Summary
Erfarenhet beroende molekylära förändringar i nervceller är viktiga för hjärnans förmåga att anpassa sig till följd av beteendemässiga problem. En
Abstract
Hjärnans förmåga att förändras som svar på erfarenhet är väsentlig för friska hjärnans funktion, och avvikelser i denna process bidrar till en mängd olika sjukdomar i hjärnan 1,2. För att bättre förstå de mekanismer genom vilka hjärnans kretsar reagerar på ett djurs upplevelse kräver förmåga att övervaka erfarenhet beroende molekylära förändringar i en viss uppsättning av nervceller under en längre tid, i det levande djuret. Medan erfarenhet och tillhörande neural aktivitet är känd för att utlösa förändringar genuttryck i nervceller 1,2, de flesta av de metoder upptäcka sådana förändringar tillåter inte upprepas observation av samma nervceller över flera dagar eller inte har tillräcklig upplösning för att observera enskilda nervceller 3 , 4. Här beskriver vi en metod som kombinerar in vivo två-foton mikroskopi med en genetiskt kodad fluorescerande reporter att spåra erfarenhet-beroende förändringar genuttryck i enskilda kortikala neuroner över Under dag till dag erfarenhet.
En av de väletablerade erfarenhet-beroende gener är Aktivitet reglerade cytoskelett associerat protein (Arc) 5,6. Transkriptionen av Arc är snabbt och mycket induceras av intensifierade neuronal aktivitet 3, och dess proteinprodukt reglerar endocytos av glutamatreceptorer och långsiktig synaptisk plasticitet 7. Uttrycket av Arc har allmänt använts som en molekylär markör för att mappa neuronala kretsarna involverade i specifika beteenden 3. I de flesta av dessa studier Arc uttryck detekteras genom in situ hybridisering eller immunohistokemi i fasta hjärnan sektioner. Även om dessa metoder visade att uttrycket av Arc lokaliserades till en delmängd av excitatoriska nervceller efter beteende erfarenhet, hur de cellulära mönster av Arc uttryck kan ändras med flera episoder av upprepade eller särskiljande upplevelser under dagarna inte undersöktes.
ntent "> In vivo två-foton mikroskopi erbjuder ett kraftfullt sätt att undersöka erfarenheterna cellulär förändringar i den levande hjärnan 8,9. För att granskningen av Arc uttryck i levande nervceller med två-foton mikroskopi, genererade vi tidigare en knock- i mus linje där en GFP reporter placeras under kontroll av den endogena Arc promotorn 10. Detta protokoll beskriver kirurgiska förberedelser och procedurer imaging för att spåra erfarenhet-beroende Arc-GFP uttryck mönster i neuronala ensembler i det levande djuret. I denna metod , kroniska kraniala fönster först implanteras i Arc-GFP möss över kortikala regionerna av intresse. Dessa djur sedan upprepade gånger avbildas genom två-foton mikroskopi efter önskade beteendet paradigm under loppet av flera dagar. kan vara tillämplig för djur som bär denna metod andra fluorescerande reportrar erfarenhet beroende molekylära förändringar 4.Protocol
De experimentella procedurer som beskrivs nedan godkändes av National Institute of Mental Health Animal Care och användning kommittén och var i enlighet med National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur.
1. Preoperativ Förberedelser
- Rengör alla verktyg i en varm pärla autoklav före aseptisk kirurgi, rengör operationsstället med 70% etanol, och lägga ner ren droppe dukar. Bär sterila handskar. Bedöva djuret med nyberedd 1,2% Avertin lösning, gavs vid 0,02 ml / g, intraperitonially. Alternativt söva med isofluran gas genom en noskon, 5% för induktion, 1,5% för underhåll, med en passiv renhållare krets. Kontrollera anestesi nivån med svans eller tå klämmer för att säkerställa full sedering.
- Täck djurets ögon med steril oftalmisk salva, och injicera nyberedd dexametason (0,2 mg / kg) och karprofen (5 mg / kg) subcutaneously för att förhindra hjärnans svullnad och inflammation 11. Raka håret över skallen mellan öronen, och sterilisera huden med Betadine scrub och tre alternerande svabbar av 70% etanol.
- Montera djuret i en stereotaxisk kirurgi steg med earbars, med en vatten cirkulation värmedyna under djuret inställd vid 37 ° C. Kontrollera regelbundet djurets anestesi nivåer och komplettera den ursprungliga narkos dosen efter behov.
- Injicera 200 ul 0,5% Marcain under hårbotten huden för att bedöva området. Incise huden och ta bort huden luckan över skallen. Ta bort periostet och torka området med rena tops.
