Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב Published: March 30, 2013 doi: 10.3791/50180

Summary

אנו מציגים שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות חזקות ללימוד

Abstract

נמטודות ג elegans התפתח כמודל חשוב ללימוד מסלולים הגנטיים המשתמרים ויסות חילוף חומרים של שומן שהיא מתייחסת להשמנה אנושית ופתולוגיות הקשורים אליו. כמה מתודולוגיות קודמות פתחו להדמיה של ג מאגרי שומן הטריגליצרידים עשירי elegans הוכיחו להיות מוטעה, הדגשת תאים סלולריים אחרים מאשר טיפי שומנים. שיטות אחרות דורשות ציוד מיוחד, הן זמן רב, או להניב תוצאות לא עקביות. אנחנו מציגים את שיטה מהירה, לשחזור, מקבע מבוססת הנילוס אדום מכתימה לאיתור המדויק ומהיר של טיפי שומנים ניטראליות בג elegans. צעד קיבוע קצר ב40% isopropanol עושה חיות לחלוטין חדירות הנילוס אדום, אשר לאחר מכן משמש לכתם בעלי חיים. תכונות ספקטרליות של צבע lipophilic זה לאפשר לו לזרוח חזק ובררני, בספקטרום צהוב הירוק רק כאשר בסביבת שומנים עשירה, אך לא יותרסביבות קוטב. לפיכך, טיפי שומנים ניתן דמיינו במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד ביכולת הדמית GFP פשוט לאחר רק צעד קצר הנילוס אדום מכתים בisopropanol. מהירות, המחיר סביר, והשחזור של פרוטוקול זה להפוך אותו אידיאלי למסכי תפוקה גבוהות. אנחנו גם להדגים שיטה מותאמת לקביעה הביוכימית של טריגליצרידים ופוספוליפידים באמצעות גז כרומטוגרפיה המוני ספקטרומטריית. פרוטוקול קפדני יותר זה אמור לשמש כאישור לתוצאות המתקבלות מנחישות השומנים המיקרוסקופיות הנילוס האדום. אנו צופים כי הטכניקות הללו יהפכו לסטנדרטים חדשים בתחום ג מחקר מטבולי elegans.

Introduction

שימור של מסלולים מטבוליים בין בני אדם ואת elegans Caenorhabditis נמטודות הופך אותו אורגניזם מודל רב עצמה לחקר השמנה. בעוד ג elegans אין לי adipocytes הייעודי לאחסון שומן כמו ביונקים, שהם עושים חנות טריגליצרידים בטיפי שומני 1 ויש רבים מאותם רגולטורים של אחסון שומן ושימוש באנרגיה 2,3. לבדיקה לרמות שומן בג elegans, מספר שיטות הוצעו עם רמות שונות של נוחות והצלחה. השימוש פעם המשותפת של צבעי ניאון, חיוניים 4-7 נקרא לאחרונה לשאלה, וריאגנטים אלה הוכיחו שמכתימים תא נפרד ממחסן אחסון השומן העיקרי של ג elegans 1,8-11. צבעים מקבעים מבוססים שאינם ניאון, כגון סודאן השחורה ושמן האדום O, תוך הדגשה מוצלחת בטיפי שומנים בתולעת 12-14, אין להם כגדול טווח דינמי כדי לכמת כנורותסנאט צבעים 8,13,15. יתר על כן, שיטות נוכחיות של קיבעון לצבעי ניאון והן הלא ניאון הן זמן רבים וכרוכות בשלבים מרובים, הפשרה להקפיא ו / או שימוש בכימיקלים רעילים 1,9,10. השימוש באנלוגים שומנים BODIPY כותרת ספציפיים שדווח להדגשת טיפי שומנים כאשר מאכילים את התולעים חיים עם תיוג לטווח קצר 15. עם זאת, מסתמך על ספיגה של הצבע ולכן הוא מוטה על ידי ג טיפול elegans ומטבוליזם של חומצות שומן אנלוגים BODIPY. חלופה הוקמה על צבעי שומני צביעה היא תווית חינם פיזור, קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS) או פיזור ראמאן מגורה (SRS) מיקרוסקופי, המנצל את תכונות הרטט האופייניות של מולקולות שומנים לדמיין מאגרי שומן 10,16, 17. עם זאת, ציוד מיוחד יקר הוא הכרחי לשיטה זו, והתפוקה נמוכה במקרה הטוב.

