慢性頭蓋窓手術

1. 穏やかに興味のある脳領域にわたって3〜5ミリメ​​ートルの直径の円を概説する0.5ミリメートルバリで高速歯科用ドリルを使用します。定期的にクリーン綿棒と滅菌0.9％食塩水と離れて明確な骨塵で掘削地点を濡らす。骨、出血した場​​合、gを使用するelfoamはブリードをブロットおよびそれが停止するのを待つように滅菌生理食塩水に浸漬した。
2. 最後の骨の層に到達すると、先の細いピンセットで骨の島を持ち上げて外します。ウィンドウは骨縫合を超えた場合に、骨の一番下の棚に硬添付ファイルが発生する可能性があります。骨弁が持ち上げられるように、これらは、優しく除去しなければならない。
3. ロールは、その表面をきれいにし、停止するために、任意の硬膜出血を待つさらさ硬膜の上にそっとゲル発泡体を湿らせた重要なステップは：すべての硬膜出血が停止するまで、先に進まないでください。頭蓋窓の中に閉じ込めになる血液は、通常不透明なウィンドウにつながる。
4. 関心領域は、硬膜は、特に厚さは場所の下にある場合、その上に硬膜を除去することが必要な場合があります。このような場合は、優しく、非常に微細鉗子で下PIAから硬膜を分離し、細かい鉗子の別のペアで持ち上げる硬膜の小さな切開を行い、その後、カットエッジをつかみ、そっと硬膜を分割します。硬膜が薄くても強いので、硬膜の無傷のエッジを持つ脳をスライスしないように注意してください。
5. 無菌ACSFまたは滅菌生理食塩水で洗い流してください。
6. 硬膜またはPIA経由で滅菌ガラスカバースリップ（3-5 mm）を築く重要なステップ：大幅頭蓋骨カーブを囲む場合は、硬膜またはPIAは地域でカバースリップとの密接な接触をすることはないだろうスペースを埋めるためにKwiksil ¹²接着剤を使用それが画像化されることはありません。
7. エラストマーの接着剤とガラスカバースリップの端をカバーするためにシアノアクリレートゲルを使用しています。 。任意シアノアクリレートゲルが脳表面に触れないように注意してください：シアノアクリレートゲル、またはkrazyglueと歯科用セメント混合物と全露出頭蓋骨重要なステップをカバーしています 。
8. 頭蓋骨の反対側の端にあるカスタムメイドの金属頭部固定バーを埋め込む。
9. ケトプロフェン、5 mg / kgを、foのintraperitonial注射後、暖かい回復室に動物を戻すrの疼痛管理。手術後2日以上鎮痛剤を続行します。
10. 術後の回復の2週間後には、（誘導の場合は5％、保守のための1.5％）イソフルランで動物を麻酔し、頭部固定用フレームを使用してカスタムメイドの顕微鏡ステージでそれをマウントし、光学的透明度のために頭蓋窓をチェック青色光と照明の下で。脳表面の血管の明瞭さは頭蓋窓の質の高い指標である。血管エッジがはっきりと定義されている場合、ウィンドウが使用可能である可能性が高い。 2週間の術後の回復時間は、手術から回復するために動物のための十分な時間を確保することをお勧めします。頭蓋窓は一般的にクリアして、改善するこの時期に、と硬膜の肥厚や頭蓋骨の再生、ウィンドウの画質を劣化させるまで数ヶ月に付加週間の光学的に透明なままです。