2. Kronisk Kranial fönster Kirurgi
- Använd en snabb tandläkarborr med en 0,5 mm skägg försiktigt beskriva en 3-5 cirkel mm över hjärnan regionen av intresse. Periodvis väta borrplatsen med steril 0,9% koksaltlösning och tydlig bort ben damm med rena tops. Om ben blöder, använd gelfoam förindränkta med steril koksaltlösning för att utplåna de blöda och vänta på att sluta.
- När den sista benet lagret nås, lyfter och ta bort ben ön med spetsig tång. Dura bilagor till nedersta hyllan av benet kan uppstå om fönstret korsar ett ben sutur. Dessa bör försiktigt bort som benklaffen lyfts.
- Roll fuktad gel skum försiktigt över den exponerade duran för att rengöra ytan och vänta på någon dural blödningen att sluta kritiskt steg:. Inte fortsätta förrän alla durala blödningen har slutat. Blod som blir instängda i kraniala fönstret leder vanligtvis till en ogenomskinlig fönster.
- Om området av intresse är under en plats där dura är särskilt tjock, avlägsnande dura ovan kan det vara nödvändigt. Om så är fallet, försiktigt separera dura från pia nedan med mycket fina pincett, gör ett litet snitt i upplyft dura med ett annat par fina pincett, sedan tag de skurna kanterna och försiktigtdela dura. Dura är tunn men stark, så var försiktig att inte skära hjärnan med intakta kanter duran.
- Skölj området med sterila ACSF eller steril koksaltlösning.
- Lägg en steril täckglas (3-5 mm) över duran eller pia kritiskt steg:. Om de omgivande skallen kurvorna betydligt använder Kwiksil 12 lim för att fylla i utrymmen där dura eller pia inte skulle göra nära kontakt med täckglas i regioner som inte kommer att avbildas.
- Använd cyanoakrylat gel för att täcka elastomeren bindemedlet och kanterna hos täckglas. Täck hela exponerade skallen med cyanoakrylat gel, eller en krazyglue och tandvård cementblandning kritiskt steg:. Låt inte någon cyanoakrylat gel röra hjärnans yta.
- Bädda en skräddarsydd metallstång huvud fixering vid den motsatta änden av skallen.
- Tillbaka djuret till en varm återhämtning kammare, efter en intraperitonial injektion av ketoprofen, 5 mg / kg, FOR smärtlindring. Fortsätt analgetikum för två dagar postoperativt.
- Efter två veckor av postoperativ återhämtning söva djuret med isofluran (5% för induktion, 1,5% för underhåll), montera den i en skräddarsydd mikroskop scenen med ett huvud-fixering ram och kontrollera kraniala fönstret för optisk klarhet under belysning med blått ljus. Hjärnans yta blodkärl klarhet är mycket tecken på kranial fönster kvalitet. Om blodkärlens kanterna är skarpt definierade, är fönstret sannolikt kan utnyttjas. De två veckor postoperativ återhämtning tid rekommenderas att medge tillräcklig tid för djuret att återhämta sig från operation. Kraniala fönstren klara normalt och förbättras under denna tid, och förblir optiskt transparent för ytterligare veckor till månader tills återväxt av skallen eller förtjockning av dura försämrar fönstret kvalitet.
3. Behavioral protokoll och Laser Scanning två-photon mikroskopi
- Djur med tydliga cranial fönster kommer att utsättas för en miljö stimulans eller utsätts för en beteendevetenskaplig träningspass och sedan avbildas efteråt vid maximal Arc-GFP uttryck. Innan ett beteende protokoll ska djuret hållas på ett konsekvent hembur miljö för att minimera dag till dag variation i baslinjen Arc-GFP uttrycksnivåer.
- Börja beteendemässiga utbildning eller miljö paradigm stimulering, beroende på hjärnan regionen av intresse. Till exempel, kan djuren utsättas för olika visuella miljöer under dagar i följd, och avbildas varje dag efter visuell stimulering för att identifiera stimulans-specifika svar i den visuella cortex 10.
- Arc-GFP fluorescens i nervceller når vanligtvis sin högsta nivå två timmar efter stimulering. Den experimentella tidslinje kan optimeras för att underlätta upptäckten av Arc-GFP uttryck i nervceller på topp fluorescens nivåer.
- Efter en beteendemässig träningspass eller environmentaL stimulering är klar söva djuret med isofluran (5% för induktion, 1,5% för underhåll) och montera djur i skräddarsydda mikroskop scenen med huvud-fixering ramen under två-photon mikroskop.