כדי למלא את הצורך בanaly מהיר, מדרגיםאחות של חנויות שומנים ניטראליות בג מחקר מטבולי elegans, אנחנו מציגים את רומן, שיטה לשעתק מאוד של שומנים בדם מכתים מקבע מבוסס הנילוס האדום. תכונות ספקטרליות וphysicochemical של הצבע האדום הנילוס lipophilic לגרום משמרת צהובה זהב רפאים בשיאו עירור של הפליטה, שמאפשרים לו לזרוח בספקטרום הפליטה הירוק רק כאשר בסביבת שומנים עשירה, אך לא בסביבות קוטב יותר 18 , 19. כך טיפי שומנים יכולות להתגלות לאחר צביעה פשוטה על ידי השימוש בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מסנן נקבע למיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההקלות והנגישות של טכניקה זו להפוך אותו אידיאלית למסכי תפוקה גבוהות. אנחנו גם להדגים שיטה לזווג, קפדנית לקביעה הביוכימית של טריגליצרידים ופוספוליפידים באמצעות מיצוי שלב מוצק וספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה המונית. מדידת שומנים ביוכימית בקורלציה עם נחישות מיקרוסקופית הנילוס האדום מבוסס של ג elegans faמסה לא, ואמורה לשמש כאישור לממצאים שנעשו בנחישות שומנים מיקרוסקופיות.

Protocol

1. הכנה מלבני מגבר / ט (/ T) צלחות אגרו LB וצלחות NGM IPTG RNAi

A צלחות / T צריכות להיות מוכנות לפני 1-4 שבועות לשימוש ומאוחסן בחושך ב 4 ° C.

  1. עבור 1 ליטר של מדיה להוסיף מי 1 ליטר deionized, אגר 32 גרם LB, 1.5 מ"ל 2 M NaOH, ואגר 2 גרם Bacto. חיטוי 40 דקות במחזור נוזלי. לאחר הקירור עד 60 מעלות צלזיוס, להוסיף 3 מ"ל וטטרציקלין המ"ל אמפיצילין 0.5. יוצק 45 מ"ל של תקשורת לכל צלחת.

הכן גם צלחות 96-RNAi 3 ימים עד 2 שבועות מראש.

  1. לשפוך 25 צלחות RNAi 96-כן, להכין 1 ליטר של נמטודות צמיחת התקשורת (NGM): 1 ליטר מי deionized, 3 גרם NaCl, 17 גרם agarose, וbactopeptone 2.5 גרם. מחזור נוזל חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות עם בר ומערבבים. בואו מגניב, בחישה בסט צלחת חמה עד 60 מעלות צלזיוס
  2. כאשר קריר עד 60 מעלות צלזיוס, להוסיף את פתרוני המניות הבאים: 1 מ"ל 1 ז MgSO 4, 5 מיליליטר כולסטרול 1 מ"ג / מ"ל, 25 מ"ל 1 ז KH 2 4 (pH 6.0), 1 מ"ל 1 ז CaCl 2, 1 המ"ל 200 מ"ג / המ"ל carbenicillin, ו5 המ"ל M IPTG 1 (ראה טבלת חומרים למתכונים).
  3. לוותר 150 μl של RNAi תקשורת לכל אחד גם מצלחת השטוחה תחתית 96-גם באמצעות pipettor רב אלקטרוני. הימנע מבועות אוויר. שמור על תקשורת בקיבול נירוסטה סטרילית שקוע באמבטית 60 ° C מים תוך מחלק.
  4. שמור על רמת RNAi צלחות עד agarose מתמצק. צלחות אפשר לשפוך עד 2 שבועות מראש ומאוחסנות ב 4 ° C.