3。二光子顕微鏡を行動プロトコルおよびレーザー

1. 明確なcと動物ranial窓は環境刺激にさらされたり、行動のトレーニングセッションを行い、その後、最大アーク-GFP発現時にその後結像される。行動プロトコルを開始する前に、動物は、ベースラインアーク-GFPの発現レベルでの日々の変動を最小限にするために一貫性のあるホームケージ環境で保たれるべきである。
2. 興味のある脳領域に応じて、行動訓練や環境刺激パラダイムを開始します。例えば、動物が日連続で異なるビジュアルな環境にさらされることができ、視覚野¹⁰に刺激特異的応答を識別するための視覚的な刺激の後に毎日結像される。
3. ニューロンにおけるアーク-GFPの蛍光は、通常は2時間刺激した後にそのピークレベルに達する。実験のタイムラインは、そのピーク蛍光レベルでのニューロンにおけるアーク-GFP発現の検出を容易にするために最適化することができる。
4. 行動訓練セッションまたはenvironmenta後にlの刺激が完了すると、（誘導の場合は5％、保守のための1.5％）イソフルランで動物を麻酔し、二光子顕微鏡でヘッド固定用フレームを使用してカスタムメイドの顕微鏡ステージで動物をマウントします。
5. 動物の頭の位置が頭蓋骨に注入された金属棒を使って、ステージに直接接続し、ヘッド固定用フレームに固定されています。イソフルランと酸素が継続的にノーズコーンを介してマウスに供給される。体温は加熱パッドを使用して維持されます。
6. 顕微鏡の検出器は、暗い​​部屋で二光子レーザー走査を行うことで、周囲の光から保護されていることを確認します。イメージングのための20倍または25倍（開口数1.05）水​​浸レンズを使用しています。まず、落射蛍光照明の下で、将来像の位置合わせのためのCCDカメラを使って、対象の脳領域の上表面の血管パターンの画像を取得する。
7. 3次元画像スタックを取得するためにスキャン二光子レーザーを起動します。オリンパスFV1000MPEの多光子顕微鏡は、我々のセットアップで使用されています。二光子レーザーの励起波長は920 nmに設定されており、客観から出射されるレーザのパワーが約50 mWで設定されています。放出される蛍光を同時に標本の近くに配置し外部2チャンネルphotomutiplier検出システムを使用して、緑と赤のチャネル（570nmでのダイクロイックミラー、495から540 nmと570から625 nmにおけるバリアフィルタ）で検出される。組織の自家蛍光は、チャンネル^13、14の両方に表示され、一方の円弧GFP蛍光は唯一、緑のチャンネルに表示されます。
8. 典型的な画像スタックは約320x320x100μmの寸法（幅×長さ×深さ）が0.5μm/ピクセルの水平方向の解像度、と3μm/ピクセルの垂直方向の解像度を持っています。
9. 画像スタックを取得した後、そのホームケージに動物を返す。次の行動やイメージングセッションまで動物を乱すことがありません。 desirとして日間にわたる行動やイメージング手順を繰り返しエド。同じ画像の場所に戻って方向付けるために以前に取得した脳表面の血管画像を使用しています。

Representative Results

このプロトコルは、生きた動物の個々の皮質ニューロンにおける経験依存的分子の変化を追跡する方法について説明します。慢性頭蓋ウィンドウが最初に遺伝子発現の蛍光レポーターを運ぶマウスへの関心の皮質領域上に作成されます。二光子顕微鏡は、その後、個々のニューロンにおける行動的に誘発され分子の変化を観察して、複数の日にわたってニューロンの同じセットでこのように変化します（ 図1）を追跡するために、様々な行動パラダイムと結合することができる。

アーク-GFPマウスでは、アーク遺伝子発現における経験依存的変化は確実にこのプロトコルを使用して、複数の日のための個々の皮質ニューロンで撮像することができる。トランスジェニックアーク-GFPノックインマウス即時型初期遺伝子Arcの内因性プロモーター（ 図2）の制御下で不安定に緑色蛍光タンパク質（d2EGFP、タンパク質半減期約2時間）を発現する。

ontentは">慢性頭蓋のウィンドウについて説明した過去のプロトコルが成功した頭蓋窓手術^11を行う上で重要なステップを概説しました。このプロトコルは、必要に応じて硬膜を除去するのに追加のガイダンスを提供し、このようなウィンドウが頭蓋骨縫合の上に位置しているときに明確な光学窓を得る可能性を増加させる（ステップ2.4​​を参照）。

頭蓋窓の手術からの回復後、動物はカスタムメイドのヘッド固定用フレームとステージに取り付けられている。 図3は、2光子イメージング中に使用headbarとヘッド固定枠を描いている。一貫性のある二光子顕微鏡イメージングステージ位置とセットアップを維持することは、以前に画像化された脳の領域に戻った時に画像の日常の再編を促進し、複数の動物が同じ日に（ 図4）上に結像されたときの実験効率を向上することができます。

行動訓練や環境刺激の間に、それは賢明です家の動物に単独で、かつ環境に一貫性のあるホームケージの場所に、背景アーク-GFPの活性化レベルでの日々の変動（ 図1）を最小限に抑えることができます。

