Summary
יש מיקרו RNA תפקידים משמעותיים במבנה המוח ותפקודו. כאן אנו מתארים שיטה לאכיפת מירנה היפוקמפוס יתר ביטוי באמצעות הזרקת stereotactic של lentivirus מירנה מביע מהונדס. גישה זו יכולה לשמש כדרך מהירה יחסית על מנת להעריך את
Abstract
מיקרו RNA (miRNAs) הם מולקולות רגולטוריות קטנות חד גדילי RNA כ -22 נוקלאוטידים ארוכים שעשוי כל יעד תעתיקי mRNA רבים ומסלול כולו עמום ביטוי גנים על ידי הרס ו / או תרגום עיכוב של יעדים אלה ישכנעו. כמה miRNAs לשחק תפקיד מפתח בשמירה על מבנה ותפקוד עצביים ובתפקודי מוח ברמה גבוהה יותר, והם חיפשו שיטות לרמותיהם מניפולציה בשביל לחקור את הפונקציות האלה. כאן, אנו מציגים שיטה ישירה בvivo לבחינת ההשלכות הקוגניטיביות של miRNAs נאכפה עודפת בעכברים על ידי הזרקה של חלקיקי נגיף stereotactic מירנה קידוד. באופן ספציפי, בפרוטוקול הנוכחי כרוך בהזרקה לאזור CA1 בהיפוקמפוס, התורמת לגיבוש יונקים זיכרון, למידה, ותגובות לחץ, ומציע הזריקה נוחה. את הקואורדינטות נמדדות לפי גבחת העכבר וזלוף הווירוס נמצא בשליטה דיגיטלית ושמר איטיים מאוד.לאחר הזרקה, פצע הניתוח הוא חתום ואת בעלי החיים להתאושש. Lentiviruses קידוד משתיקי קול של מטרות mRNA המתאימות לשמש כדי לסבך את מירנה / יעד האינטראקציה הספציפית אחראית לאפקט הנצפה, עם עכברים נאיביים, עכברים שהוזרקו עם מי מלח ועכברים שהוזרקו עם וקטורי lentivirus "ריקים" כקבוצת ביקורת. חודש אחד לאחר ההזרקה, החיות נבחנות במבוך המים של מוריס (MWM) להערכת למידת הניווט שלהם ויכולות זיכרון. MWM הוא המכל עגול מלאים במים צבעוניים עם פלטפורמה קטנה שקועה 1 ס"מ מתחת לפני המים. רמזים חזותיים יציבים סביב הטנק לאפשר ניווט המרחבי (קול והשדה המגנטי של כדור הארץ עשוי גם לסייע לבעלי החיים בניווט). ניטור מצלמת וידאו מאפשר מדידת מסלול השחייה ואת הזמן כדי למצוא ויסתכם בפלטפורמה. העכבר ראשון שלמד את ההרכבה הפלטפורמה הנסתרת מציעה מפלט מהחייה הכפויה, אלא לאחר מכן הוא נבדק על שימוש בבריחה וF זהinally, הפלטפורמה מוסרת ובדיקות בדיקה לבחון אם העכבר זוכר את מיקומו הקודם. בדיקות חוזרות ונשנות על פני כמה ימים רצופים להדגיש ביצועים משופרים של עכברים נבדקו בlatencies קצר יותר כדי למצוא ולהתקין את הפלטפורמה, ומסלולים כיותר ישירים כדי להגיע לפלטפורמה או מיקומו. כישלון להראות שיפור כזה מייצג לקוי למידה וזיכרון ו / או חרדה, אשר לאחר מכן ניתן לבחון באופן ספציפי (לדוגמה: במבוך בתוספת המוגבה). גישה זו מאפשרת אימות של miRNAs ספציפית ותמלילי היעד בהקוגניטיבית ו / או תהליכים הקשורים ללחץ למד.