- Djurets huvud fixeras till huvudet fixering ram som ansluts direkt till scenen, med den implanterade metall bar på skallen. Isofluran och syre tillförs kontinuerligt till musen genom en noskon. Kroppstemperaturen upprätthålls med hjälp av en värmedyna.
- Säkerställ att mikroskop detektorerna skyddas från omgivande ljus genom att utföra två-foton laserskanning i ett mörkt rum. Använd en 20x eller 25x (1,05 numerisk apertur) objektiv nedsänkning i vatten för avbildning. Först under epi-fluorescens belysning, skaffa en bild av fartygets yta blod mönster över hjärnan regionen av intresse med en CCD-kamera för framtida bildjustering.
- Start två-photon laserskanning skaffa en 3-D bild stacken. En Olympus FV1000MPE flera foton mikroskop används i vår inställning. Excitation våglängd av två-foton-laser inställd på 920 nm, och effekten hos lasern som utsänds från målet är satt till ungefär 50 mW. Avgiven fluorescens samtidigt detekteras i gröna och röda kanaler (dikroisk spegel vid 570 nm, spärrfilter vid 495-540 nm och 570-625 nm), med hjälp av en extern två-kanals system photomutiplier upptäckt placeras nära provet. Arc-GFP fluorescens visas endast i den gröna kanalen, medan vävnad automatisk fluorescens visas i båda kanalerna 13, 14.
- Typiska bildstaplar har mått på cirka 320x320x100 im (bredd x längd x djup), en horisontell upplösning på 0,5 um / pixel, och en vertikal upplösning på 3 um / pixel.
- Efter förvärvet bilden stacken, tillbaka djuret till sitt hem bur. Stör inte djuren till nästa beteende och bildbehandling session. Upprepa beteende och bildbehandling förfaranden över dagar som önskvärted. Använd tidigare förvärvade hjärnans yta bild blodkärl att orientera tillbaka till samma avbildning plats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver en metod för att spåra erfarenhet beroende molekylära förändringar i enskilda kortikala neuroner i levande djur. En kronisk kraniell fönster först skapade över en kortikal område av intresse i en mus bär en fluorescerande reporter av genuttryck. Två-foton mikroskopi kan sedan kopplas med olika beteendemässiga paradigm att observera beteendemässigt inducerade molekylära förändringar i enskilda nervceller och spåra sådana förändringar i samma uppsättningar av nervceller över flera dagar (figur 1).
I Arc-GFP möss kan uppleva beroende förändringar i Arc genuttryck tillförlitligt avbildas i enskilda kortikala neuroner för flera dagar med detta protokoll. Den transgena Arc-GFP knock-in mus uttrycker en destabiliserade grönt fluorescerande protein (d2EGFP, protein halveringstid cirka två timmar) under kontroll av den endogena promotorn av den omedelbara tidiga genen Arc (Figur 2).
ontent "> Tidigare protokoll som beskriver kroniska kraniala fönster har skisserat kritiska steg i dirigering framgångsrika kraniella fönster operationer 11. Detta protokoll ger ytterligare vägledning i att ta bort dura om det behövs, vilket ökar sannolikheten för att få tydliga optiska fönster när sådana fönster är belägna över skallen suturer (se steg 2,4).Efter återhämtning från kranial fönster kirurgi, djuren monterade i en skräddarsydd huvud-fixering ram och scen. Skildrar headbar och huvud-fixering ram som används under två-photon avbildning Figur 3. Att upprätthålla en konsekvent två-foton mikroskop ställning avbildning scenen och installation kommer att underlätta dag till dag omläggning av bilder när de återvänder till en tidigare avbildat hjärna regionen och öka experimentell effektivitet när flera djur avbildas på samma dag (Figur 4).
Under beteendemässiga utbildning eller miljö stimulering, är det lämpligtatt hysa djuren ensamma, och på ett miljömässigt konsekvent hembur plats för att minimera dag till dag fluktuationer i bakgrunden Arc-GFP aktivering nivåer (figur 1).
En kritisk tecken på en stabil, tydlig kraniell fönster är skarpa mönstret av blodkärl under epi-fluorescerande belysning. Denna blodkärl mönster bör inte ändras nämnvärt över flera dagar avbildning (Figur 5).