יום 1

2. חותם צלחות ספרייה קפואות על מלבן מגבר / ט (/ T) צלחות אגר LB

  1. לחמם צלחות / T לטמפרטורת חדר, לשמור אותם בחושך.
  2. צלחות העברה 96-RNAi גם ספרייה מ-80 ° C לייבוש קרח. פתח את צלחת אלומיניום האטומה ליד המבער בונזן.
  3. לעקר משכפל 96-pin ידי טבילת סיכות סדרתי (10 שניות כל אחד) באקונומיקת 10%, deionized H 2 O, ו-E 70%טוויתי אחרי שעבר סיכות מבעד ללהבה. חזור על צעד EtOH ולהבה.
  4. החל משכפל למניית גליצרול קפוא 96-RNAi היטב, כדי לוודא התקשרות של כל פינים את פני השטח של כל באר.
  5. חותם על צלחת / T, ציור עיגול קטן עם כל סיכה בלי משטח אגר מזיק.
  6. Re-חותמת וספריית תשואת צלחות ל -80 ° C. דגירה רקעה בצלחות / T על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה להתפתחות חיידקים.

יום 2

3. לגדול משובטים חיידקיים RNAi לינה בלוקים עמוקים גם

  1. להסיר צלחות / T בין 37 ° C ולאשר את התפתחות חיידקים.
  2. ממלא כל היטב של בלוק 96-באר עמוקה היטב עם 1.5 מ"ל של LB עם 200 מיקרוגרם / המ"ל carbenicillin.
  3. לעקר 96-pin משכפל (ראה שלב 2.3).
  4. החל משכפל לראש הצלחת / T, הכנת סיכות בטוחות ליצור קשר אחד עם שיבוט RNAi חיידקים. הרם משכפל וסיכות לטבול לתוך הגוש עמוק היטב. מערבולת, ולהסיר לאט, עושה certain לא לזהם בארות סמוכות.
  5. לאטום בלוק עם סרט לנשום-קל. דגירת הלילה בשעת 37 ° C עם תסיסה (950 סל"ד בMT Infors Microtiteron השני שאכר, המועדף, או 250 סל"ד ב25 מ"מ-לזרוק חממה רועדת).

יום 3

4. משובטים חיידקיים זרעי RNAi על צלחות 96-NGM גם RNAi

  1. הסר צלחות 96-RNAi גם מ4 מעלות צלזיוס וחמה לטמפרטורת חדר.
  2. להסיר מחסומים עמוקים וגם חובצה את 10 דקות ב 4000 x גרם.
  3. מהירות להפוך בלוקים לתוך כיור לניקוז תקשורת, ולהחתים הפוך על מגבת נייר כדי לחסל תקשורת העודפת.
  4. מתחת לברדס זרימה למינרית, להוסיף 40 μl של LB עם 200 מיקרוגרם / המ"ל carbenicillin לכל באר וחותם עם סרט סטרילי.
  5. לחזור בלוקים לטמפרטורת חדר ייקר חיידקים למשך 10 דקות לresuspend כדורים, או באופן ידני על ידי pipetting resuspend כדורים הזהירים.
  6. במכסת מנוע הזרימה למינרית, להסיר סרט סטרילי וחיידקים מהעברה עמוקהלוקים גם על צלחות RNAi 96-כן. הוסף 40 μl של חיידקי resuspended לשורות '' ו 'H', ו 35 μl מכל השורות האחרות. יותר נוזלים מתווספים לבארות קצה של צלחת 96-RNAi היטב כדי למנוע overdrying ופיצוח של agarose.
  7. תשאיר את הצלחות שנחשפו לייבוש במכסת מנוע ל4-6 שעות, בודק באופן קבוע ליובש. חיידקים יבשים מופיעים ברורים, לא מעונן. כיסוי, להפוך צלחות ודגירה בטמפרטורת חדר למשך הלילה.

5. הכן אוכלוסייה סינכרוני של תולעים

שתי צלחות 10 סנטימטר מלאה בתולעים הרה רבים משמשים להכנת ביצה לכל 6 צלחות RNAi 96-כן. הקפד תולעים שאינם מורעבים לפחות שני דורות (7 ימים).

