Summary
न्यूरॉन्स में अनुभव पर निर्भर आणविक परिवर्तन है मस्तिष्क व्यवहार चुनौतियों का सामना करने के लिए जवाब में अनुकूल करने की क्षमता के लिए आवश्यक हैं. एक
Protocol
नीचे वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं मानसिक स्वास्थ्य पशु की देखभाल और उपयोग समिति के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा अनुमोदित किया गया और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार में थे.
1. पूर्व ऑपरेटिव तैयारी
- सड़न रोकनेवाला सर्जरी से पहले एक गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ में सभी उपकरणों को साफ, 70% इथेनॉल के साथ सर्जरी साइट को साफ करने के लिए, और नीचे स्वच्छ ड्रॉप कपड़ा डाल दिया. बाँझ दस्ताने पहनें. हौसले से तैयार 1.2% Avertin समाधान, 0.02 मिलीग्राम / छ intraperitonially, पर दिया साथ पशु anesthetize. वैकल्पिक रूप से, एक नाक शंकु, शामिल करने के लिए 5%, एक निष्क्रिय मेहतर सर्किट के साथ रखरखाव के लिए 1.5%, के माध्यम से isoflurane गैस के साथ anesthetize. संज्ञाहरण पूंछ या पैर की अंगुली pinches का उपयोग करने के लिए पूर्ण बेहोश करने की क्रिया को सुनिश्चित करने के स्तर की जाँच करें.
- बाँझ नेत्र मरहम साथ जानवर की आंखों को कवर करने के लिए, और हौसले से तैयार dexamethasone इंजेक्षन (0.2 मिलीग्राम / किग्रा) और (5 मिलीग्राम / किग्रा) carprofen subcutaneouslमस्तिष्क सूजन और सूजन 11 को रोकने के वाई. कान के बीच खोपड़ी पर बाल दाढ़ी, और Betadine साफ़ और 70% इथेनॉल के तीन बारी swabs के साथ त्वचा बाँझ बनाना.
- Earbars साथ एक stereotaxic सर्जरी चरण में पशु माउंट, 37 पशु सेट नीचे एक पानी परिसंचरण हीटिंग पैड के साथ डिग्री सेल्सियस नियमित रूप से पशु संज्ञाहरण के स्तर की जांच के लिए, और मूल चतनाशून्य करनेवाली औषधि खुराक के पूरक के रूप में की जरूरत है.
- सिर की त्वचा के तहत 0.5% Marcaine की 200 μl सुई क्षेत्र सुन्न. त्वचा को काटकर अलग कर देना और खोपड़ी पर त्वचा प्रालंब निकाल. Periosteum निकालें और स्वच्छ कपास swabs के साथ क्षेत्र सूखे.
2. जीर्ण कपाल विंडो सर्जरी
- एक 0.5 मिमी गड़गड़ाहट के साथ एक उच्च गति दंत ड्रिल का प्रयोग धीरे ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र पर एक 3-5 मिमी व्यास चक्र रूपरेखा. समय - समय पर बाँझ 0.9% खारा और दूर स्पष्ट स्वच्छ कपास swabs के साथ हड्डी और धूल के साथ ड्रिलिंग साइट गीला. यदि हड्डी bleeds, जी का उपयोग करेंबाँझ खारा के साथ elfoam presoaked खून बहाना दाग और इसे रोकने के लिए के लिए प्रतीक्षा करने के लिए.
- जब पिछली हड्डी परत तक पहुँच जाता है उठा, और ठीक इत्तला दे दी संदंश के साथ हड्डी द्वीप हटा दें. हड्डी के नीचे शेल्फ Dura संलग्नक अगर खिड़की एक हड्डी सीवन पार से सामना हो सकता है. ये धीरे हड्डी प्रालंब के रूप में उठाया है हटाया जाना चाहिए.
- जेल फोम रोल धीरे उजागर ड्यूरा पर इसकी सतह को साफ करने के लिए और किसी भी dural को रोकने के रक्तस्राव के लिए प्रतीक्षा सिक्त महत्वपूर्ण कदम: आगे न बढ़ें जब तक सभी dural खून बह रहा बंद कर दिया है. रक्त कि कपाल खिड़की के अंदर फंस जाता है आमतौर पर एक अपारदर्शी खिड़की के लिए होता है.