Figur 6 illustrerar uttrycksmönstren för Arc-GFP i frontala kortikala neuroner under en baslinje hembur tillstånd (A) och efter utförande av en ny motoriskt beteende (B). Layer II / III kortikala neuroner i hjärnan samma region i samma djur kan tillförlitligt avbildas, och samma nervceller bör kunna identifieras under flera dagar för bildframställning. Det är typiskt att samla en 3-D bildstapel att sampla hundratals neuroner. Neuron kanter ska vara skarpa och klara hela bilden splease. Tissue automatisk fluorescens i den röda kanalen ger också ett index för fönster klarhet. Om avbildade regionen blir drastiskt murkier över dagar, den kraniala fönstret kvaliteten sannolikt försämrats. En typisk kraniell fönster förblir optiskt klar för minst en vecka. Efter flera veckor till månader, kommer återväxten av skallen från kanterna på kranial fönstret och förtjockning av dura förhindra eventuellt ytterligare avbildning experiment.
Figur 1. Ett schema som beskriver de experimentella stegen. Under Animal förberedelsefasen är kraniala fönster operationer utförs på Arc-GFP möss. Djuren ges omkring två veckor att återhämta sig från operationen i sin hembur. Klarheten hos den kraniala fönstren kontrolleras sedan med epi-fluorescensmikroskopi. Om fönstren är klara för avbildning, djuren ensamma inrymt i en lugn, miljömässigt konsekventhembur miljö, varifrån den experimentella tidslinje fasen kan börja. Den beteendemässiga stimulans protokollet och avbildning intervallet kan anpassas för att upptäcka Arc-GFP på topp fluorescens, som vanligtvis inträffar två timmar efter aktivering. Efter den beteendemässiga stimuleringen är klar, är djuret bedövas och det kortikala regionen av intresse avbildas genom den kraniala fönstret med hjälp av två-foton-mikroskopi. Djuret återföres sedan till hembur. Beteendemässiga och bildhantering sessioner kan upprepas över dagar som önskas.
Figur 2. Ett diagram som illustrerar konstruktionen av Arc-GFP knock-i mus, på vilken en gen som kodar destabiliserat grönt fluorescerande protein ersatt den kodande delen av den omedelbara tidiga genen Arc. I denna stam av mus, är GFP-uttryck under kontroll av den endogena promotorn Arc. Detta diagram ritas utifrånbeskrivningen i Reference 10.
Figur 3. Schematisk och dimensioner av huvudet-fixering inställning används för två-foton avbildning. Den fasta delen av headbar limmas på baksidan av skallen (avsnitt 2,8), och änden med skruvhålet används för att fästa den bedövade djurets huvud till ramen. Huvudet-fixering ram består av en tunn metallplatta monterad ovanpå två poler med skruvar.
Figur 4. Exempel på laserskanning två-photon mikroskop setup för Arc-GFP möss avbildning. Notera 25x objektivet nedsänkning i vatten, värmedyna och anpassade mikroskop scenen med ett huvud-fixering ram. Den sövda Arc-GFP mus som visas här är redo för in vivo imaging.
Figur 5. Bilder av blod-hjärnbarriären ytfartyg i en kronisk kraniell fönster över flera dagar, visar tydlighet och stabilitet av mönster blodkärl över tiden. Hjärnans yta belystes med blått ljus, och bilderna togs genom en 25x nedsänkning i vatten lins med en CCD-kamera monterad på mikroskopet.
Figur 6. In vivo två-photon bilder av Arc-GFP uttryck mönster i frontal kortikala neuroner i en mus efter två olika beteendemässiga upplevelser. (A) mus stannade i sitt hem bur innan avbildning på den första dagen. (B) mus utförde en ny motor beteende före avbildning på den andra dagen. Fluorescerande bilder av samma kortikala region har samtidigt förvärvats i gröna och röda kanalerna. GFP fluorescens syntes endast i den gröna kanalen, medan vävnad autofluorescens dök upp i båda kanalerna. Detection parametrar in så att vävnad automatisk fluorescens nivåer i både röda och gröna kanaler hade lika avläsningar, och dessa parametrar upprätthölls under hela experiment. Den röda kanalsignalen sedan subtraheras från den gröna kanalsignalen att avlägsna bredband autofluorescens vävnad under off-line analys. De resulterande gröna fluorescerande signaler från en 18 nm tjocka 3-D bildstapel beräknades genom maximal intensitet mot horisontalplanet, för att ge en top-down syn på de cellulära mönster Arc-GFP uttryck. Skala bar, 30 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo imaging metod som beskrivs här möjliggör upprepad undersökning av uttryck Arc gen förändras i samma uppsättningar av nervceller under flera dagar i det levande djuret. Det är en effektiv och mångsidig metod för att få information om neurala plasticitet-relaterade molekyldynamik i enskilda nervceller som svar på olika beteendemässiga upplevelser. Standard histokemiska metoder såsom in situ hybridisering och immunfärgning kan uppnå encelliga upplösning 3, men saknar förmågan att spåra ändringar genuttryck i samma nervceller över flera dagar. Bioluminescens, magnetisk resonans, eller nukleära avbildningsmetoder kan spåra ändringar genuttryck i samma djur genom lämpliga reportrar 15, men saknar den rumsliga upplösningen för att särskilja expressionsnivåerna i enskilda nervceller. Som sådan kan inga andra befintliga metoder för att mäta förändringar genuttryck matcha både den rumsliga upplösningen och den tidsmässiga covnomsnittliga av bildgivande metoden som beskrivs här.