Introduction
התפקיד של miRNAs מסוימת בתפקוד מערכת עצבים באחרונה לערער על ידי הזרקת lentiviral במספר מחקרים. MiRNAs כבר מצא להיות חיוני לשמירה ועיצוב מחדש מבנה סינפסה 1, 2 synaptogenesis ושיפוץ סינפסה ותחזוקה 3. מחקרים אלה ממליצים כי miRNAs עוסקות, דרך השפעות הרגולטוריות ריבוד בשניהם בעיצוב למעלה ובשמירה על התפוקה העיקרית של מערכת העצבים, תפקוד הקוגניטיבי. הזרקה של חלקיקי Stereotactic lentivirus לאזורים ספציפיים במוח המכרסם מאפשרת מחפשת שינויים במורפולוגיה סינפסה ופעילות עצבית, ושימש להקמת המשמעות התפקודית של תמלילי ביטוי יתר 4,5. זיהום ישיר של תאי עצב באזורי המוח מוגדרים היטב עם lentiviruses מירנה-להביע עשויה להיות מעורב במחקרים של הזדקנות, הפרעות במוח וניוון מוחיים, מחקרים של מירנהים בתחום של רגולציה התנהגותית 6-8 נמצא במצב הרבה פחות מתקדם, והזרקת stereotactic של מירנה-להביע חלקיקי lentivirus ואחרי בדיקות התנהגותיות עשוי להיות שימושי למטרות האמורות. שיטה הרבה יותר מייגע לגרימה מעל או מתחת, ביטוי כרוך בהנדסה גנטית עכברים בנוקאאוט דפיקה באו. מערכות גנטיות נוספות יכולות לאפשר לבקרה מותנית ובזמן על ביטוי (למשל Cre-קס, מערכות ט), אך אלה כמעט לא להציע סגוליות המרחבי של הליך ההזרקה וכמעט תמיד יש כמות מסוימת של דליפות. כמו כן, את הנהלים ההנדסיים אינם דורשים ניתוח, וניתן להשתמש בכל מעבדות עם שחזור טוב יחסית, עם זאת, שהם איטיים יותר ודורשים הרבה יותר כוח אדם ובמשאבים כספיים. בנוסף, השליטה הזמנית של מעל או מתחת הביטוי בעכברים שהוזרקו הוא הרבה יותר מדויק בהשוואה לעכברים מהונדסים גנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת lentivirus
- לגדל תאי HEK-293FT למפגש 90%.
- ביום של מדיום סלולארי שינוי transfection לסרום ללא DMEM בתוספת גלוטמין 1 מ"מ ו -50 פניצילין, סטרפטומיצין מ"ג / מ"ל.
- שיתוף transfect התאים עם וקטור pLKO.1-Puro ועם פלסמידים קידוד לR8.2 הדלתא וVSV-G moieties ומירנה של עניין, באמצעות 10 μl של polyethylenimine 1 מ"ג / מ"ל כנשא 9.
- לאסוף lentiviruses ארוז ב24 שעות ו -48 שעות לאחר transfection, לסנן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.
- לרכז את lentiviruses באמצעות ultracentrifugation ב70,000 XG, במשך שעה 2 ו -15 מעלות צלזיוס, aliquot ולאחסן ב -70 ° C.
- כייל נגיף מידה על ידי הדבקה של תאי HEK-293T עם הכנות וירוס דילול סדרתי (1 עד 10 -6 מ"ל של וקטור לכל טוב). כתוצאה כייל (מינימום של ~ 1 × 10 9 חלקיקים זיהומיות למ"ל מומלץ) מוערך על ביטוי של gene של עניין, באמצעות בחירת puromycin וכימותים על ידי GFP להביע וירוסים באמצעות ספירת תאי ניאון.
לפרוטוקול מפורט יותר של הכנת lentivirus לראות 10.
2. הכנת בעלי חיים לניתוח
- לבוש מנתחים צריך לכלול חלוק ניתוחים, כפפות סטריליות, כובע ומסכה.
- לשקול את בעל החיים, ואז להרדים אותו עם ה-IP-הזרקה של תערובת קטמין, עם הנפח הפרופורציונלי למשקל החיה כמפורט עבור כל תרופה. לתערובת קטמין / Xylazine, טווח מינון של קטמין מ"ג / ק"ג 80-200 ו7-20 Xylazine מ"ג / ק"ג משמש בדרך כלל לעכברים.
- חכה עד שהחיה היא בהרדמה מלאה, ואז לבדוק לחוסר רפלקס נסיגה באיבר האחורי של החיה על ידי הארכת האיבר ולאחר מכן לחיצה עליו עם האצבע שלך.
