A Novel Vertebral Stabilization fremgangsmåde til fremstilling Contusive Rygmarvsskader

Summary

Vertebral stabilisering er nødvendig for at minimere variabilitet og til fremstilling af konsistente eksperimentelle rygmarvsskader. Ved hjælp af en tilpasset stabiliserende apparat sammen med NYU / Mascis slaglegemet enhed, har vi vist her det rigtige udstyr og procedure til at generere reproducerbare hemi-contusive livmoderhalskræft (C5) rygmarvsskader hos voksne rotter.

Abstract

Klinisk relevant dyr cervikal rygmarvsskade (SCI) modeller er afgørende for udvikling og afprøvning af potentielle behandlinger; Men der producerer pålidelig cervikal SCI er vanskelig på grund af manglende tilfredsstillende metoder for vertebrale stabilisering. Den konventionelle metode til at stabilisere rygsøjlen er at suspendere rostral og caudale halshvirvelsøjlen via klemmer knyttet til livmoderhalskræft torntappe. Denne form for stabilisering kan imidlertid ikke forhindre væv gav under kontusion som cervikale spinal processer er for korte effektivt sikres ved klemmerne (Figur 1). Her indfører vi en ny metode til helt stabilisere halshvirvel på samme niveau af skaden virkning. Denne metode effektivt minimerer bevægelse af rygsøjlen på det sted, virkning, hvilket i høj grad forbedrer produktionen af ​​sammenhængende lokaliteter af fællesskabsbetydning. Vi leverer visuel beskrivelse af det udstyr (Figur 2-4), metodes, og en trin-for-trin-protokol til stabilisering af den cervikale 5 ryghvirvel (C5) i voksne rotter, for at udføre laminektomi (figur 5) og producere en contusive SCI derefter. Selvom vi kun demonstrere en cervikal hemi-kontusion ved hjælp af NYU / Mascis slaglegemet enhed, kan denne vertebral stabilisering teknik anvendes på andre områder af rygmarven, eller tilpasses til andre SCI-enheder. Forbedring rygmarv eksponering og fiksering gennem vertebral stabilisering kan være værdifulde for at producere sammenhængende og pålidelige skader på rygmarven. Denne vertebral stabilisering metode kan også anvendes til stereotaktiske injektioner af celler og sporstoffer og til billeddannelse ved hjælp af to-foton mikroskopi i forskellige neurobiologiske undersøgelser.

Introduction

Konsekvent og replicerbar mekanisk kraft mål spinal væv er kritisk for at minimere funktionelle og histologisk variabilitet og for at etablere succesfulde contusive rygmarvsskade (SCI) modeller ^1-7. Mængden af ​​kraft, der påføres en målregion af rygmarven afhænger de anvendte for rygsøjlen stabilisering metoder. Positionelle forskydning af target rygsøjlen ved kontakt mellem virkningen stemplet og rygmarv ændrer den resulterende skade kraft. Den cervikale contusive SCI model er en mere klinisk relevant model end andre former for SCI, da ca. 50% af humane SCI tilfælde opstår på dette niveau ^8, og flere SCI undersøgelser er blevet udført under anvendelse af dyr livmoderhalskræft skade modeller ^9-14. Selvom Contusive SCI modeller ofte udnytter en form for stabilisering ved at klemme den spinal processer forreste og bageste til skaden site, er svært for at producere livmoderhalskræft SCI dette præparat. &# 160; Som vist i denne demonstration, stabilisering metode udviklede vi er fordelagtigt i dens evne til at øge både kvaliteten og reproducerbarheden af ​​kontusion skade. Især blev denne metode til vertebral stabilisering etableret i et forsøg på at ændre de mangler og udfordringer i andre modeller: 1) variation i vertebrale gav under slagkraften kan forekomme ved at klemme tilstødende dorsale torntappe rostral og caudale til laminektomi. Graden af vertebral forskydning er afhængig af antallet af vertebrale samlinger mellem virkningen og hvirvlerne stabiliseres (figur 1). Derfor omfattede mindre stabil flere led i rygsøjlen bliver; 2) den dorsale torntappe er skrøbelige og årsag klemme svigt som følge af torntappen brud eller klemmen glider af processen; og 3) torntappene på disse hvirvler er ekstremt korte mellem C3 til T1 ryghvirvler i forhold til dem af den thorakale verteBrae, hvilket gør det vanskeligt ved hjælp af traditionelle klemmer at forstå torntappene til stabilisering af halshvirvelsøjlen.