Ett kritiskt steg i denna procedur är den kraniala fönstret kirurgi. Det bör utföras med extra omsorg för att undvika trauma mot hjärnan eller lämnar blod under täckglas, vilket kommer att orsaka inflammation och minska tydligheten i kraniala fönster. För väl genomförda kraniala operationer, kommer fönstret vara öppen för flera veckor tills förtjockning av dura eller återväxt av skallen från kanterna på fönstret förhindra ytterligare avbildning. Dura kan tas bort vid behov, vilket har gjort för kroniska optisk avbildning experiment i råttor och apor 16,17, för att öka den optiska klarhet kraniala fönster.
En begränsning för två-foton mikroskopi teknik som används i detta protokoll är avbildning djup. Det maximala avbildning djup vid vilket högkvalitativa bilder kan erhållas beror på kraniala fönstret klarhet mikroskop setup, och ljusstyrkan hos fluoresc ka reportrar. För Arc-GFP möss, vi vanligtvis bild upp till 300 um under pial ytan. För att undersöka förändringar genuttryck i djupa hjärnregioner kan fluorescens microendoscopy appliceras för att övervinna djupet begränsningen i konventionella två-foton mikroskopi 18.
Potentiella felkällor för ändringar genuttryck bestäms med denna in vivo imaging metod innehåller några kvardröjande effekter från kranial kirurgi eller anestesi som kan störa beteende prestanda eller induktion av Arc-GFP. Det är viktigt att kontrollera den totala omfattningen av Arc-GFP aktivering som svar på specifika erfarenheter i fasta hjärnan sektioner först, och jämföra detta i den utsträckning som observerats av upprepad avbildning med in vivo två-foton mikroskopi. Den postoperativa återhämtningsperioden och de upprepade intervall imaging kan sedan justeras för att minimera de potentiella biverkningar av kirurgi och anestesi om Arc-GFP aktivering.
_content "> Den avbildande metod som beskrivs här är sannolikt tillämplig för transgena möss som bär fluorescerande reportrar för andra erfarenheter reglerade gener 4. Dessutom kan det kombineras med fluorescerande markörer som belyser morfologi märkt neuroner 8,9, eller indikatorer som återspeglar neurofysiologiska verksamheten i dessa nervceller 19, 20. Dessa ytterligare applikationer kan ge en mer heltäckande bild av erfarenhet beroende molekylära förändringar i enskilda nervceller, och relatera dessa molekylära förändringar av de strukturella och funktionella förändringar som äger rum i nervceller under normal eller patologiska upplevelser.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka L. Belluscio för kirurgi filma utrustning, D. Kwon för att filma hjälp K. Liu för videoredigering hjälp och K. MacLeod för all bakgrundsmusik. KW erkänner generöst stöd från NIMH Avdelningen för Intramural forskningsprogram och generna, kognition och psykoser Program. Detta arbete stöddes av NIMH Intramural Research Program (VC, YY, SMKW) och NIAAA Avdelningen för Interna klinisk och biologisk forskning Program (VC, RMC, DML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
| Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
| Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
| 20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
| Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
| Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |
References
- Leslie, J. H., Nedivi, E. Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity. Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).
- Flavell, S. W., Greenberg, M. E. Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system. Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).
- Guzowski, J. F., et al. Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression. Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).
- Barth, A. L. Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).
- Lyford, G. L., et al. a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites. Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).
- Link, W., et al. Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).
- Shepherd, J. D., Bear, M. F. New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity. Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Wang, K. H., et al. In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex. Cell. 126 (2), 389-402 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake. Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Eichhoff, G. In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).
- Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology. neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).
- Chen, L. M., et al. A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey. Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).
- Kleinfeld, D., et al. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Barretto, R. P., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
- Stosiek, C., et al. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
