Summary
MicroRNA har betydelige roller i hjernens struktur og funktion. Her beskriver vi en metode til at håndhæve hippocampus miRNA overekspression hjælp stereotaktisk injektion af en manipuleret miRNA-udtrykkende lentivirus. Denne fremgangsmåde kan fungere som en relativt hurtig måde at vurdere
Abstract
MicroRNAs (miRNA) er små regulatoriske enkeltstrengede RNA-molekyler omkring 22 nukleotider lange, der kan hver maalbestemt talrige mRNA-transkripter og dim en hel genekspression pathway ved at inducere ødelæggelse og / eller inhibere translation af disse mål. Flere miRNA spiller centrale roller i at opretholde neuronal struktur og funktion samt i højere niveau hjernefunktioner og metoder søges til at manipulere deres niveau for at udforske disse funktioner. Her præsenterer vi en direkte in vivo metode til at undersøge de kognitive konsekvenser af tvungne miRNA overskydende i mus ved stereotaktisk injektion af miRNA-kodning viruspartikler. Konkret den nuværende protokol indebærer injektion i hippocampus CA1 regionen, hvilket bidrager til pattedyr hukommelse konsolidering læring og stress reaktioner, og tilbyder en bekvem injektionsstedet. Koordinaterne måles efter musen bregma og virus perfusion er digitalt styret og holdt meget langsom.Efter injektion, er kirurgi såret forsegles og dyrene komme sig. Lentivirus koder lyddæmpere af de tilsvarende mRNA mål tjener at indblande den specifikke miRNA / target interaktion ansvarlig for den observerede effekt, med naive mus, mus injiceret med saltvand og mus injiceret med "tomme" lentivirusinfektioner vektorer som kontrolgruppe. En måned efter injektion, dyrene undersøgt i Morris Water Maze (MWM) til vurdering af deres navigation indlæring og hukommelse evner. Den MWM er en rund tank fyldt med farvet vand med en lille platform neddykket 1 cm under vandoverfladen. Steady visuelle referencer omkring tanken tillader rumlig navigation (lyd og jordens magnetfelt kan også hjælpe dyrene i at navigere). Video kamera overvågning muliggør måling af rute svømme og tid til at finde og beløbe platformen. Musen er først lært, at montere den skjulte platform tilbyder en flugt fra tvungen svømning, det er derefter testet for at bruge denne flugt og ftD KK, er platformen fjernes og probe test undersøger om musen husker sin tidligere placering. Gentagne tests over flere dage i træk fremhæve forbedret ydeevne af testede mus ved kortere ventetid til at finde og montere platformen, og som flere direkte ruter for at nå platformen eller dens placering. Manglende vise denne forbedring repræsenterer svækket indlæring og hukommelse og / eller angst, som derefter kan testes specifikt (fx i forhøjede pluslabyrint). Denne fremgangsmåde gør det muligt validering af specifikke miRNA og målrette udskrifter i den undersøgte kognitive og / eller stress-relaterede processer.
Introduction
Rollen af bestemte miRNA i nervesystemet fungerer er for nylig blevet udfordret af lentiviral injektion i flere studier. MiRNA har vist sig at være afgørende for at fastholde og re-forme synapse struktur 1, synaptogenesis 2 og synapse remodellering og vedligeholdelse 3.. Disse undersøgelser tyder på, at miRNA er involveret via multileveled regulerende virkninger i både udformningen op og i at opretholde den vigtigste resultat af nervesystemet, kognitive funktion. Stereotaktisk injektion af lentivirus partikler i specifikke områder i gnaverhjerne muliggør søgning efter ændringer i synapse morfologi og neuronal aktivitet, og blev brugt til oprettelse af funktionelle betydning overudtrykt udskrifter 4,5. Direkte smitte af neuroner på veldefinerede områder i hjernen med miRNA-udtrykkende lentivira kan være impliceret i undersøgelser af aldring, hjernesygdomme og neurodegeneration, Undersøgelser af miRNAs i realm af adfærdsregulering 6-8 er på et langt mindre fremskreden tilstand og stereotaktisk injektion af miRNA-udtrykkende lentivirusinfektioner partikler efterfulgt af adfærdsmæssige test kan være nyttige til sådanne formål. Et væsentligt mere arbejdskrævende metode til at inducere over-eller under-ekspression involverer gensplejsede knock-eller knockout mus. Genetiske systemer kan yderligere tillade betinget og tidsmæssig kontrol på ekspression (f.eks Cre-Lox, Tet systemer), men disse næppe tilbyde den rumlige specificitet injektionsproceduren, og der er næsten altid en vis mængde af utætheder. Desuden har de tekniske procedurer ikke kræver operation, og kan bruges på tværs laboratorier med relativ god reproducerbarhed, men de er langsommere og kræver langt mere arbejdskraft og økonomiske ressourcer. Desuden har den tidsmæssige styring af over-eller under-ekspression i injicerede mus er langt mere præcist i forhold til genetisk modificerede mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Lentivirus Forberedelse
- Grow HEK 293FT celler til 90% sammenflydning.