Her beskriver vi en hidtil ukendt fremgangsmåde til stabilisering af rygsøjlen til fremstilling af C5 contusive SCI i voksne Sprague-Dawley rotter. Denne metode kan anvendes til stabilisering af andre niveauer af rygsøjlen og rygmarven, og konjugater godt med andre Contusive SCI-enheder, herunder New York University / Multicenter Animal Rygmarvsskader Study (NYU / Mascis) attrappen ¹⁵ (figur 2) , Precision Systems og instrumentering, LLC Infinite Horizon (IH) anordning ^16, Ohio State University / Elektromagnetisk Rygmarvsskader enhed ¹ og Louisville Injury System Apparat (LISA) ^17, der giver mulighed for udbredt brug i SCI forskning.

Protocol

1. Eksponering af cervikal Spinal laminae

1. Rengør kirurgiske overflade med 70% ethanol, forvarmet med en varmepude. Dæk overfladen med en steril kirurgisk afdækningsstykke før placere steril gaze, vatpinde, og autoklaveres kirurgiske redskaber i kirurgi området. Brug en mikroperle sterilisator for inter-kirurgi sterilisering af kirurgiske instrumenter.
2. Bedøver rotte med ketamin (87,7 mg / kg) / xylazin (12,3 mg / kg) intraperitonealt (IP). Den korrekte plan af anæstesi er nået, når dyret ophører med at reagere på en tå knivspids stimulus. Subkutant injicere 0,01-0,05 mg / kg buprenorphin og 5 mg / kg Carprofen inden kirurgisk procedure. Buprenorphin bør derefter administreres hver 8-12 timer og Carprofen gang dagligt i de første 4-7 dage efter operationen.
3. Anvend beskyttende salve til øjnene på dyret for at forhindre udtørring af hornhinden under operationen.
4. Barber det kirurgiske område på den dorsaleoverflade af rotte fra midten af ​​thorax region til bagsiden af ​​hovedet med trimming. Fjern barberet pels ved hjælp af en vakuum udstyret med et HEPA-filter.
5. Påfør betadinopløsning til det barberede område som en kirurgisk krat rense derefter med 70% isopropylalkohol klude.
6. Brug en skalpel til at udføre en 3-4 cm midtlinie incision i huden fra bunden af ​​hovedet caudalt til midten brystkassen.
7. Identificer midterlinjen af ​​fascia og subkutane muskler anterior til overvintrende kirtel ved den nedre hals; skære gennem trapezius og andre muskler langs midterlinjen at reducere blødning.
8. Find midterlinjen af ​​to regioner af fedtvæv underliggende muskler; skære paraspinous muskler kaudalt strengt langs midterlinjen og separate muskellag hjælp af en lille vævssprededilatator indtil niveauet af thorax T2 torntappen er nået.
9. Identificere og skåret væk musklen tilsluttet til T2 spinosus proces at udnytte thistruktur som en anatomisk vartegn.
10. Fjern bruskagtige spidsen af ​​T2 torntappen at forbedre synligheden af ​​halshvirvlerne.
11. Adskil paraspinal muskler sideværts fra torntappene og laminae C4-T1; imidlertid skåne muskel dækker på C3 lamina at forhindre blødning.
12. Skær musklerne over lagene fra C4-T1 sideværts mod facetter på begge sider af rygsøjlen.
13. Efter spinal laminae udsættes placere dyret på sin ventral overflade i den U-formede kanal af stabilisatoren.
14. Identificer C5 ryghvirvel ved at tælle torntappene rostrally fra T2 vartegn til T1, C7, C6, og til sidst C5.