- הזרק את החיה מתחת לעור עם Rimadyl, כמפורט בקופסה, להקלה על כאב. טווח מינון אופייני לRymadil הוא 5-10 מ"ג.
- מניחים את החיה על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף קבועה וללחלח את העיניים עם משחה.
- לגלח את האזור שבין שתי האוזניים עם מכונת חיתוך.
- לטהר את העור עם בטאדין.
3. חשיפה של הגולגולת והקידוחים
- מניחים את החיה בתוך stereotact על ידי התאמת המוטות לתוך הסדקים רק הקדמיים לאוזניים של בעלי החיים.
- השתמש באזמל כדי לעשות חתך קדמי, אחורי של כ -1.5 ס"מ בין האוזניים ולשמור אותו לפתוח עם מהדק ניתוח (serfines).
- נקה את פני השטח של הגולגולת עם מקלון צמר גפן עד לצומת שבין תפר העטרה ותפרי sagittal, כלומר גבחת וצומת בין תפרי העטרה וlambdoid, כלומר למבדה, גלויים.
- כוון את הקצה של המזרק, שנערך על ידי stereotact, עד לנקודת שגבחת, בכל שלושת הצירים. רשום את הקואורדינטות. נקודה זו תיחשב כPO אפסint בכל שלושת הצירים.
- הרם את המזרק בציר האנכי, כך שתנועה מישוריים לא לשרוט את הגולגולת ולהזיז את ראש המזרק למיקום הנכון. זריקות CA1 בהיפוקמפוס דורשות הבא מרכז יחסית לגבחת במ"מ: -2 בציר הקדמי / אחורי, ± 1.8 בציר הרוחב / המדיאלי ו-1.5 בציר הגב / הגחון.
- מנמיכים את הקצה של המזרק עד שהוא נוגע בגולגולת ולסמן את המקום עם טוש. הוצא את המזרק בחזרה כדי להימנע מהדקירה.
- לקדוח חור רדוד, רק בעצמות הגולגולת באמצעות הקודח בסדר. החזק את הקודח יציב כדי שלא ימשיך לקדוח לתוך הרקמות הרכות שמתחת. ניתן למנוע זאת על ידי יד אחת מייצבת עם השני ועל ידי קידוח בפולסים קצרים.
4. הזרקה של Lentivirus
- לסגת 0.5 מ"ל של פתרון lentivirus המרוכז.
- הנח את המזרק מעל לחור ומוריד אותה לאט במאונך עד שזה פליליתצ 'ס את פני השטח של הגולגולת. להמשיך ולהפחית את המזרק לתוך המוח באיטיות רבה. בשלב זה, עלול לגרום לדימום שאינו מצביע בהכרח על חדירה נכשלה. אם דימום מתרחש לנגב אותו עם מקלון צמר גפן.
- הגדר את המשאבה הדיגיטלית ל0.02 מ"ל / דקה (0.5 μl הייתי להיות מוזרק ב25 דקות) ולהתחיל עירוי. עירוי איטי מאפשר הפצה יעילה של הווירוס לתוך הרקמות ומונע חזרה לזרום. בחלק מסוגי המזרק לשקול החדרת המזרק לעומק נוסף של 0.5 מ"מ לפני שנסוג לקואורדינטות ויציקה מקוריות.
- לאחר העירוי הושלם להמתין במשך 5 דקות נוספות כדי לאפשר את החומר להתפשט לתוך המוח במקום לסגת בחזרה לתוך התעלה שהוקמה על ידי המזרק.
- הוצא את המזרק באיטיות רבה ולצפות לזורם בחזרה. אם זרימה לאחור הוא ציין בשלב זה, כל חלק של החומר המוזרק היה כנראה הולכים לאיבוד.
5. איטום פצע ושחזור
- ה חותםדואר פצע עם histoacryl. הקפד למנוע דליפה של histoacryl לתוך עיניו.
- הזרק intraperitoneally בעלי החיים (IP) עם מי מלח 1 מ"ל מחומם מראש, כדי למנוע התייבשות.
- מניחים את החיה בכלוב התאוששות שממוקמת על משטח לוהט. צפו בבעלי החיים בזמן שהוא מתאושש לשעה נוספת.