安定した、明確な頭蓋窓の重要なサインは落射蛍光灯照明下で血管の鮮明なパターンです。この血管パターンは、イメージングの複数の日（ 図5）の向こう側に大幅に変更しないでください。

図6は 、ベースラインのホームケージ条件（）の下に、新しい運動行動（B）のパフォーマンス後に前頭皮質ニューロンにおけるアーク-GFPの発現パターンを示しています。同じ動物でも同じ脳の領域における層II / IIIの皮質ニューロンを確実に撮像することができる、と同じニューロンイメージングの複数日間にわたって識別することができるはずです。それは、ニューロンの数百人をサンプリングするために、3次元画像スタックを収集するのが一般的です。ニューロンの縁は画像の全体にシャープで明確にする必要がありますタック。赤のチャネル組織の自己蛍光は、ウィンドウの明快さのインデックスを提供します。撮像された領域は、日間の大幅murkierなった場合、頭蓋窓の品質が劣化している可能性が高い。典型的な頭蓋窓は、少なくとも1週間は光学的に透明なままになります。数ヶ月〜数週間後、硬膜の肥厚及び頭蓋窓の端から頭蓋骨の再生は、最終的にさらにイメージング実験を防ぐことができます。

図1実験のステップを概説スキーマ。動物の準備フェーズでは、頭蓋窓手術はアーク-GFPマウスで実行されます。動物は自分のホームケージ内手術から回復するのに約2週間与えられている。頭蓋の窓の透明度は、その後、落射蛍光顕微鏡を用いて検査されます。窓はイメージングのための準備が整っている場合は、動物は単独で静かな、一貫性のある環境に収容されていますホームケージ環境、そこから実験的なタイムライン·フェーズが開始することができます。行動刺激プロトコルおよびイメージング間隔は通常は2時間活性化した後に発生し、そのピーク蛍光でアーク-GFPを検出するために調整することができる。行動刺激が完了した後、動物に麻酔をかけており、興味のある皮質領域は、2光子顕微鏡を用いた頭蓋窓を通して結像される。動物は、その後、ホームケージに戻されます。行動やイメージングのセッションは、必要に応じて日全体で繰り返し使用できます。

図2：アーク-GFPノックインをコードする遺伝子は、緑色蛍光タンパク質を不安定化されているマウス系統の構成を示す図では、即時型初期遺伝子Arcのコーディング部分を取り替えた。マウスのこの株では、GFPの発現は、内因性のアークプロモーターの制御下にある。この図は、に基づいて、再描画されます文献10に説明を入力します。

図3の回路と二光子イメージングに用いるヘッド固定セットアップの寸法。 headbarの固体半分は頭蓋骨の裏側（2.8節）に接着されており、ネジ穴に端がフレームに麻酔動物の頭を添付するために使用されます。ヘッド固定用フレームはネジで2極の上に取り付けられた薄い金属板で構成されています。

図4アーク-GFPマウスのイメージングのための2光子顕微鏡のセットアップをレーザ走査の例。 25倍の水浸レンズ、加熱パッドとヘッド固定用フレームを使用してカスタム顕微鏡ステージに注意してください。ここに示されている麻酔アーク-GFPマウスはin vivoイメージングの準備ができています。

図5：複数日間にわたる慢性頭蓋窓で脳表面の血管の画像、時間をかけて血管パターンの明瞭性と安定性を示す。脳の表面は青色光で照らされた、画像は顕微鏡に搭載されたCCDカメラで25倍の水浸レンズを通して撮影された。

図6つの異なる行動経験後、マウスの前頭皮質ニューロンにおけるアーク-GFPの発現パターンの in vivo二光子画像で 。 （A）マウスは初日にイメージを作成する前に、そのホームケージにとどまった。 （B）のマウスは二日目のイメージを作成する前に新たな運動行動を行った。同じ皮質領域の蛍光画像を同時に緑と赤のチャネルで獲得されました。組織の自家蛍光が両方のチャンネルに登場し、一方GFP蛍光は唯一、緑のチャンネルに登場しました。 Detectio赤と緑の両方のチャネルにおける組織の自己蛍光レベルが等しい測定値を持っており、これらのパラメータは実験を通して維持されたように、n個のパラメータが設定されていました。赤のチャネルの信号は、その後オフラインで分析中に広帯域組織の自己蛍光を除去するために、緑のチャネル信号から差し引いた。厚さ18μmの3次元画像スタックから得られた緑色蛍光シグナルはアーク-GFP発現の細胞パターンのトップダウンビューを提供するために、水平面に最大強度によって投影された。スケールバーは、30μmである。