2. stabilisere ryghvirvler og Udførelse af Impact Skade

1. Placer to rustfrie arme af stabilisatoren til at suspendere dyret ved at placere de takkede kanter af armene under Lateral facetter af C5-6 ryghvirvler (figur 1C). Efter at have sikret armene med ryghvirvlerne på plads (figur 2B), juster stabiliserende apparat til at sikre rygsøjlen er niveau og centreret. Endelig låse armene ved at spænde fingerskruerne af stabilisatoren.
2. Skær ledbånd mellem spinal processer og lagene på C4-5 og C5-6 at identificere margenen på C5 lamina.
3. Ved hjælp af en mikro-rongeur, klip væk halvdelen af den tynde plade til højre på C5 som bestemt til SCI (figur 5C-E). Efter laminektomi, transportere dyret med stabilisatoren under skade enheden. Fastgør dyr sammen med stabilisator på en mount (figur 3A-C) til præcist at justere stemplet på rygmarven mål ved hjælp af en lateral mikro-manipulator (figur 3).
4. Under stor forstørrelse, find de C5 og C6 dorsale entry zoner (DREZs) på den udsatte dorsale rygmarven overflade uden durotomy. Sigt stemplet i midten af de to identificerede DREZs og halvvejs mellem midterlinjen og sidekanten af rygmarven (figur 5B).
5. Ved anvendelse af en NYU / Mascis slaglegeme enhed med en 2,5 mm diameter spids (figur 3A & B), frembringe en C5 hemi-kontusion (figur 5B & E) af en 10 g stang x 12,5 mm højde dråbe (figur 2A).
6. Kontroller skaden visuelt ved blå mærker på rygmarven (Figur. 5E, pil) og kontrollere skade parametre, som NYU softwaren ^12,17 (figur 6).
7. Sutur muskler og blødt væv med steril 4-0 Vicryl sutur, luk derefter huden indsnit med kirurgiske hæfteklammer (EZ clips).
8. Påfør antibakterielle salve til operationsstedet.
9. Injicer 5,0 ml sterilt 0,9% saltvand subkutant til dyret til hydrering.
10. Placer dyret i en varme-kontrollerede miljø (recirkulerende varmt vand padcage på en varmepude)) med fugtige fødevarer billede på strøelse (skiftes dagligt) og en vandflaske med en lang hældetud for nem adgang er placeret på gulvet i buret. Yde omsorg for at sikre tilstrækkelig bedring før han vendte tilbage dyret til hjemmet bur.
11. Da dette er en ensidig cervikal contusive skade, vil dyret sandsynligvis miste funktion af ipsilaterale forben, forbigående, som begynder at komme sig i løbet af de første par uger efter skade. Dog bør kontralateral funktion forblive intakt, således skal dyret være i stand til at spise og drikke uden værdiforringelse, og har kun mindre svækkelse i bevægelse og grooming.

Representative Results

Ved at følge denne protokol, er konsekvent og reproducerbar livmoderhalskræft hemi-contusive SCI produceret (figur 5 & 6). Anvendelsen af ​​en vertebral stabilisator til at stabilisere den laterale processer af samme ryghvirvel på niveau bestemt til SCI tillader sådanne tilfredsstillende resultater. Ved hjælp af denne metode, er ikke kun målet C5 ryghvirvel, men også tilstødende C4 og C6 rigoristisk.

Den NYU / Mascis software giver en udlæsning med en graf indstillet på en x- og y-aksen, og understøtter brugen af vores vertebral stabilisering metode og udstyr (figur 6). Denne fremgangsmåde til stabilisering reducerer skade variabilitet, som kan resultere fra den nedadgående forskydning af målvævet og rygsøjlen (figur 1). Efter skade, en klar ensidig blålig hæmatom centreret mellem C5 og C6 DREZs er synlig (figur 5E). Disse skade parametre er konsekvent fra dyr til animal ifølge udlæsningen fra NYU / Mascis software (figur 6).

Da den cervikale hemi-kontusion giver klare forben underskud, denne model er ideel til vurdering forben funktionelle evner såsom at nå, grooming ^13, og objekt manipulation ^18-19. Som bagbenenes motoriske underskud er mindre fremtrædende, Basso, Beattie og Bresnahans (BBB) ​​bevægeapparatet scoring skala ⁴ er ikke egnet til brug i denne model. Den funktionelle resultat efter skade er mest mærkbar i den ipsilaterale forepaw extensor underskud, hvor rotten udviser en "køller" knytnæve med alle cifre bøjet ^18. Alle dyr, der udsættes for den samme skade sværhedsgrad og niveau af rygmarven bør udvise tilsvarende underskud på den ipsilaterale forben illustreret i denne protokol, på korrekt skade. Dyr forkert såret kan præsentere med meget forskellig manifestation og varigheden af underskuddene ^13,18.

Histologisk denne model producerer omfattende grå og hvid substans skade på skade epicenter og rostral og caudale til skadestedet, hvilket fører til en betydelig læsion og hulrum dannelse indeholdt næsten udelukkende i den skadede side af rygmarven. En stor, primært astrocyt-baserede glial ar formularer på de læsioner grænser med massiv neuronal død ^18.

