Summary

Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral

Published: June 10, 2013
doi:

Summary

MicroRNAs têm papéis importantes na estrutura e função cerebral. Aqui nós descrevemos um método para impor miRNA hipocampo sobre-expressão usando a injeção estereotáxica de um lentivírus miRNA-expressando engenharia. Esta abordagem pode servir como um modo relativamente rápido para avaliar a<em> In vivo</em> Efeitos de miRNAs sobre-expressos em regiões específicas do cérebro.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA de fita simples reguladoras pequenas cerca de 22 nucleotídeos de comprimento que podem cada alvo numerosas transcrições de mRNA e dim todo um gene de expressão da via pela destruição indução e / ou inibindo a tradução destes objectivos. Vários miRNAs desempenham papéis fundamentais na manutenção da estrutura e função neuronal e nas funções cerebrais de nível superior, e os métodos são procurados para manipular os seus níveis para explorar essas funções. Aqui, apresentamos uma relação direta método in vivo para examinar as consequências cognitivas de miRNAs aplicadas em excesso em ratos por injeção estereotáxica de partículas virais miRNA-codificação. Especificamente, o protocolo atual envolve a injeção na região CA1 do hipocampo, que contribui para a consolidação de mamíferos memória, aprendizagem, e as respostas ao estresse, e oferece um local de injeção conveniente. As coordenadas são medidas de acordo com a bregma rato e perfusão vírus é controlado digitalmente e mantido muito lento.Após a injecção, a ferida é selada a cirurgia e os animais recuperar. Lentivírus codificação silenciadores dos alvos de RNAm correspondentes servem para envolver a interação miRNA / target específico responsável pelo efeito observado, com camundongos normais, os camundongos injetados com solução salina e camundongos injetados com vetores lentivírus "vazios" como controles. Um mês após a injeção, os animais são examinados no labirinto aquático de Morris (MWM) para avaliar a sua aprendizagem de navegação e capacidades de memória. A MWM é um tanque redondo preenchido com água colorida com uma pequena plataforma submersa um centímetro abaixo da superfície da água. Estímulos visuais constantes ao redor do tanque permitem navegação espacial (som e do campo magnético da Terra pode também ajudar os animais a navegar). Monitoramento de câmeras de vídeo permite medir a rota de mergulho e o tempo para encontrar e atingir a plataforma. O mouse é ensinado pela primeira vez que a montagem da plataforma escondida oferece uma fuga da natação forçada, que é então testado para a utilização deste fuga e finalmente, a plataforma é removida e testes com sondas de examinar se o rato lembra sua localização anterior. Testes repetidos ao longo de vários dias consecutivos destacar melhorou o desempenho de ratinhos testados em menores latências para encontrar e montar a plataforma, e as vias mais directos como para alcançar a plataforma ou a sua localização. Fracasso para mostrar essa melhoria representa aprendizagem e memória prejudicada e / ou ansiedade, que pode então ser testada especificamente (por exemplo, no labirinto em cruz elevado). Esta abordagem permite a validação dos miRNAs específicos e transcrições alvo nos processos relacionados ao estresse cognitivo e / ou estudado.