- अगर ब्याज की क्षेत्र में एक स्थान के तहत है, जहां ड्यूरा विशेष रूप से मोटी है, यह ऊपर ड्यूरा को हटाने के लिए आवश्यक हो सकता है. यदि यह मामला है, धीरे पिया से बहुत ठीक संदंश के साथ ड्यूरा नीचे अलग, ठीक संदंश की एक और जोड़ी के साथ उठाया ड्यूरा में एक छोटा सा चीरा बनाने, फिर काट किनारों और धीरे समझड्यूरा विभाजित. ड्यूरा पतली लेकिन मजबूत है, इसलिए सावधान रहना ड्यूरा की अक्षुण्ण किनारों के साथ मस्तिष्क टुकड़ा नहीं है.
- बाँझ ACSF या बाँझ खारा के साथ क्षेत्र कुल्ला.
- ड्यूरा या पिया पर एक बाँझ कांच (3-5 मिमी) coverslip निर्धारित करना महत्वपूर्ण कदम: यदि काफी आसपास खोपड़ी घटता, Kwiksil 12 चिपकने वाला का उपयोग करने के लिए रिक्त स्थान है जहां ड्यूरा या पिया क्षेत्रों में coverslip के साथ निकट संपर्क नहीं करना होगा में भरने कि imaged नहीं किया जाएगा.
- Cyanoacrylate जेल का प्रयोग elastomer चिपकने वाला और कांच coverslip के किनारों को कवर किया है. कवर की अनुमति के किसी भी cyanoacrylate जेल मस्तिष्क की सतह को छूने के लिए नहीं cyanoacrylate जेल, या एक krazyglue और दंत सीमेंट मिश्रण के साथ पूरे उजागर खोपड़ी महत्वपूर्ण कदम.
- एक कस्टम निर्मित खोपड़ी के विपरीत छोर पर धातु सिर निर्धारण बार एम्बेड करें.
- एक गर्म वसूली चैम्बर ketoprofen, 5 मिलीग्राम / किग्रा, के लिए की एक intraperitonial इंजेक्शन के बाद जानवर, लौटेंr दर्द प्रबंधन. दो और दिनों के लिए बाद operatively एनाल्जेसिक जारी.
- पोस्ट ऑपरेटिव वसूली के दो सप्ताह के बाद, isoflurane (शामिल करने के लिए 5%, रखरखाव के लिए 1.5%) के साथ पशु anesthetize, यह एक कस्टम निर्मित सिर निर्धारण के साथ एक फ्रेम खुर्दबीन मंच में माउंट, और ऑप्टिकल स्पष्टता के लिए कपाल खिड़की की जांच नीले प्रकाश के साथ रोशनी के तहत. मस्तिष्क की सतह रक्त वाहिका स्पष्टता अत्यधिक कपाल खिड़की की गुणवत्ता का संकेत है. यदि रक्त वाहिका किनारे तेजी से परिभाषित कर रहे हैं, खिड़की useable होने की संभावना है. दो सप्ताह के पोस्ट ऑपरेटिव वसूली समय पशु सर्जरी से उबरने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के लिए सिफारिश की है. आम तौर पर कपाल खिड़कियों को साफ करने और इस समय के दौरान, सुधार और अतिरिक्त सप्ताह के लिए ऑप्टिकली पारदर्शी महीने जब तक या ड्यूरा की खोपड़ी और अधिक मोटा होना के regrowth विंडो गुणवत्ता degrades रहना.
3. व्यवहार प्रोटोकॉल और लेजर दो photon माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग
- स्पष्ट ग के साथ पशुranial खिड़कियां एक पर्यावरण उत्तेजना को उजागर किया जाएगा या एक व्यवहार प्रशिक्षण सत्र के अधीन है, और फिर बाद में अधिकतम Arc-GFP अभिव्यक्ति के समय में imaged. एक व्यवहार प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, पशु एक लगातार घर पिंजरे आधारभूत आर्क GFP अभिव्यक्ति के स्तर में एक दिन का भिन्नता को कम करने के वातावरण में रखा जाना चाहिए.
