Stereotaktisk Injeksjon av MikroRNA-uttrykker Lentiviruses til Mouse Hippocampus CA1 Region og vurdering av Behavioral Outcome
Summary
MicroRNAs få en betydelig rolle i hjernens struktur og funksjon. Her beskriver vi en metode for å håndheve hippocampus miRNA over-uttrykk ved hjelp stereotaktisk injeksjon av en konstruert miRNA-uttrykke lentivirus. Denne tilnærmingen kan tjene som en relativt hurtig måte å vurdere<em> In vivo</em> Effekter på over-uttrykt miRNAs i bestemte områder av hjernen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er små regulatoriske single-RNA-molekyler rundt 22 nukleotider lange som kan hvert mål mange mRNA transkripsjoner og dim en hel genuttrykk sti ved å fremkalle ødeleggelse og / eller hemme oversettelse av disse målene. Flere miRNAs spiller sentrale roller i å opprettholde neuronal struktur og funksjon, og i høyere nivå hjernefunksjoner, og metoder er søkt for å manipulere sine nivåer for å utforske disse funksjonene. Her presenterer vi en direkte in vivo metode for å undersøke de kognitive konsekvenser av tvangssalg mirnas overskytende hos mus ved stereotaktisk injeksjon av miRNA-koding viruspartikler. Konkret innebærer det gjeldende protokoll injeksjon i hippocampus CA1 regionen, som bidrar til pattedyr minne konsolidering, læring, og stressresponser, og tilbyr en praktisk injeksjonsstedet. Koordinatene blir målt i henhold til musen bregma og virus perfusjon kontrolleres digitalt og holdt meget langsom.Etter injeksjon, blir operasjonen såret forseglet og dyrene gjenopprette. Lentiviruses koder lyddempere av tilsvarende mRNA mål tjene til å implisere den spesifikke miRNA / target samhandling ansvarlig for den observerte effekten, med naive mus, mus injisert med saltvann og mus injisert med "tomme" lentivirus vektorer som kontroller. En måned etter injeksjon, dyrene er undersøkt i Morris Water Maze (MWM) for å vurdere deres seilas læring og minne evner. Den MWM er en rund tank fylt med vann farget med en liten plattform neddykket 1 cm under vannoverflaten. Steady visuelle signaler rundt tanken tillate romlig navigasjon (lyd og jordens magnetfelt kan også hjelpe dyrene med å navigere). Video kamera overvåkning gjør det mulig å måle ruten for svømme og tid til å finne og utgjøre plattformen. Musen er først lært at montering av skjult plattform tilbyr en flukt fra den håndheves svømming, det er da testet for å bruke denne rømning og finally er plattformen fjernes og probe tester undersøke om musen husker sin tidligere plassering. Gjentatte tester gjennom flere påfølgende dager markere forbedret ytelse av testede mus ved kortere ventetider for å finne og montere plattformen, og som flere direkteruter til nå plattform eller plasseringen. Unnlatelse av å vise en slik forbedring representerer svekket læring og hukommelse og / eller angst, som deretter kan bli testet spesifikt (for eksempel i forhøyet pluss-labyrint). Denne tilnærmingen gjør validering av spesifikke miRNAs og målet transkripsjoner i studert kognitive og / eller stress-relaterte prosesser.
Introduction
Rollen av bestemte miRNAs i nervesystemet fungerer har nylig blitt utfordret av lentiviral injeksjon i flere studier. MiRNAs har vist seg å være avgjørende for å opprettholde og re-shaping synapse struktur 1, synaptogenesis 2 og synapse ombygging og vedlikehold tre. Disse studiene tyder på at miRNAs er engasjert, via multileveled regulatoriske effekter i både utvikler seg og i å opprettholde den viktigste produksjonen av nervesystemet, kognitiv funksjon. Stereotaktisk injeksjon av lentivirus partikler inn i bestemte regioner i gnager hjernen gjør søker etter endringer i synapse morfologi og neuronal aktivitet, og ble brukt for å opprette funksjonell betydning på over-uttrykt transkripsjoner 4,5. Direkte smitte av nerveceller på veldefinerte hjernen områder med miRNA-uttrykke lentiviruses kan være innblandet i studier av aldring, hjernen lidelser og nevrodegenerasjon; Studier av miRNAs i riket av atferdsmessige regulering 6-8 er på et langt mindre avansert tilstand, og stereotaktisk injeksjon av miRNA-uttrykke lentivirus partikler etterfulgt av atferdsmessige tester kan være nyttig for slike formål. En betydelig mer arbeidskrevende metode for å indusere over-eller under-uttrykket innebærer genmodifisert knock-in eller knockout mus. Genetiske systemer kan videre tillate betinget og temporal kontroll på uttrykk (f.eks Cre-Lox, Tet-systemer), men disse neppe gi den romlige spesifisitet av injeksjon prosedyre og det er nesten alltid en viss leakiness. Også, de tekniske prosedyrene ikke kreve kirurgi og kan brukes på tvers av laboratorier med relativt god reproduksjonsevne, men de er tregere og krever mye mer arbeidskraft og økonomiske ressurser. I tillegg er den tidsmessige styring av over-eller under-ekspresjon i injiserte mus er langt mer nøyaktig enn i genetisk modifiserte mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereotaktisk injeksjon av en lentivirus er en relativt hurtig metode for in vivo-vurdering for både opp-eller ned-regulering av forskjellige gener og MiRNAs. Den viktigste alternativ er en genetisk utviklet mus som er et mye mer arbeidskrevende og tidkrevende teknikk deretter direkte lentivirus injeksjon. I tillegg oppregulering, i lentivirus injeksjon, skjer på et bestemt tidspunkt i voksen mus og inkluderer ikke noen mulighet for leakiness under utvikling, som er oftest slik i de genmanipulerte musene som …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien har vært støttet av Edmond og Lily Safra Center for Brain Sciences (SB fellesskap), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Program av Israel Science Foundation (Grant nr. 378/11, å HS) og den tyske israelske Stiftelsen for Industriell Forskning og utvikling (GIF) (Grant 1093-32.2/2010 Nei, til HS).
Materials
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment – Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer’s disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer’s disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