Introduction

O papel dos miRNAs particulares em funcionamento do sistema nervoso foi recentemente desafiado por injeção lentiviral em vários estudos. MiRNAs foram encontrados para ser crucial para a manutenção e re-moldar uma estrutura sinapse, sinaptogênese 2 e remodelação sinapse e manutenção 3. Estes estudos sugerem fortemente que miRNAs estão envolvidos, através de efeitos de regulação de vários níveis, tanto na formação e na manutenção da saída principal do sistema nervoso, a função cognitiva. Injeção estereotáxica de partículas lentivírus em regiões específicas no cérebro de roedores permite à procura de alterações na morfologia sinapse e atividade neuronal, e foi usado para estabelecer o significado funcional de transcritos sobre-expressos 4,5. Infecção direta de neurônios em áreas do cérebro bem definidas com miRNA-expressando lentivírus podem estar envolvidos em estudos de envelhecimento, distúrbios cerebrais e neurodegeneração; Estudos de miRNAs no campo da regulação comportamental 6-8 estão em um estado muito menos avançada, e injeção estereotáxica de miRNA-expressando partículas lentivírus seguidos por testes comportamentais podem ser úteis para tais fins. Um método muito mais trabalhoso para induzir sobre ou sub-expressão envolve a engenharia genética knock-in ou camundongos knockout. Sistemas genéticos podem ainda permitir o controlo condicional e temporal sobre a expressão (por exemplo, Cre-Lox, sistemas Tet), mas estes dificilmente oferecem a especificidade espacial do procedimento de injecção e existe quase sempre uma certa quantidade de fugas. Além disso, os procedimentos de engenharia não necessitam de cirurgia e pode ser usado em laboratórios com relativamente boa reprodutibilidade, no entanto, são lentos e exigem muito mais recursos humanos e financeiros. Além disso, o controlo temporal da sub-expressão em ratinhos injectados sobre ou é muito mais preciso em comparação com ratinhos geneticamente modificados.

Protocol

1. Preparação lentivírus Cultivar células HEK-293FT a 90% de confluência. No dia da transfecção meio celular alteração DMEM isento de soro suplementado com glutamina 1 mM e 50 mg / ml de penicilina-estreptomicina. Co-transfectar as células com um vector pLKO.1-Puro e com plasmídeos que codificam para o delta R8.2 e VSV-G e radicais da miRNA de interesse, utilizando 10 ul de 1 mg / mL de polietilenimina como um transportador 9. Recolhe lentivírus embalados ?…

Representative Results

A injecção de 0,5 ml no lentivírus região CA1 do hipocampo do rato, com a taxa de fluxo indicado na secção do protocolo produz uma esfera infectada de cerca de 1 mm no eixo rostral-caudal, e cerca de 0,5 mm, no médio-lateral e a anterior eixos-posterior (Figura 3). Figura 1. Ponto bregma e aparelhos de injeção. (A) É mostrado um mapa esquem…

Discussion

Injeção estereotáxica de um lentivírus é um método relativamente rápido para a avaliação in vivo, tanto para down-regulação de diferentes genes e miRNAs cima ou. A principal alternativa é um rato geneticamente modificado que é uma técnica consome muito mais trabalhoso e demorado, em seguida, a injeção direta lentivírus. Além disso, a regulação para cima, na injecção de lentivírus, ocorre a um tempo específico no ratinho adulto e não inclui qualquer possibilidade de permeabilidade durant…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado pelo Edmond e Lily Safra Center for Brain Sciences (SB comunhão), The Legacy Heritage Ciências Biomédicas Programa de Parceria da Fundação Israel Science (Grant No. 378/11, a HS) e da Fundação Alemã de Israel for Scientific Pesquisa e Desenvolvimento (GIF) (Grant No. 1093-32.2/2010, a HS).

Materials

Equipment
Rodent weigh scale Burtons (UK) 115-455  
heating pad FIRstTechnology DCT-25  
trimming machine Stoelting 51465  
stereotact Stoelting 51730  
Scalpel and blades Kent scientific INS500348  
Harland syringe Hamilton 7632-01  
driller Stoelting 51449  
digital pump Harvard apparatus 704507  
Water tank and platform Stoelting 60135  
Reagents
ketamine Vetoquinol(Lure France) 3055503  
domitor Orion pharma 107140-10  
Rimadyl Pfizer animal health 24751  
moisture ointment – Synthomycine 5% Rekah Pharmaceutical 195
histoacryl Braun 112101  
saline Sigma Aldrich D8662  

References

  1. Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
  2. Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
  3. Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
  4. Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
  5. Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
  6. Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer’s disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
  7. Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
  8. Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
  9. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
  10. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
  11. Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
  12. Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer’s disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
  13. Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).

Play Video

Cite This Article
Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J. Vis. Exp. (76), e50170, doi:10.3791/50170 (2013).

View Video