- På dagen for transfektion ændring cellemedium til serumfrit DMEM suppleret med 1 mM glutamin og 50 mg / ml penicillin-streptomycin.
- Co-transficere cellerne med en pLKO.1-Puro vektor og med plasmider der koder for delta R8.2 og VSV-G-dele og miRNA af interesse, ved anvendelse af 10 pi 1 mg / ml polyethylenimin som en bærer 9..
- Saml emballerede lentivira ved 24 timer og 48 timer efter transfektion, filtreres gennem 0,45 um filter.
- Koncentrere lentivira hjælp ultracentrifugering i 70.000 xg, i 2 timer og 15 ° C, alikvot og opbevares ved -70 ° C.
- Foranstaltning virustiter ved at inficere HEK 293T celler med seriefortyndede viruspræparater (1 til 10 -6 ml vektor per brønd). Den resulterende titer (mindst ~ 1 × 10 9 infektiøse partikler per ml anbefales) vurderes for ekspression af gene af interesse, ved hjælp af puromycin udvælgelse og ved at kvantificere GFP udtrykke virus gennem at tælle fluorescerende celler.
For mere detaljeret protokol lentivirus forberedelse: se 10..
2.. Forberedelse Dyr for Kirurgi
- Kirurger antræk bør omfatte kirurgisk kjole, sterile handsker, hætte og maske.
- Afvejes dyret, så bedøver det med en IP-injektion af en Ketamin blanding, med den steg proportionalt med dyrets vægt som angivet for hvert lægemiddel. For en Ketamin / Xylazin blanding er et dosisområde på 80-200 mg / kg Ketamin og 7-20 mg / kg xylazin normalt bruges til mus.
- Vent til dyret er helt bedøvet, og derefter kontrollere for manglende tilbagetrækning refleks i bagbenet af dyret ved at udvide lemmer og derefter trykke på det med fingeren.
- Sprøjt dyret subkutant med Rimadyl, som angivet på æsken, for smertelindring. Typisk dosisområde for Rymadil er 5-10 mg.
- Placer dyret på en varmepude til at holde en stabil kropstemperatur og fugte øjne med salve.
- Shave området mellem de to ører med en trimning maskine.
- Sanitize huden med betadin.
3.. Eksponering af Skull and Drilling
- Placer dyret inde i stereotact ved at justere stængerne i sprækkerne lige foran dyrets ører.
- Brug en skalpel til at foretage en anterior-posterior snit på omkring 1,5 cm mellem ørerne og holde den åben med kirurgi klemmerne (serfines).
- Rengør overfladen af kraniet med en vatpind, indtil skæringspunktet mellem den koronale sutur og sagittale suturer, dvs bregma og skæringspunktet mellem den koronale og lambdoid suturer, dvs lambda, er synlige.
- Ret spidsen af sprøjten, indehaves af stereotact til den bregma point på alle tre akser. Skriv ned koordinaterne. Dette punkt vil blive betragtet som nul point i alle tre akser.
- Løft sprøjten i den lodrette akse, således at en plan bevægelse ville ikke ridse kraniet og flytte sprøjten hoved til den korrekte placering. Hippocampus CA1 injektioner kræver følgende koordinater i forhold til bregma i mm: -2 på det forreste / bageste akse, ± 1,8 i det laterale / mediale akse og -1.5 på dorsale / ventrale akse.
- Sænk spidsen af sprøjten, indtil den rører kraniet og markere stedet med en markør. Fjern sprøjten tilbage for at undgå stikkende.
- Bor en lavvandet hul, kun i kraniet med en fin driller. Hold driller konstant, så det ville ikke fortsætte med at bore i det bløde væv nedenunder. Du kan forhindre dette ved støttehjul ene hånd med den anden, og ved at bore i korte pulser.