Figur 1: Illustration af rygsøjlen fleksibilitet under contusive SCI med forskellige fastspænding metoder. Figur A og B viser fleksibilitet eller "udbyttet" af rygsøjlen, når torntappe klemmes dorsalt, der giver mulighed for forkerte virkninger og inkonsistente data. Illustrationen er vist i A viser langt større fleksibilitet ved anslag (rød stiplet linieog store buede pile) i forhold til, der er vist i B (mindre buede pile), som klemmer er længere væk fra det sted, laminektomi og skade. figur C viser lateral stabilisering med vores beskrevne indretning med stabiliserende arm fastspændt under den tværgående proces ryghvirvel hvor stedet for virkningen vil blive udført. Der er ingen fleksibilitet af rygsøjlen under denne procedure, som hvirvlen af ​​interesse er helt stabiliseret.

Figur 2: NYU / Mascis attrappen og brugerdefinerede stabilisering beholder. Figur A viser de komponenter og funktioner i NYU / Mascis rygmarvsskade enhed med flere stang højdeindstillinger for personskade sværhedsgrad (indsat). Figur B og C illustrerer den U-formede beholder, der holderrotte, og de takkede stabiliserende arme, der sikkert stabilisere rygsøjlen under operationen og skade (designet og produceret af YP Zhang).

Figur 3: Tilpasset monteringssystem og lateral microadjuster på NYU / Mascis attrappen Figur A beskriver de forskellige elementer i den brugerdefinerede monteringssystem til den U-formede rotte stabilisator for rygmarvsskader.. Bemærk den laterale microadjuster i figur A, afgørende for præcis justering af rotte rygmarv til skade. Figur B og C give yderligere skildring af stabilisatoren uden (B) og med U-formede rotte beholder (C) i forhold til andre vigtige komponenter af den skade enhed (mounting system designet og produceret af YP Zhænger).

Figur 4:. Målinger af de individuelle komponenter af den kirurgiske stabilisering enheden og vedhæftede Hver komponent i den brugerdefinerede stabiliseringssystem er fremhævet for at vise dimensioner og skala (A, C og D). Thorax stabilisering arme (B) er vist for at vise den mulige anvendelse af denne enhed til brug i forskellige spinal kirurgiske modeller.

Figur 5: Kirurgiske vartegn og forberedelse til livmoderhalskræft hemi-kontusion rygmarvsskade. Figur A og B skildre de korrekte vartegn for korrekt IMPAct tilpasning til den udsatte rotter rygmarven. Den passende anslagspunkt direkte mellem C5 og C6 dorsale nerverødder (rostral-caudal) og midterlinjen og sidekanter rygmarven (B). Tal CE viser i større forstørrelse, processen med at udsætte den ønskede halvdel af cervikal rygmarv til skade, ved omhyggelig ensidig laminectomy. Også figur D og E demonstrere ledningen umiddelbart før og efter rygmarven kontusion skade. Bemærk den synlige blødning (E) forårsaget af virkningen (sort pil).

Figur 6 :. Eksempler på acceptabel versus uacceptable data udlæsninger efter påvirkning med NYU / Mascis attrappen. Den øverste graf (A) og top datasæt (C) (B) og fejl under "nulstilling" af slaglegemet stang og tip på rygmarven overflade, før indstilling af højden af slaglegemet stang (C). Bemærk den betydelige fejl indiceret til initial højde og starttidspunkt af slaglegemet drop, som angivet ved den røde pil og understrege. Softwaren indeholder også en advarsel er blevet opdaget fejlen for disse parametre (nederst i panelet C).

