의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가
Summary
마이크로 RNA는 뇌의 구조와 기능에 중요한 역할을한다. 여기에 우리가 과다 발현은 설계 miRNA의 발현 렌티 바이러스의 정위 주사를 사용하여 해마 miRNA의를 적용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은을 평가하는 상대적으로 빠른 방법으로 사용할 수 있습니다<em> 생체 내</em> 특정 뇌 영역의 이상 발현의 miRNAs의 효과.
Abstract
마이크로 RNA는 (miRNAs는) 오래 22 세포핵 주변에 작은 규제 단일 가닥 RNA 분자하는 수있는 각 대상 다수의 mRNA의 성적 증명서 및 유도 파괴 및 / 또는 이러한 대상의 억제에 의해 번역 희미 전체 유전자 발현 통로. 몇 가지의 miRNAs는 신경 세포의 구조와 기능을 유지하고 높은 수준의 뇌 기능에 중요한 역할을하고, 방법은 이러한 기능을 탐험에 대한 자신의 수준을 조작하기위한 돕고 있습니다. 여기, 우리는 miRNA의 인코딩 바이러스 입자의 정위 주사 생쥐의 과잉 적용의 miRNAs의인지 결과를 조사하기위한 생체 방법으로 직접 제시한다. 특히, 현재의 프로토콜은 포유류의 메모리 통합, 학습, 스트레스 반응에 기여하고, 편리 주사 부위를 제공하는 해마 CA1 영역,에 주입을 포함한다. 좌표는 마우스 브레 그마 및 바이러스 관류 디지털 제어와 매우 느린 유지에 따라 측정됩니다.주사 후, 수술 상처 밀봉 동물 복구합니다. 해당 mRNA의 목표 소음기를 인코딩 렌티 바이러스는 순진 마우스와 관찰 결과에 대한 책임 특정 miRNA에 / 타겟 상호 작용을 내포하는 역할을, 식염수 컨트롤과 같은 "빈"lentivirus를 벡터로 주입 생쥐에 주입 쥐. 한 달 후 주입, 동물들은 탐색 학습과 기억 능력을 평가하기위한 모리스 물 미로 (MWM)에서 검토된다. MWM 1 센티미터 물 표면 아래 물속에 작은 플랫폼과 색 물이 가득 라운드 탱크. 탱크 주위에 꾸준한 시각적 공간적 탐색 (소리와 지구의 자기장도 탐색에 동물을 도움이 될)을 허용합니다. 비디오 카메라 모니터링 찾아 플랫폼을 양에 수영 시간의 경로를 측정 할 수 있습니다. 마우스가 먼저 숨겨진 플랫폼을 장착하면 강제 수영에서 탈출을 제공하는 배운, 그것은 다음이 탈출와 f를 사용하기위한 테스트inally, 플랫폼을 제거하고 마우스의 이전 위치를 기억하는 경우 프로브 테스트 검사합니다. 여러 개의 연속적인 일 동안 반복 테스트 플랫폼을 찾아 마운트 짧은 대기 시간의 테스트 생쥐의 향상된 성능을 강조하고 더 직접적인 경로는 플랫폼 또는 그 위치에 도달 할 수 있습니다. 이러한 개선 후 (고가 플러스 미로 등) 구체적으로 테스트 할 수 있습니다 장애 학습과 기억 및 / 또는 불안을 나타냅니다 표시하는 오류가 발생했습니다. 이 방법은 연구인지 및 / 또는 스트레스 관련 프로세스의 특정 miRNA에 및 대상 증명서의 유효성을 검사 할 수 있습니다.
Introduction
신경계의 기능의 특정 miRNA에의 역할은 최근 여러 연구에서 렌티 바이러스 주입에 의해 도전되었다. 의 miRNAs는 시냅스 구조 1, 시냅스 2 시냅스 리모델링 및 유지 보수 3을 유지하고 재 형성에 중요한 것으로 발견되었습니다. 이러한 연구는 강하게 최대 형성 모두와 신경계,인지 기능의 메인 출력을 유지하고있는 다중 수준 조절 효과를 통해, miRNAs는이 종사하는 것이 좋습니다. 쥐 뇌의 특정 영역으로 렌티 바이러스 입자의 정위 주사 시냅스 형태와 신경 활동의 변화를 검색 가능하게하고, 4,5 이상 발현의 성적 기능 중요성을 설정하는 데 사용되었다. miRNA의 발현 렌티 바이러스와 잘 정의 된 뇌 영역의 뉴런의 직접적인 감염은 노화, 뇌 질환 및 신경 변성 연구에 연루 될 수 있으며 miRNA에 대한 연구들 행동 규칙 6-8의 영역에서 훨씬 적은 고급 상태에있다, 그리고 정위 주입 miRNA의 발현 행동 검사 다음 렌티 바이러스 입자는 이러한 목적을 위해 유용 할 수 있습니다. 위로 또는 아래의 발현을 유도하기위한 훨씬 더 힘드는 방법은 유전자 녹아웃 또는 녹아웃 마우스 조작이 포함됩니다. 유전 시스템은 더 발현 조건과 시간적 제어 (예를 들어, 크레 – 훈제 연어, 테트 시스템)을 허용 할 수 있지만, 이것들은 거의 주입 절차의 공간 특이성을 제공하지 않으며 leakiness의 일정 금액은 거의 항상있다. 또한, 설계 절차는 수술을 필요로하지 않는 비교적 좋은 재현성 실험실에서 사용할 수 있지만, 그들은 느린 그리고 더 많은 인력과 재정 자원을 필요로합니다. 또한,의 시간적 제어를 통해 또는 주입 생쥐에서 아래의 발현은 유전자 조작 생쥐에 비해 훨씬 더 정확합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
렌티 바이러스의 정위 주입을위한 두 위쪽 또는 다른 유전자와 miRNA에의 다운 규제 생체 내 평가에 대한 상대적으로 빠른 방법입니다. 주요 대안은 다음 훨씬 더 힘들고 시간이 많이 소요되는 기술을 직접 lentivirus를 주입이다 유전자 조작 마우스입니다. 또한, 최대 규제, lentivirus의 주입에 성인 마우스의 특정 시간에 발생하고 대부분 시간적 컨트롤을 포함 유전자 조작 생쥐의 경우와 같이, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 뇌 과학 에드몬드 릴리 프라 센터 (SB 교제), 이스라엘 과학 재단 (HS 권한 부여 번호 11분의 378)의 유산 유산의 생명 과학 파트너십 프로그램 및 과학에 대한 독일 이스라엘 재단에 의해 지원되었다 연구와 개발 (GIF) (HS 권한 부여 번호 1093-32.2/2010).
Materials
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment – Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer’s disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer’s disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