4.. Injektion af lentivirus
- Udtag 0,5 ml af den koncentrerede lentivirus opløsning.
- Anbring sprøjten over hullet, og langsomt sænke den lodret, indtil det REAches overfladen af kraniet. Fortsæt med at sænke sprøjten ind i hjernen meget langsomt. På dette trin nogen blødning kan forekomme som ikke nødvendigvis angiver en mislykket penetration. Hvis der opstår blødning tørre det op med en vatpind.
- Indstil det digitale pumpe til 0,02 ml / min (0,5 pi ville blive injiceret i 25 min) og begynde infusionen. Langsom infusion muliggør effektiv spredning af virus i vævet og forhindrer tilbagestrømning. I nogle sprøjte typer overveje at indsætte sprøjten for en ekstra dybde på 0,5 mm før tilbagetog til originale koordinater og infusion.
- Efter infusionen er færdig afvente yderligere 5 minutter for at tillade materialet at spredes i hjernen i stedet for tilbagetog tilbage i kanalen dannet af sprøjten.
- Fjern sprøjten meget langsomt og se efter back strømme. Hvis en tilbagestrømning er observeret ved dette trin, blev en del af det injicerede materiale sandsynligvis tabt.
5.. Sårluknings and Recovery
- Seal the viklet med histoacryl. Vær sikker på at undgå lækage af histoacryl i øjnene.
- Injicere dyret intraperitonealt (IP) med 1 ml forvarmet saltvand, for at undgå dehydrering.
- Placer dyret i et opsving bur, der er placeret på en opvarmet pude. Se dyret mens det genindvinder i yderligere en time.
I tilfælde af vægttab, appetitløshed, bør svaghed / manglende evne til at skaffe foder eller vand, døende tilstand eller infektion, aflivning af dyret skal udføres. Acceptable metoder til aflivning af gnavere er barbiturater, inhalant bedøvelsesmidler, CO 2, CO, eller kaliumchlorid i forbindelse med generel anæstesi.
Efter 4 til 6 uger, vurderer dyrets navigation hukommelse er vurderet i Morris Water Maze. Lentivirus vil normalt inficere de fleste celler inden injektionen sfære.
6.. Behavioral Assessment i Morris Water Maze
- Træn dyrene i Morris Water Maze. For præcis træning og test-protokol se 11. Efter hvert forsøg, tørre dyret med et tørt håndklæde, læg det tilbage i sit bur og opfriske vandet i tanken.
- Test dyrene i Morris Water Maze 3 dage i træk, 4 forsøg hver dag. Hver dag indsætte dyret ind i labyrinten i hver af de 4 retninger af labyrinten (nord, syd, øst og vest) i et skiftende rækkefølge, f.eks dag: Øst-Vest-nord-syd-, dag to: Vest-Syd -nordøst. Tør dyr efter hvert forsøg.
- Under testen forsøg spore dyret med et tracking system som Noldus tracking system.
- Efter 12 th test forsøg, indsætte dyret i vandbeholderen uden platform for et minut. Dette ville blive brugt til at analysere den søgende strategi dyret tager.
- Analysere data som foreslået i 12..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Injektion af 0,5 pi lentivirus i CA1-regionen i muse-hippocampus, med strømningshastigheden anført i protokollen sektion giver en inficeret sfære på omkring 1 mm i rostralt-caudale akse, og omkring 0,5 mm i den mediale-laterale og anterior -posterior akser (figur 3).
Figur 1. Bregma punkt og injektionsapparatet. (A) Vist er et skematisk kort over Bregma (koronale og sagittale suturer vejkryds) og lambda (Lambdoid og sagittale suturer vejkryds) som ses efter udførelse af snittet. (B) billede illustrerer de vigtigste mekaniske komponenter i stereotaktisk apparat.
Figur 2. Lentivirus principal komponenter. lentivirus omfatter komponenter, der aktiverer resistens over for antibiotika (Ampiciline, AmpR), et reportergen (GFP), 5 'og 3' lange terminale gentagelser (LTR) for effektiv integration og ekspression af virus og genet af interesse (miRNA).