- व्यवहार प्रशिक्षण या पर्यावरण उत्तेजना मानदंड शुरू, ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, पशुओं के लिए लगातार दिन पर अलग दृश्य वातावरण को उजागर किया जा सकता है, और दृश्य उत्तेजना में दृश्य प्रांतस्था 10 उत्तेजना विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की पहचान के बाद प्रत्येक दिन imaged.
- Arc-GFP प्रतिदीप्ति न्यूरॉन्स में आम तौर पर उत्तेजना के बाद दो घंटे के अपने चरम स्तर तक पहुँचता है. प्रयोगात्मक समय के लिए अपने चरम प्रतिदीप्ति स्तर पर न्यूरॉन्स में आर्क GFP अभिव्यक्ति का पता लगाने की सुविधा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
- एक व्यवहार प्रशिक्षण सत्र या environmenta के बादएल उत्तेजना पूरा हो गया है, isoflurane (शामिल करने के लिए 5%, रखरखाव के लिए 1.5%) के साथ पशु anesthetize और माइक्रोस्कोप के तहत दो photon सिर निर्धारण फ्रेम के साथ कस्टम निर्मित खुर्दबीन चरण में पशु माउंट.
- पशु के सिर की स्थिति सिर निर्धारण फ्रेम कि मंच से सीधे जोड़ता है, खोपड़ी पर प्रत्यारोपित धातु पट्टी का उपयोग करने के लिए तय है. Isoflurane और ऑक्सीजन लगातार एक नाक शंकु के माध्यम से माउस को आपूर्ति कर रहे हैं. शरीर का तापमान एक हीटिंग पैड का उपयोग कर बनाए रखा है.
- सुनिश्चित करें कि खुर्दबीन डिटेक्टरों परिवेश प्रकाश से एक अंधेरे कमरे में दो photon लेजर स्कैनिंग द्वारा आयोजित की रक्षा कर रहे हैं. इमेजिंग के लिए एक 20x या 25x (1.05 संख्यात्मक एपर्चर) पानी विसर्जन लेंस का प्रयोग करें. पहले, महामारी प्रतिदीप्ति रोशनी के तहत, भविष्य छवि संरेखण के लिए एक सीसीडी कैमरा के साथ ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र पर सतह रक्त वाहिका पैटर्न की एक छवि हासिल है.
- दो photon लेजर प्रारंभ एक 3-D छवि ढेर प्राप्त स्कैनिंग. एक ओलिंप FV1000MPE बहु - फोटोन खुर्दबीन हमारे सेटअप में प्रयोग किया जाता है. दो photon लेजर की उत्तेजना की लहर लंबाई 920 एनएम पर सेट कर दिया जाता है, और उद्देश्य से उत्सर्जित लेजर की शक्ति लगभग 50 मेगावाट पर सेट कर दिया जाता है. उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के साथ हरे और लाल (570 एनएम पर dichroic दर्पण, 495-540 एनएम और 570-625 एनएम में बाधा फिल्टर) चैनल, एक बाहरी photomutiplier दो चैनल का पता लगाने के लिए नमूना बंद रखा प्रणाली का उपयोग करने में पता चला है. आर्क GFP प्रतिदीप्ति केवल हरे चैनल में दिखाई देता है, जबकि ऑटो प्रतिदीप्ति ऊतक दोनों चैनलों 13, 14 में प्रकट होता है.
- विशिष्ट छवि के ढेर लगभग 320x320x100 सुक्ष्ममापी के आयाम (चौड़ाई x लंबाई x गहराई), 0.5 सुक्ष्ममापी / पिक्सेल के एक क्षैतिज संकल्प, और 3 सुक्ष्ममापी / पिक्सेल का एक ऊर्ध्वाधर संकल्प है.