  1. הכן אוכלוסייה סינכרוני של L1 כפי שתואר קודם לכן 20. עבור 20 מ"ל של תמיסת כלור, השתמש אקונומיקת 4 מ"ל, 1 המ"ל NaOH (10 מ '), 5 מ"ל deionized H 2 O, ו10 מ"ל M9 חיץ.
  2. סנכרן תולעי לילה ב10 המ"ל M9 ב15 מ"ל סטריליצינור פוליפרופילן עם סיבוב בשעת 20 ° C.

יום 4

6. הוסף ורמס לצלחות RNAi

  1. צנטריפוגה preps ביצה ב3000 XG לדקות 1. לשאוב supernatant, להתרחק הגלולה של L1 גוזלים. Resuspend במאגר 5 מ"ל M9 עם 0.0005% טריטון X-100. תוספת של הכמות הקטנה של חומר ניקוי מונעת תולעים יידבקו לפיפטה ואין כל השפעה על כתמי שומן.
  2. ספירת תולעים מתחת למיקרוסקופ. אם יש צורך, להתאים את הריכוז כדי 10-15 תולעים לכל microliter.
  3. במכסת מנוע הזרימה למינרית, לכל צלחת 96 היטב שנזרע, להוסיף 75 μl של תולעי resuspended לכל באר משורה אחת של אבן assay רדוד היטב. באמצעות פיפטה רב ידנית, להוסיף 50-75 תולעים ב5 μl לכל אחד גם מצלחות RNAi 96-כן.
  4. אפשר צלחות לייבוש במכסת המנוע למשך 30 עד 60 דקות. כאשר יבש, תחת מיקרוסקופ, תולעים צריכים להיראות זחילה, לא להשתולל.
  5. לגדול תולעים על צלחות RNAiב 20 מעלות צלזיוס במשך 64 שעות ~.

יום 7

7. לתקן וורמס בכתם אדום הנילוס

  1. הסר צלחות RNAi מחממה. בדוק תחת מיקרוסקופ ולהקליט מורעבים או חבטות (רטוב) בארות להרחיק מן ניתוח נוסף, כתנאים אלה משפיעים על מסת שומן.
  2. שימוש חוזר pipettor אלקטרוני, להוסיף 150 PBS μl עם 0.01% Triton X-100 לכל אחד גם מצלחת RNAi. עם pipettor, לערבב ידניים רבים ערוצית ונוזל העברה עם תולעים לשורה המתאימה בצלחת 96-PCR עמוק היטב. למנוע שיבוש אגר. חזור לסך של 300 תולעי μl בPBS לטוב.
  3. כאשר צלחות 4 הועברו, סרכזת צלחות ב 500 סל"ד לדקות 1.
  4. לשאוב supernatant באמצעות aspirator ואקום 96-pin, עוזב ~ נוזל 25 μl ותולעת גלולה בתחתית הבאר.
  5. הוסף 150 μl של 40% לכל isopropanol גם לתקן את בעלי חיים. ודא כי pipettor היא במהירות גבוהה מספיק כדי לערבב תולעתגלולה עם 40% isopropanol. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות.
  6. צלחות צנטריפוגות נחשפו ב500 סל"ד לדקות 1.
  7. לשאוב supernatant באמצעות aspirator 96-pin או באופן ידני, ומשאיר רק 25 μl 40% isopropanol + תולעת גלולה בתחתית הבאר.
  8. לכל אחד יפה, מוסיף 150 μl של פתרון מכתים אדום הנילוס הוכן מייד לפני שימוש: 6 פתרון μl הנילוס האדום המלאי של 0.5 מ"ג / מ"ל ​​באצטון לכל 1 מ"ל של 40% isopropanol.
  9. צלחת חותם עם סרט דבק שאינם סטרילית וכתם הכהה בלפחות 2 שעות.