Discussion

ここで説明するin vivoイメージング法で生きている動物で、複数の日にわたってニューロンの同じセットでアーク遺伝子発現変化の反復検査が可能になります。それは様々な行動の経験に応じて、個々のニューロンにおける神経可塑性関連分子動力学に関する情報を取得するための効率的かつ汎用性の高い方法です。そのようなin situハイブリダイゼーションおよび免疫染色のように標準的な組織化学的方法は、単一セルの解像度^3を達成^しますが^、複数日にわたって同じニューロンにおける遺伝子発現の変化を追跡する能力を欠いていることができます。生物発光は、磁気共鳴、または核イメージング法は、適切な記者¹⁵を通って同じ動物における遺伝子発現の変化を追跡^しますが^、個々のニューロンにおける発現レベルを区別するために空間分解能が不足していることができます。このように、遺伝子発現の変化を測定するためには、他の既存の手法では、空間分解能と時間的なCOVの両方に一致することはできませんここで説明した撮像方法のerage。

この手順の重要なステップは、頭蓋窓手術です。これは、炎症の原因となり、頭蓋窓の透明度を削減するカバーガラス、下に脳や血液に残す外傷を避けるために細心の注意を持って行われるべきである。ウィンドウの端から頭蓋骨の硬膜の肥厚や再増殖がさらにイメージングを防ぐまでは適切に実施された頭蓋の手術については、ウィンドウは数週間のための明確なままになります。必要に応じて硬膜を頭蓋窓の光学的透明性を高めるために^、ラットとサル^16,17の慢性光学イメージング実験のために行われてきたように、削除することができます。

このプロトコルに使用される二光子顕微鏡技術の制限は撮像深度です。高品質の画像を得ることができる最大撮像深度は頭蓋窓の明瞭度、顕微鏡のセットアップ、およびfluorescの明るさに左右される耳鼻咽喉科記者。軟膜表面下300μmのアーク-GFPマウスのために、我々は一般的にイメージアップする。深い脳領域における遺伝子発現の変化を調べるために、蛍光microendoscopyは、従来の2光子顕微鏡¹⁸の深さ制限を克服するために適用することができる。

in vivoイメージング法でこれに決定し遺伝子発現の変化のための潜在的な交絡要因が行動のパフォーマンスやARC-GFPの誘導を妨げる可能性頭蓋手術や麻酔からの長引く影響を含む。それは、第1の固定脳切片における特定の経験に応じて、アーク-GFPの活性化の全体的な範囲を確認し、 生体内で二光子顕微鏡を用いて繰り返しイメージングにより観察範囲に、これを比較することが重要です。術後の回復期間と繰り返しイメージング間隔は次にアーク-GFPの活性化に対する手術や麻酔の副作用の可能性を最小限に抑えるように調整することができます。

_content ">撮像方法はここで説明するが、他の経験調節遺伝子⁴の蛍光レポーターを有するトランスジェニックマウスに一般的に適用可能性が高いです。さらに、蛍光標識されたニューロン^8,9の形態を強調マーカー^、または指標と組み合わせることができますこれらのニューロン^19、20の神経生理学的活動を反映している。これらの更なるアプリケーションは個々のニューロンにおける経験依存的分子変化のより包括的なビューを提供し、通常動作時は、神経細胞で起こる構造的及び機能修正にこれらの分子の変化を関連付けることができるか、病的な経験。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FV1000 multi-photon laser scanning microscope	Olympus	FV1000MPE	Imaging
Dissection microscope	Omano	555V107	Surgery
Stereotaxis surgery stage for mice	Harvard Apparatus	726335	Surgery
20X or 25X water immersion objective	Olympus	XLPL25XWMP	Imaging
Microscope stage with head-fixation frame	Custom made	N/A	Imaging
Fine forceps	Fine Science Tools	11251-20	Surgery
Dental drill burr	Fine Science Tools	19007-05	Surgery
CCD camera	QImaging	QICAM 12-bit	Imaging