- छवि ढेर प्राप्त करने के बाद, अपने घर पिंजरे पशु वापस. अगले व्यवहार और इमेजिंग सत्र तक परेशान मत पशु. व्यवहार और desir रूप में दिन भर इमेजिंग प्रक्रिया दोहराएँएड. उन्मुख करने के लिए पहले से हासिल मस्तिष्क की सतह रक्त वाहिका छवि ही इमेजिंग स्थान के लिए वापस प्रयोग करें.
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल में एक जीवित पशुओं में व्यक्तिगत cortical न्यूरॉन्स में अनुभव पर निर्भर आणविक परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए एक विधि का वर्णन है. एक पुरानी कपाल खिड़की 1 एक जीन अभिव्यक्ति का एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ले माउस में ब्याज की एक cortical क्षेत्र पर बनाया जाता है. दो photon माइक्रोस्कोपी तो विभिन्न व्यवहार मानदंड के साथ मिलकर किया जा सकता है व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में behaviorally प्रेरित आणविक परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए और कई दिनों से अधिक न्यूरॉन्स की एक ही सेट में इस तरह के बदलाव (1 चित्रा) ट्रैक.
आर्क GFP चूहों में, आर्क जीन की अभिव्यक्ति में अनुभव पर निर्भर परिवर्तन मज़बूती से इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर कई दिनों के लिए अलग - अलग cortical न्यूरॉन्स में imaged किया जा सकता है. माउस ट्रांसजेनिक आर्क GFP में दस्तक तत्काल जल्दी जीन आर्क की अंतर्जात प्रवर्तक (2 चित्रा) के नियंत्रण के तहत एक अस्थिर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (d2EGFP, प्रोटीन आधा जीवन लगभग दो घंटे) को व्यक्त करता है.
ontent "> विगत पुरानी कपाल खिड़कियों का वर्णन प्रोटोकॉल सफल कपाल खिड़की सर्जरी 11 के संचालन में महत्वपूर्ण कदम रेखांकित किया है इस प्रोटोकॉल ड्यूरा अगर जरूरत को हटाने में अतिरिक्त मार्गदर्शन प्रदान करता है, जो स्पष्ट ऑप्टिकल खिड़कियां प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है जब इस तरह के खिड़कियों खोपड़ी sutures पर स्थित हैं. (2.4 चरण देखें).कपाल खिड़की सर्जरी से वसूली के बाद पशुओं के लिए एक कस्टम बनाया फ्रेम सिर निर्धारण और चरण में बढ़ रहे हैं चित्रा 3 और सिर निर्धारण headbar दो photon इमेजिंग के दौरान इस्तेमाल किया फ्रेम को दर्शाया गया है. एक सुसंगत खुर्दबीन दो photon इमेजिंग चरण स्थिति और सेटअप बनाए रखने एकदिवसीय छवियों के पुनर्निर्माण की सुविधा जब एक पहले imaged मस्तिष्क क्षेत्र लौट जाएगा, और प्रायोगिक दक्षता वृद्धि हुई है जब कई जानवरों के एक ही दिन (4 चित्रा) पर imaged.
व्यवहार प्रशिक्षण या पर्यावरण उत्तेजना के दौरान, यह सलाह दी जाती हैघर पशुओं के लिए अकेले और एक पर्यावरण के लगातार घर पिंजरे स्थान में, आर्क GFP पृष्ठभूमि सक्रियण के स्तर में एक दिन का उतार चढ़ाव (1 चित्रा) को कम करने के लिए.
एक स्थिर, स्पष्ट कपाल खिड़की का एक महत्वपूर्ण संकेत महामारी फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत रक्त वाहिकाओं के कुरकुरा पैटर्न है. यह रक्त वाहिका पैटर्न काफी इमेजिंग के कई दिनों (5 चित्रा) भर में नहीं बदलना चाहिए.