8. תולעי שטיפה ותמונה במיקרוסקופ תפוקה גבוהה

  1. צנטריפוגה ב 500 סל"ד ל1 דקות ולשאוב כל אך 25 μl של הנילוס האדום לצבוע.
  2. הוסף 150 μl של PBS עם 0.01% Triton X-100 לכל באר וחנות בחושך במשך לפחות 30 דקות.
  3. צנטריפוגה ב 500 סל"ד לדקות 1.
  4. שימוש pipettor 12-ערוץ, חיות לשאוב מתחתיתו של כל אחד עם x מהיר 2 7 μl שבץ ולוותר על 96-גם שקופיות זכוכית טפלון מודפס. בזהירות, מבלי להסיר את התולעים, הסר 9.5 μl של PBS מכל באר של שקופית. אם שקופית הזכוכית שלך אינה מתאימה ישירות בהר המיקרוסקופ שלך, מחזיק שקופיות אלומיניום תעשייתי מותאם אישית חייב לשמש לעלות תולעים.
  5. שקופית כיסוי לאט נמוכה על גבי שקופית 96 היטב. שלב זה עשוי לקחת חלק באימון, כדי למנוע בועות או חצייה של תולעים לתוך בארות אחרות. פינות מאובטחות עם טקטיקת דבק.
  6. שקופית תמונה בשדה ופלואורסצנטי בהיר עם GFP / FITC מסנן להגדיר במיקרוסקופ אוטומטי. את אותות photobleaches השומנים בקלות ולכן הוא צריך להיות צלם באופן שיטתי בכל הבארות, ולא באופן ידני, כphotobleaching יוביל להבדלים מלאכותיים בין הבארות. לפרטים נוספים על ניתוח, אנא ראה תוצאות ודיון נציג.

9. קביעת שומנים ביוכימית באמצעות הפקה מוצקה שלב (SPE) וגז כרומטוגרפיה ספקטרומטריית (GC / MS)

"Jove_content"> לאימות של רמות שומנים המבוססות על הנילוס האדום פלואורסצנטי, גז כרומטוגרפיה אחרי ניתוח ספקטרומטריית מסות (GC / MS) יכול להתבצע על אסטרים של חומצות שומן מתיל (FAME) נגזרים מtriacylglycerols (TAG) ופוספוליפידים (PL) מ כדורי תולעת. צעדים המעורבים אורגניים צריכים להתבצע תחת מנדף. יש להקפיד ששומנים נשמרים תחת החנקן מוגן מפני אור במהלך אחסון ממושך או שלבי דגירה כפי שהם פגיעים מאוד לחמצון. כדורי תולעת מ2,500-5,000 חי סינכרוני משמשים כקלט, שהוכן בדיוק כמו לעיל פרט לכך שבעלי החיים גדלים על 10 צלחות RNAi סנטימטר.