Figur 3. Injektionsstedet og in vivo Lentivirus transfektion. (A) ved injektionsstedet efter musen atlas. Injektion er rettet til CA1-regionen af hippocampus. (B) GFP kvantificering i arbitrære enheder (normaliseret mål for mængden af "grøn" set i hvert felt) langs 11 skiver, hver 40 um tyk, i rostral-caudale akse. (C, d, e og f). Specifikke områder for de positioner, der er markeret pågrafen i b.. DAPI farvning i rød og GFP i grønt. Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Adfærdsmæssige vurdering af mus i MWM. (A) Mean latenstid at finde den skjulte platform for mus injiceret med lentivirus udtrykker en specifik miRNA (betegnet miR-X i figuren, røde cirkler, n = 10) og mus injiceret med scramble udtrykker lentivirus (grønne trekanter, n = 10). Fejlsøjler repræsenterer SEM. ANOVA P-værdi <0,05. (B) Repræsentative baner den sidste retssag for de to grupper. (C) Gennemsnitlig afstand i 30 min på åben mark for mus injiceret med miR udtrykker testet lentivirus (grøn), scramble udtrykker lentivirus (rød) og un-injicerede dyr (blå). Ingen forskel i den globale bevægelse aktivitet blev identificeret (ANOVA P> 0,1). (D) Repræsentative baner af mus fra hver gruppe i (c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereotaktisk injektion af en lentivirus er en relativt hurtig metode til in vivo vurdering af både op-eller ned-regulering af de forskellige gener og miRNA. Det vigtigste alternativ er en gensplejset mus, der er en meget mere omstændelig og tidskrævende teknik, så direkte lentivirus indsprøjtning. Desuden, den opregulering i lentivirus injektion, sker på et bestemt tidspunkt i den voksne mus og omfatter ikke nogen mulighed for utætheder under udvikling, da det oftest er tilfældet i gensplejsede mus, der indeholder tidsmæssige styring. Komplet tidsmæssig kontrol er afgørende, når man vurderer relevansen af forskellige gener i neurodegenerative sygdomme, hvor den ændrede regulering sker sent i livet af dyret. Derudover lentivirus indsprøjtning giver præcis rumlig kontrol, som, igen, er behæftet med en vis mængde af utætheder i de gensplejsede systemer. Musens tekniske systemer udnytter endogenous specificitet af forskellige transkriptionsfaktorer ved tilsætning af en indsats af en specifik promotor, der ville kun blive aktiveret i en bestemt region eller celletype. Til sammenligning kan lentivirus injektioner begrænses i rummet uden at ændre vektoren. Ulemperne ved lentivirus injektion er kravet om en møjsommelig kirurgiske indgreb og tvivlsomme reproducerbarhed mellem laboratorier. Efter injektionen kirurgi, skal en periode mellem en uge og tre uger passere for at virus kan inducere dets virkning, og for dyret at komme sig, før yderligere protokoller kan udføres såsom adfærdsmæssige og biokemiske vurderinger. I undersøgelser, hvor tidspunktet for induktion bør være i tæt nærhed til de forskellige vurderinger den injicerede lentivirus kan omfatte en tidsmæssig kontrolsystem, såsom Cre-Lox-systemet, og antibiotika kan anvendes i et sådant tilfælde som induceren længe efter dyr helt restituerede. Denne teknik blev fremlagt i 13.. Vedrørende Reproducibility mellem injektionerne, har grupper, der udfører denne metode rutinemæssigt viste en temmelig reproducerbar målretning og levering af injicerede materiale mellem dyr 13.. Reproducerbarhed mellem laboratorier er et spørgsmål, der kræver stor omhu, da forskellige laboratorier anvender forskellige sprøjter forskellige typer sprøjte kant (stump eller skarp), og forskellige flowhastigheder, som påvirker den resulterende indsprøjtning sfære. I begge metoder en positionel virkning grundet genomisk integration websted kan forekomme. I den transgene linje konsekvensen ville være gendæmpning i hele linjen. I lentivirus injiceret befolkning, på den anden side ville virkningen være begrænset til en lille delmængde af populationen. Ved at kombinere miR eksperimenter sammen med shRNA eksperimenter in vivo kan belyse specificitet af effekten af en bestemt miR på sit mål 6,8. Endelig kan lentivirus injektion anvendes i en transgen knockdown musen til afprøvning af en knock-in effekt i en speic område af hjernen og tjener til et tab af funktion / redning af funktions eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse er blevet støttet af Edmond og Lily Safra Center for Brain Sciences (SB stipendium), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Program for Israel Science Foundation (Grant No 378/11, til HS) og den tyske israelske Foundation for Scientific Forskning og Udvikling (GIF) (Grant No 1093-32.2/2010 til HS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 | |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment - Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 | |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J.
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