चित्रा 6 एक आधारभूत घर पिंजरे हालत (A) के तहत और एक नई मोटर व्यवहार (बी) के प्रदर्शन के बाद ललाट cortical न्यूरॉन्स में आर्क GFP की अभिव्यक्ति पैटर्न को दिखाता है. परत वही जानवर में एक ही मस्तिष्क क्षेत्र में द्वितीय / तृतीय cortical न्यूरॉन्स मज़बूती से हो सकता है, imaged कर सकते हैं और एक ही न्यूरॉन्स इमेजिंग के कई दिनों पर पहचान करने में सक्षम होना चाहिए. यह ठेठ है न्यूरॉन्स के सैकड़ों नमूना एक 3-D छवि ढेर इकट्ठा. न्यूरॉन किनारों तेज और स्पष्ट छवि है भर में होना चाहिएहमले. लाल चैनल में ऊतक ऑटो प्रतिदीप्ति भी खिड़की स्पष्टता के एक सूचकांक प्रदान करता है. यदि imaged क्षेत्र में काफी दिनों से अधिक murkier हो जाता है, कपाल खिड़की गुणवत्ता की संभावना खराब है. एक ठेठ कपाल खिड़की ऑप्टिकली स्पष्ट होता है कम से कम एक सप्ताह के लिए रहेगा. महीने के लिए कई हफ्तों के बाद, कपाल और ड्यूरा की खिड़की और अधिक मोटा होना के किनारों से खोपड़ी की regrowth अंततः आगे इमेजिंग प्रयोगों को रोकने जाएगा.
चित्रा 1 एक स्कीमा प्रयोगात्मक चरणों का रूपरेखा. पशु तैयारी के चरण के दौरान, कपाल खिड़की सर्जरी Arc-GFP चूहों पर प्रदर्शन कर रहे हैं. पशुओं के लिए उनके घर पिंजरे में सर्जरी से उबरने के लिए दो सप्ताह के बारे में दिया जाता है. कपाल खिड़कियों की स्पष्टता तो महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर जाँच की है. यदि Windows इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं, जानवरों को अकेले एक शांत, पर्यावरण की दृष्टि से संगत में रखे जाते हैंघर पिंजरे वातावरण, जहां प्रायोगिक समयरेखा चरण शुरू कर सकते हैं. व्यवहार उत्तेजना प्रोटोकॉल और इमेजिंग अंतराल अपने चरम प्रतिदीप्ति है, जो आम तौर पर सक्रियण दो घंटे के बाद होता है Arc-GFP का पता लगाने के आधार पर किया जा सकता है. व्यवहार उत्तेजना के बाद पूरा हो गया है, पशु anesthetized है और ब्याज की cortical क्षेत्र कपाल दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर खिड़की के माध्यम से imaged है. जानवर तो घर पिंजरे में लौट रहा है. व्यवहार और इमेजिंग सत्र के दिन के रूप में वांछित भर में दोहराया जा सकता है.
चित्रा 2 Arc-GFP के निर्माण illustrating आरेख दस्तक माउस लाइन में है, जो एक जीन एन्कोडिंग अस्थिर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन तत्काल जल्दी जीन आर्क की कोडिंग हिस्सा की जगह. माउस के इस तनाव में, GFP अभिव्यक्ति अंतर्जात आर्क प्रमोटर के नियंत्रण के तहत है. इस चित्र के आधार पर दोबारा बनाई है10 संदर्भ में विवरण.
चित्रा 3 योजनाबद्ध और सिर निर्धारण दो photon इमेजिंग के लिए इस्तेमाल सेटअप के आयाम. headbar की ठोस छमाही खोपड़ी के पीछे (2.8 धारा) सरेस से जोड़ा हुआ है, और पेंच छेद के साथ अंत करने के लिए फ्रेम करने के लिए anesthetized पशु सिर संलग्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. फ्रेम सिर निर्धारण शिकंजा के साथ दो खंभे के ऊपर घुड़सवार एक पतली धातु की थाली के होते हैं.
चित्रा 4 एक आर्क GFP चूहों इमेजिंग के लिए दो photon माइक्रोस्कोप सेटअप स्कैनिंग लेजर का उदाहरण. 25x पानी विसर्जन लेंस, हीटिंग पैड और सिर निर्धारण फ्रेम के साथ कस्टम खुर्दबीन मंच नोट. anesthetized Arc-GFP यहाँ दिखाया माउस vivo इमेजिंग में के लिए तैयार है.