במקרה של ירידה במשקל, inappetance, צריכה להתבצע חולשה / חוסר היכולת להשיג מזון או מים, מדינה גוססת או זיהום, המתת חסד של בעלי החיים. שיטות מקובלות להמתת חסד של מכרסמים הן כדורי שינה, הרדמה נשימתית, CO 2, CO, או אשלגן כלורי בשיתוף עם הרדמה כללית.
לאחר 4 עד 6 שבועות, להעריך את זכרון הניווט של החיה מוערך במבוך המים של מוריס. Lentivirus בדרך כלל להדביק את רוב התאים בתוך מעגל ההזרקה.
6. הערכת התנהגות במבוך המים של מוריס
- להכשיר את בעלי החיים בMמבוך המים orris. לאימונים מדויק ופרוטוקול בדיקה לראות 11. אחרי כל ניסוי, לייבש את החיה עם מגבת יבשה, להחליף אותו בכלוב שלו ולרענן את המים במכל.
- לבחון את בעלי החיים במבוך המים של מוריס במשך 3 ימים רצופים, 4 ניסויים בכל יום. בכל יום להכניס את בעל חיים לתוך המבוך בכל אחד 4 הכיוונים של המבוך (צפון, דרום, מזרח ומערב) בשינוי סדר, למשל יום אחד: ממזרח למערב, צפון לדרום, יום שני: ממערב לדרום -צפון מזרח. נגב את החיות אחרי כל משפט.
- במהלך בדיקת ניסויים לעקוב אחר בעלי החיים עם מערכת מעקב כגון מערכת מעקב Noldus.
- אחרי משפט מבחן ה -12, הכנס את בעל החיים לתוך המכל המים ללא פלטפורמה לדקה אחת. זה יהיה להשתמש בו כדי לנתח את אסטרטגית חיפוש בעלי החיים הוא לוקחים.
- לנתח את הנתונים כפי שהוצע ב12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הזרקה של 0.5 lentivirus μl לאזור CA1 בהיפוקמפוס העכבר, עם קצב הזרימה מצויינים בסעיף הפרוטוקול מניבה תחום נגוע של כ 1 מ"מ בציר מקורי, הזנב, ועל 0.5 מ"מ וברוחב המדיאלי-הקדמי צירים אחוריים-(איור 3).
איור 1. נקודת גבחת ומכשירי הזרקה. (א) הוא מוצג מפה סכמטית של גבחת (צומת תפרי העטרה ועל sagittal) ולמבדה (צומת תפרי Lambdoid וsagittal) כפי שניתן לראות לאחר ביצוע החתך. (ב) תמונה המתארת את הרכיבים מכאניים העיקריים של מנגנון stereotactic.
איור 2. Lentivirus עמ 'רכיבי rincipal. lentivirus כולל רכיבים המאפשרים עמידות לאנטיביוטיקה (Ampiciline, Amp R), גן כתב (GFP), 5 'ו 3' חוזר מסוף הארוך (LTR) לשילוב יעיל וביטוי של הווירוס ואת הגן של עניין (מירנה).
איור 3. אתר הזרקה ובtransfection Lentivirus vivo. (א) אתר הזרקה לפי אטלס העכבר. הזרקה מופנה לאזור CA1 של ההיפוקמפוס. (ב) כימות GFP ביחידות שרירותיות (מדד מנורמל של הכמות "ירוק" ראתה בכל שדה) לאורך 11 פרוסות, כל אחד 40 מיקרומטר העבה, בציר מקורי, הזנב. (C, D, E ו-F). תחומים ספציפיים לעמדות המסומנות עלגרף בסעיף ב '. מכתים DAPI באדום ו-GFP בירוק. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. הערכת התנהגות של עכברים בMWM. () ממוצע השהיה כדי למצוא את הפלטפורמה הנסתרת לעכברים שהוזרקו עם lentivirus להביע מירנה ספציפית (מיועד miR-X באיור, עיגולים אדומים, N = 10) ועכברים שהוזרקו עם לטרוף להביע lentivirus (משולש ירוק, N = 10). ברים שגיאה מייצגים SEM. ANOVA P-ערך <0.05. (ב) מסלולי נציג של המשפט האחרון לשתי הקבוצות. (ג) ממוצעים המרחק ב30 דקות בשדה הפתוח לעכברים שהוזרקו עם miR להביע lentivirus נבדק (ירוק), לטרוף להביע lentivirus (אדום) ובעלי חיים בלתי מוזרקים (כחול). אין הבדל בפעילות התנועה העולמית זוהה (ANOVA P> 0.1). (ד) מסלולי נציג של עכברים מכל קבוצה ב( ג).