Discussion

Her har vi vist et halshvirvelsøjlen stabilisering fremgangsmåde til fremstilling af ensidig contusive SCI ved C5. Denne stabilisering metode øger præcisionen af traumet anatomisk og producerer konsekvent funktionelle mangler ^13,18. I andre modeller, der er afhængige af dorsal fastspænding af torntappene, er risikoen for skader spinosus proces eller løsrivelse af klemmerne fra hvirvlen er ganske høj. Disse modeller kan også tillade betydelig rygsøjlen skiftende og gav fra kontusion kraft, og den fleksible karakter af rygsøjlen og rygsøjlen (figur 1A og B). Vævet gav ændrer stemplet væv kontakttid og resulterer i uforudsigelige skade kraft (figur 1A-B & 6b). Vores beskrevet vertebral stabilisering giver også andre fordele for den kirurgiske forberedelse: 1) denne metode fuldt stabiliserer ryghvirvler centreret ved C5 underkirurgisk mikroskop hvilket øger nøjagtigheden af laminectomies (figur 1c); 2) dyret monteret inden i U-formede stabilisator kan tages direkte fra det kirurgiske sted til den tilpassede montering fastgørelse, som undgår procedure for at genmontere dyret på SCI enheder og sparer tid; og 3) stabilisering af ryghvirvler på skaden niveau og direkte dorsale og caudale til det tilsigtede skadestedet kan i høj grad mindske kroppens bevægelser forårsaget af åndedræt, en anden foranstaltning for at reducere variation.

Den primære fordel ved at udnytte denne stabilisering metode er den reducerede mængde gav eller ventrale bevægelse af rygmarven og kolonne ved anslaget. Baseret på simple fysik af en kontusion skade, vil den kraft og energi af virkningerne overføres fra stangen til rygmarven, ideelt med ledningen absorbere denne energi på det sted, virkning. Men hvis rygsøjlen udbytter beneath ledningen, som det er muligti den dorsale spinosus fastspænding metode (figur 1A & B), den faktiske kraft, der påføres ledningen er faldet og variabel, afhængigt af graden af udbytte.

Selvom denne video viser hele proceduren af ​​en cervikal contusive SCI model, essensen af ​​denne artikel er indførelsen af ​​spinal stabilisering metode, vi bruger i forskellige applikationer i vores laboratorium, specielt til SCI studier. En modificeret version af denne stabilisering anordning og fremgangsmåde er blevet anvendt på mus SCI ^23. Denne simple metode til rygsøjlen stabilisering er meget nyttigt for SCI forskning, og vi har tidligere brugt denne metode og udstyr til at udføre thorax kontusion samt flænger SCI-modeller. En anden lab har for nylig beskrevet en variation af denne form for stabilisering for livmoderhalskræft skade i dette tidsskrift ^22. Sammenfattende introducerer vi denne roman vertebral stabilisering metode til flere havnen kirurgiAL procedurer til generering reproducerbar eksperimentel SCI spænder fra laminektomi produktion skade. Fordelene ved denne stabilisering enhed er ikke begrænset til cervikal rygmarv kontusion, som denne stabilisering metode er blevet tilpasset til en bred vifte af eksperimenter, såsom intra-spinal injektioner, cellulær transplantation, CSF samling fra Cisterna Magna, hemisektion og transektion skader, thorax kontusion skader, in vivo imaging beskæftiger to-foton mikroskopi, og spinal elektrofysiologiske optagelse. Øge kvaliteten af ​​de spinal kirurgiske og skade procedurer og reducere den eksperimentelle variation vil bidrage til at give indsigt i ægte mekanismer skade og genvinding, og screene virkningerne af forskellige behandlinger på den ødelæggende sygdom i SCI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purdue Products Betadine Surgical Scrub	Fisher Scientific	19-027132
Dukal Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-490
Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg)	Webster Veterinary	07-881-9413, 07-890-5745
Decon Ethanol 200 Proof	Fisher Scientific	04-355-450
Artificial Tears Eye Ointment	Webster Veterinary	07-870-5261
Antiobiotic Ointment	Webster Veterinary	07-877-0876
Cotton Tipped Applicators	Fisher Scientific	1006015
Rongeur	Fine Science Tools	16000-14
Surigical Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Scissors (blunt dissection)	Fine Science Tools	14040-10
Surgical Retractor	Fine Science Tools	17005-04
Large Forceps	Fine Science Tools	11024-18
Fine Forceps	Fine Science Tools	11223-20
Hemostat	Fine Science Tools	13004-14
Scalpel	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel Blade #15	Fisher Scientific	10015-00
EZ Clips	Fisher Scientific	59027
Sterile sutures	Fine Science Tools	12051-10
Instrument Sterilizer	Fine Science Tools	14040-10
Surgical Stabilizer	Custom Manufactured	N/A	Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
Vertebral Stabilization Bars (clawed endfeet)	Custom Manufactured	N/A	Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
NYU/MASCIS Impactor Device	Custom Manufactured	W. M. Keck Center for Collaborative Neuroscience Rutgers, The State University of New Jersey e-mail: impactor@biology.rutgers.edu