चित्रा 5 कई दिनों से मस्तिष्क की सतह एक पुरानी कपाल खिड़की में रक्त वाहिकाओं, स्पष्टता और स्थिरता के लिए समय पर रक्त वाहिका पैटर्न दिखा की छवियाँ. मस्तिष्क की सतह नीले प्रकाश के साथ प्रकाशित किया गया था, और छवियों को एक 25x पानी विसर्जन लेंस के माध्यम से एक सीसीडी कैमरा खुर्दबीन पर घुड़सवार द्वारा उठाए गए थे.
6 vivo में यह आंकड़ा दो अलग अलग व्यवहार अनुभवों के बाद एक माउस के ललाट cortical न्यूरॉन्स में दो photon आर्क GFP अभिव्यक्ति पैटर्न के चित्र. (ए) माउस इमेजिंग से पहले अपने घर पिंजरे में पहले दिन पर रुके थे. (बी) माउस 2 दिन पर इमेजिंग से पहले एक नई मोटर व्यवहार का प्रदर्शन किया. हरे और लाल चैनलों में ही cortical क्षेत्र के फ्लोरोसेंट छवियों को एक साथ हासिल किया गया. GFP प्रतिदीप्ति केवल हरे चैनल में दिखाई दिया, जबकि ऊतक autofluorescence दोनों चैनलों में दिखाई दिया. Detection पैरामीटर इतना है कि दोनों लाल और हरे रंग चैनलों में ऊतक ऑटो प्रतिदीप्ति स्तर बराबर रीडिंग था, और इन मापदंडों प्रयोगों भर में बनाए रखा गया है निर्धारित किया गया. लाल चैनल संकेत तो ग्रीन चैनल के लिए बंद लाइन के विश्लेषण के दौरान व्यापक बैंड ऊतक autofluorescence को दूर करने के लिए संकेत से घटाया गया था. परिणामस्वरूप एक 18 3 डी छवि ढेर मोटी सुक्ष्ममापी से हरी फ्लोरोसेंट संकेतों अधिकतम तीव्रता से क्षैतिज प्लेन में पेश किया गया, आर्क GFP अभिव्यक्ति के सेलुलर पैटर्न के एक दृश्य के ऊपर से नीचे प्रदान. स्केल बार, 30 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
vivo इमेजिंग विधि में यहाँ वर्णित जीवित पशुओं में कई दिनों से अधिक न्यूरॉन्स की एक ही सेट में आर्क जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन की बार - बार की परीक्षा में सक्षम बनाता है. यह एक कुशल और बहुमुखी विभिन्न व्यवहार अनुभवों के जवाब में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में तंत्रिका plasticity संबंधित आणविक गतिशीलता के बारे में जानकारी प्राप्त करने की विधि है. स्वस्थानी संकरण और immunostaining के रूप में इस तरह के मानक Histochemical तरीकों 3 संकल्प एकल कोशिका को प्राप्त कर सकते हैं, लेकिन कई दिनों से अधिक ही न्यूरॉन्स में जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों को ट्रैक करने की क्षमता की कमी है. उपयुक्त 15 संवाददाताओं से के माध्यम से एक ही जानवर में Bioluminescence, चुंबकीय अनुनाद, या परमाणु इमेजिंग तरीकों जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों को ट्रैक कर सकते हैं, लेकिन स्थानिक संकल्प की कमी के लिए व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में अभिव्यक्ति के स्तर भेद. जैसे, कोई अन्य मौजूदा जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों को मापने के तरीकों दोनों स्थानिक संकल्प और अस्थायी cov मेल कर सकते हैंइमेजिंग विधि के erage यहाँ वर्णित.
इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम कपाल खिड़की सर्जरी है. यह अतिरिक्त देखभाल के साथ किया जाना चाहिए या कांच coverslip, जो सूजन पैदा और कपाल खिड़कियों की स्पष्टता कम हो जाएगा नीचे जा खून मस्तिष्क आघात से बचने के. सद्व्यवहारी कपाल सर्जरी के लिए, खिड़की के कई हफ्तों के लिए स्पष्ट तब तक बना रहेगा जब तक ड्यूरा या खोपड़ी के regrowth की खिड़की के किनारों से और अधिक मोटा होना आगे इमेजिंग को रोकने जाएगा. ड्यूरा यदि आवश्यक हो तो हटाया जा सकता है, चूहों और बंदरों 16,17 में किया गया है पुरानी ऑप्टिकल इमेजिंग प्रयोगों के लिए किया है, कपाल खिड़कियों के ऑप्टिकल स्पष्टता बढ़ाने.
माइक्रोस्कोपी दो photon इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल तकनीक के लिए एक सीमा इमेजिंग गहराई है. अधिकतम इमेजिंग गहराई जिस पर उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त किया जा सकता है कपाल खिड़की स्पष्टता, माइक्रोस्कोप सेटअप, और fluoresc की चमक पर निर्भर करेगा ent संवाददाताओं से. आर्क GFP चूहों के लिए, हम आम तौर पर PIAL सतह के नीचे 300 मीटर करने के लिए छवि. गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की जांच, प्रतिदीप्ति microendoscopy पारंपरिक दो photon माइक्रोस्कोपी 18 में गहराई सीमा पार करने के लिए लागू किया जा सकता है.
जीन अभिव्यक्ति vivo इमेजिंग विधि में इस के साथ निर्धारित परिवर्तन के लिए संभावित कारकों कपाल सर्जरी या संज्ञाहरण कि व्यवहार प्रदर्शन या आर्क GFP शामिल के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं किसी भी सुस्त प्रभाव शामिल हैं. यह निश्चित मस्तिष्क 1 वर्गों में विशिष्ट अनुभव के जवाब में आर्क - GFP सक्रियण के समग्र हद तक की जांच के लिए महत्वपूर्ण है, और दोहराया vivo में दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग द्वारा मनाया हद तक इस तुलना. पोस्ट ऑपरेटिव वसूली अवधि और दोहराया इमेजिंग अंतराल के तो सर्जरी और संज्ञाहरण के आर्क - GFP सक्रियण पर संभावित दुष्प्रभावों को कम करने के लिए समायोजित किया जा सकता है.
"_content> इमेजिंग विधि यहाँ वर्णित करने के लिए आम तौर पर ट्रांसजेनिक अन्य अनुभव विनियमित 4 जीनों के लिए फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से ले जाने के चूहों के लिए लागू होने की संभावना है. इसके अलावा, यह फ्लोरोसेंट मार्करों है कि लेबल 8,9 न्यूरॉन्स की आकारिकी को उजागर, या संकेतक के साथ जोड़ा जा सकता है है कि उन न्यूरॉन्स 19, 20 में neurophysiological गतिविधियों प्रतिबिंबित इन आगे अनुप्रयोगों व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में अनुभव पर निर्भर आणविक परिवर्तन के एक अधिक व्यापक दृश्य प्रदान कर सकते हैं, और संरचनात्मक और कार्यात्मक संशोधनों है कि सामान्य के दौरान न्यूरॉन्स में जगह या इन आणविक परिवर्तन से संबंधित. रोग अनुभव.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए सर्जरी फिल्माने उपकरण, डी. Kwon के लिए सहायता को फिल्माने के लिए एल Belluscio का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, वीडियो के लिए लालकृष्ण लियू सहायता संपादन, और सभी पृष्ठभूमि संगीत के लिए लालकृष्ण MacLeod. किलोवाट NIMH डिवीजन के अंदर का अनुसंधान कार्यक्रम और जीन, अनुभूति और मनोविकृति कार्यक्रम की उदार सहायता को स्वीकार करता है. यह काम NIMH अंदर का रिसर्च प्रोग्राम (कुलपति, YY, SMKW) और अंदर का क्लीनिकल और बायोलॉजिकल रिसर्च कार्यक्रम के NIAAA प्रभाग (कुलपति, RMC, DML) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
| Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
| Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
| 20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
| Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
| Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |
References
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