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הזרקת Stereotactic של lentivirus היא שיטה מהירה יחסית להערכה בvivo עבור שניהם למעלה או למטה רגולציה של גנים וmiRNAs שונים. החלופה העיקרית היא עכבר מהונדס גנטי אשר הוא טכניקה רב הרבה יותר מפרכת ושעה לאחר מכן זריקת lentivirus ישירה. בנוסף, הרגולציה למעלה, בהזרקת lentivirus, מתרחשת בזמן מסוים בעכבר הבוגר, ואינה כוללת כל אפשרות של דליפות במהלך פיתוח, כפי שהוא לרוב במקרה בעכברים המהונדסים גנטי שכוללים שליטה זמנית. שליטה מלאה זמנית היא חיונית בעת בחינת הרלוונטיות של גנים שונים במחלות ניווניות שבו הרגולציה שינה מתרחשת בשלב מאוחר בחייו של בעל החיים. בנוסף, הזרקת lentivirus מציעה שליטה מרחבית מדויקת, ששוב, כפופה לכמות מסוימת של דליפות במערכות מהונדסות גנטי. המערכות הנדסי העכבר לנצל endogeהספציפיות תושייה של גורמי שעתוק שונים על ידי הוספת הוספה של אמרגן מסוים שיכול להיות מופעל רק באזור מסוים או בסוג התא. לשם השוואה, יכולות להיות מוגבלות זריקות lentivirus במרחב מבלי לשנות את הווקטור. החסרונות של הזרקת lentivirus הם הדרישה להליך כירורגי מייגע ושחזור מפוקפק בין מעבדות. לאחר ניתוח ההזרקה, תקופה של זמן, בין שבוע ו3 שבועות חייב לעבור לוירוס כדי לגרום להשפעה ולבעלי החיים כדי להתאושש, לפני שניתן יהיו לבצע פרוטוקולים נוספים כגון ערכות התנהגותיות וביוכימי. ללימודים שבזמן של אינדוקציה צריכה להיות בסמיכות להערכות השונות lentivirus המוזרק יכול לכלול מערכת זמנית שליטה, כגון מערכת Cre-קס, ואנטיביוטיקה יכולים לשמש במקרה כזה כinducer זמן רב לאחר בעלי החיים התאוששו לחלוטין. טכניקה זו הוצגה ב13. לגבי reproducibility בין זריקות, קבוצות המבצעות בשיטה זו באופן שגרתי הראו מיקוד ומסירה של חומר מוזרק בין בעלי החיים 13 למדי לשחזור. שחזור בין המעבדות הוא עניין שדורש זהירות רבה, שכן מעבדות שונות משתמשות במזרקים שונים, סוגים שונים של קצה מזרק (קהה או חד), ושיעורי זרימה שונים, המשפיעים בתחום ההזרקה וכתוצאה מכך. בשתי שיטות השפעת מיקומית בשל אינטגרציה אתר הגנומי עלולה להתרחש. בקו המהונדס התוצאה תהיה השתקת גנים בכל השורה. באוכלוסייה הזריק lentivirus, לעומת זאת, ההשפעה תהיה מוגבלת לקבוצה קטנה של האוכלוסייה. שילוב ניסויי miR יחד עם ניסויי shRNA in vivo יכול לשפוך אור על סגוליות של ההשפעה של miR מסוים על היעד שלו 6,8. לבסוף, הזרקת lentivirus ניתן להשתמש בעכבר מציאה מהונדס לבדיקת השפעה לדפוק בספציפיתהאזור במוח IC וישמש לאובדן תפקוד / הצלה של ניסויי פונקציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מרכז אדמונד ולילי ספרא למדעי המוח (SB מלגה), התכנית המורשית ביו רפואית מדע השותפות של הקרן הלאומית למדע (מענק מס '378/11, ל"מ) וקרן גרמנית למדע מחקר ופיתוח (GIF) (גרנט 1093-32.2/2010 מס, לHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 | |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment - Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 | |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
