حقن المجسم من الرنا الميكروي، معربا عن Lentiviruses إلى CA1 الحصين ماوس المنطقة وتقييم حصيلة السلوكية
Summary
MicroRNAs لها أدوار هامة في بنية الدماغ ووظيفته. هنا نحن تصف طريقة لفرض ميرنا الحصين الإفراط في التعبير باستخدام حقن المجسم من الفيروسة البطيئة ميرنا، معربا عن هندسيا. يمكن لهذا النهج بمثابة وسيلة سريعة نسبيا لتقييم<em> في الجسم الحي</em> آثار لل miRNAs الإفراط في المعبر عنها في مناطق محددة في الدماغ.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) هي عبارة عن جزيئات الحمض النووي الريبي الذين تقطعت بهم السبل واحدة تنظيمية صغيرة حول 22 النيوكليوتيدات طويلة على أنه يجوز لكل هدف العديد من النصوص مرنا وخافت على كامل مسار الجين التعبير من خلال تدمير حمل و / أو ترجمة تثبيط هذه الأهداف. العديد من miRNAs تلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على بنية الخلايا العصبية وظيفة وظائف المخ في المستوى العالي، ويتم البحث عن طرق لمعالجة مستوياتها لاستكشاف هذه الوظائف. هنا، نقدم طريقة مباشرة في الجسم الحي لدراسة العواقب المعرفية لل miRNAs القسري الزائدة في الفئران عن طريق الحقن المجسم من جزيئات الفيروس ميرنا ترميز. على وجه التحديد، والبروتوكول الحالي ينطوي على الحقن في المنطقة CA1 الحصين، الأمر الذي يسهم في توطيد الثدييات الذاكرة، والتعلم، واستجابات التوتر، ويقدم موقع الحقن مريحة. يتم قياس الإحداثيات وفقا لbregma الماوس، ويتم التحكم رقميا نضح الفيروس وأبقى بطيئة جدا.بعد الحقن، وختم الجرح الجراحة والحيوانات استرداد. Lentiviruses ترميز كواتم الصوت من الأهداف مرنا المقابلة تعمل على توريط ميرنا / الهدف التفاعل محددة مسؤولة عن تأثير الملاحظ، مع الفئران السذاجة، حقن الفئران بمحلول ملحي وحقن الفئران مع "فارغة" ناقلات الفيروسة البطيئة والضوابط. شهر واحد بعد الحقن، ويتم فحص الحيوانات في متاهة موريس المائية (MWM) لتقييم التعلم الملاحة وقدراتهم الذاكرة. وMWM هو خزان جولة مملوءة بالماء الملون مع منصة صغيرة مغمورة 1 سم تحت سطح الماء. الإشارات البصرية ثابت حول خزان تسمح للملاحة الفضائية (صوت وربما حقل المغناطيسي للأرض أيضا مساعدة الحيوانات في التنقل). ورصد كاميرا فيديو تتيح قياس مسار السباحة والوقت للعثور على وترقى المنصة. تدرس الماوس الأولى التي تركيب منصة خفية يوفر الهروب من السباحة القسري؛ ثم يتم اختباره لاستخدام هذا الهروب وجمعةinally، تتم إزالة منصة والاختبارات التحقيق فحص إذا كان الماوس يتذكر موقعه السابق. الاختبارات المتكررة على مدى عدة أيام متتالية تسليط الضوء على تحسن أداء الفئران اختبارها في الإختفاء أقصر لإيجاد وتحميل منصة، وطرق وأكثر مباشرة للوصول إلى منصة أو موقعه. عدم إظهار هذا التحسن تمثل ضعف في التعلم والذاكرة و / أو القلق، والتي قد ثم يتم اختبارها على وجه التحديد (على سبيل المثال في المتاهة زائد مرتفعة). هذا النهج يمكن التحقق من صحة لل miRNAs محددة ومحاضر الهدف في درس المعرفي و / أو العمليات المرتبطة بالتوتر.
Introduction
وقد تم مؤخرا تحدى دور لل miRNAs خاصة في أداء الجهاز العصبي عن طريق الحقن lentiviral في العديد من الدراسات. تم العثور على MiRNAs أن تكون حاسمة للحفاظ وإعادة تشكيل بنية المشبك 1 synaptogenesis، و2 و إعادة عرض المشبك وصيانة 3. هذه الدراسات تشير بقوة إلى أن miRNAs يشاركون، عبر آثار التنظيمية multileveled سواء في صياغة وتصل في الحفاظ على الناتج الرئيسي من الجهاز العصبي، والوظيفة المعرفية. حقن المجسم من جسيمات الفيروسة البطيئة إلى مناطق محددة في الدماغ القوارض تمكن بالبحث عن تغييرات في التشكل المشبك ونشاط الخلايا العصبية، وكانت تستخدم لإقامة أهمية وظيفية من خلال النصوص التي تبديها 4،5. قد تكون متورطة عدوى مباشرة من الخلايا العصبية في مناطق الدماغ محددة جيدا مع ميرنا، معربا عن lentiviruses في دراسات الشيخوخة، واضطرابات المخ وتنكس عصبي؛ دراسات ميرناو في مجال التنظيم السلوكي 6-8 هي في حالة أقل بكثير المتقدمة، وحقن المجسم من ميرنا، معربا عن جسيمات الفيروسة البطيئة تليها الاختبارات السلوكية قد تكون مفيدة لمثل هذه الأغراض. وهناك طريقة أكثر بكثير شاقة لإحداث الزائد أو الناقص في التعبير ينطوي المهندسة وراثيا أو الضربة القاضية في الفئران خروج المغلوب. ويمكن لنظم وراثية تسمح بالمزيد من أجل السيطرة المشروطة والزمانية على التعبير (على سبيل المثال لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن، ونظم تيت)، ولكن هذه بالكاد توفر خصوصية المكاني لإجراء الحقن، وهناك دائما تقريبا كمية معينة من التسرب. أيضا، الإجراءات الهندسية لا تتطلب عملية جراحية، ويمكن استخدامها في جميع أنحاء مختبرات مع استنساخ جيدة نسبيا، إلا أنها تكون أبطأ وتتطلب أكثر من ذلك بكثير القوى العاملة والموارد المالية. وبالإضافة إلى ذلك، والسيطرة الزمنية من الإفراط في أو تحت التعبير في حقن الفئران هي أكثر دقة بكثير بالمقارنة مع الفئران المعدلة وراثيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
حقن المجسم من الفيروسة البطيئة هي طريقة سريعة نسبيا للتقييم في الجسم الحي على حد سواء أعلى أو أسفل تنظيم الجينات وmiRNAs مختلفة. البديل الرئيسي هو الفأر وراثيا الذي هو تقنية تستهلك الكثير أكثر شاقة والوقت ثم حقن الفيروسة البطيئة مباشرة. وبالإضافة إلى ذلك، وتنظيم م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل مركز الصفرا ادمون والزنبق للعلوم الدماغ (SB الزمالة)، وراثي التراث الطبية الحيوية برنامج الشراكة العلوم من مؤسسة العلوم اسرائيل (منحة رقم 378/11، إلى HS) ومؤسسة الألمانية للالإسرائيلي العلمية البحث والتطوير (GIF) (منحة رقم 1093-32.2/2010، إلى HS).
Materials
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment – Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer’s disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer’s disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
