Стереотаксической инъекции микроРНК-экспрессирующих Lentiviruses в области CA1 гиппокампа мыши и оценка поведенческих результатов
Summary
MicroRNAs играть значительную роль в структуре и функции мозга. Здесь мы опишем метод для обеспечения гиппокампа микроРНК сверхэкспрессию использованием стереотаксической инъекции инженерных микроРНК-экспрессирующих лентивирус. Этот подход может служить относительно быстрым способом оценки<em> В естественных условиях</em> Эффекты сверхэкспрессированные микроРНК в определенных областях мозга.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with naïve mice, mice injected with saline and mice injected with “empty” lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth’s magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.
Introduction
Роль микроРНК в частности функционирования нервной системы недавно было оспорено лентивирусный инъекций в нескольких исследованиях. MiRNAs было установлено, что важно для поддержания и повторное формирование синапсов структуры 1, 2 синаптогенез и реконструкции синапсов и техническое обслуживание 3. Эти исследования убедительно показывают, что микроРНК занимаются, через многоуровневую регуляторных эффектов как в формировании и поддержании в основном выходе нервной системы, когнитивные функции. Стереотаксической инъекции лентивирус частиц в конкретных регионах в мозге грызунов позволяет поисках изменений в морфологии и синапсов нейронной активности, и был использован для создания функционального значения сверхэкспрессированные стенограммы 4,5. Прямая инфекции нейронов, находящихся в четко определенных областях мозга с микроРНК-экспрессирующих лентивирусы могут быть причастны исследования старения, заболеваний мозга и нейродегенеративные; исследований микроРНКы в области поведенческой регуляции 6-8 находятся на гораздо менее развитые государства, и стереотаксической инъекции микроРНК-экспрессирующих лентивирус частиц последующим поведенческие тесты могут использоваться для таких целей. Значительно более трудоемкий способ индукции избыточного или недостаточного-выражение содержит генетически модифицированные нок-ин или нокаут мышей. Генетические системы может дополнительно позволить условный и временной контроль экспрессии (например Cre-Lox, Tet системы), но они вряд ли предлагать пространственной специфичности процедуры инъекции и почти всегда имеется определенное количество неплотности. Кроме того, инженерные процедуры не требуют хирургического вмешательства и может использоваться во всех лабораторий с относительно хорошей воспроизводимости, но они медленнее и требуют гораздо больше трудовых и финансовых ресурсов. Кроме того, временной контроль избыточного или недостаточного-выражение в вводили мышам является гораздо более точным по сравнению с генетически модифицированных мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стереотаксической инъекции лентивирус является относительно быстрый метод для прижизненного оценивать как вверх или вниз-регулирование различных генов и микроРНК. Основной альтернативой является генетически модифицированные мыши, который является намного более длительными и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Эдмонда и Лили Сафра Центр Brain Sciences (SB общение), наследие Наследие биомедицинских наук Программы партнерства Израиля научного фонда (грант № 378/11, с ГС) и немецкого израильского фонда научно Исследования и разработки (GIF) (грант № 1093-32.2/2010, чтобы HS).
Materials
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment – Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer’s disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer’s disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