  1. שטוף 2,500-5,000 תולעים מכל צלחת 10 סנטימטרים עם חיץ 10 מ"ל M9 לתוך צינור פוליפרופילן חרוטי 15 מ"ל. תולעי הגלולה ב 500 XG לדקה אחת, ולשטוף גלולה שוב עם חיץ 10 מ"ל M9. בעלי חיים גלולים ב500 x גרם. לשאוב עוזב נפח 250 μl מוחלט, וגם הקפאת חנקן נוזלי ובחנות -80 ° C תחת החנקן for המשך עיבוד או להמשיך ישירות.
  2. תולעת הגלולה עשויה להילקח ישירות לשלב 9.3 אם מסת טריגליצרידים היא להיות מנורמלת המוני פוספוליפידים 8,13,21. עם זאת, אם החוקר חפץ נורמליזציה לתכולת חלבון או תוכן DNA, תולעת הגלולה יש sonicated בעצמה הגבוהה ביותר בsonicator אמבטיה למשך 10 דקות, 30 שניות ב, 30 שניות משם, ב 4 ° C. אם נורמליזצית חלבון או DNA היא רצויה, להסיר aliquot 5 μl ולקבוע ריכוז חלבון כולל באמצעות ריאגנט ברדפורד או תוכן דנ"א דומה או מלא לאחר טיהור עמודה באמצעות ספקטרופוטומטר UV.
  3. הוסף לתולעי 2:01 כלורופורם 1.5 מ"ל: מתנול במבחנת זכוכית ורוסיליקט מושחלת. כל ההעברה של ממסים אורגניים צריך להיעשות באמצעות pipettes זכוכית.
  4. באמצעות פיפטה μl wiretrol 50, להוסיף תקן 25 ננומטר פוספוליפידים ב50 μl, ורמת הטריגליצרידים nM 16.7 ב 50 μl. שני הסטנדרטים צריכים להיות מומסים ב02:01 כלורופורם: מתנול, כתרים בחוזקה,ונשמר תחת החנקן המוגן מפני אור במקפיא ° C -80 כדי למנוע חמצון.
  5. כובע עם כובע פנוליות ומערבולת. חלץ לשעה 1 בRT, vortexing כל 15 דקות.
  6. צנטריפוגה בסל"ד 1000 למשך 5 דקות. העברת שלב אורגני נמוך יותר מבלי פגרים לצינור תרבות ורוסיליקט.
  7. הוסף 0.3 מ"ל של 0.9% NaCl, מערבולת וצנטריפוגה בסל"ד 1000 למשך 5 דקות.
  8. העברת שכבה תחתונה אורגנית לצינור תרבות ורוסיליקט טרי, כדי לוודא שלא להעביר מעל כל השכבות המימיות.
  9. שלב אורגני יבש תחת חנקן. חילוץ כדי להתחיל מוצק שלב (SPE) resuspend שומן מיובש במיליליטר כלורופורם 1. לחלופין, להפרדה וניתוח מפורט של שיעורי שומנים שונים, כוללים שיעורים פוספוליפידים, גליקוליפידים, sphingolipids, diacylglycerols, triacylglycerols, חומצות שומן חופשיות, והאסטרים כולסטרול, כרומטוגרפיה שכבה דקה כחלוץ בוטס המעבדה בג 22 elegans יכול לשמש במקומו של SPE. שומנים עלולים גם בדואר מופרד על ידי HPLC ושברים נותחו על ידי GCMS. שיטות מתוחכמות של פרופיל השלם lipidome ידי liquid-chromatography/MS (LCMS) יכולות לשמש גם 23-26.
  10. להרכיב עמודת SPE סיליקה בסעפת SPE. טור טרום לאזן עם כלורופורם 3 מ"ל. אפשר ממס לזרום על ידי הכח הכביד.
  11. טען מדגם שומנים על עמודת SPE, איסוף זרימה דרך צינור בורוסיליקט הליכים כחלק מהחלק הראשון (שבריר TAG). שומנים ניטראליים ביותר יבואו דרך במ"ל זה 1 1 זרימה דרך. הוסף 3 מיליליטר כלורופורם לelute מלא שבריר TAG, איסוף זרימה דרך הצינור בשבריר TAG.
  12. הסר כובע וצינור האוסף הראשון, ולהחליף בצינור איסוף נקי. Elute glycosphingolipids עם 5 מ"ל של אצטון 09:01: מתנול. אנחנו לא באופן שגרתי אין לנתח את הרכב חומצות השומן של חלק זה, עם זאת, זה עשוי להכיל מידע רב ערך וניתן לשמור להכנת אסטרים תיל ובסיסי sphingoid חינם לניתוח נוסף תוך ניצולפרוצדורות נפרדות מאלה של TAG וPL כפי שתואר קודם לכן 27 מתמחות.
  13. החלף צינור האיסוף glycosphingolipid עם צינור איסוף 2 הליכי ורוסיליקט. Elute פוספוליפידים עם מתנול 3 מ"ל (שבריר PL).
  14. שברים יכולים להיות מאוחסנים ב-80 ° C, בשלב זה כתרי חוזקה תחת חנקן. יבש מטוהר שומנים תחת חנקן. כדי להאיץ ייבוש, בבלוק חימום יבש בגיל 33 ° C. לעולם אל תאחסן שומנים בצורה מיובשת, כמו שהם רגישים במיוחד לחמצון במדינה המיובשת.
  15. שברי resuspend מיובשים שומנים ב2 מ"ל 2% H 2 SO 4 במתנול ידי vortexing ולדגור תרי חוזקה הלילה ב° C אמבט מים 55 כדי ליצור FAMEs. יש להקפיד לקבל שום מים בתגובת התהילה כמו זו תמנע derivatization של שומנים במידה רבה. מצאנו derivatization יעיל יותר על ידי דגירת הלילה והספרות מצביעה על חמצון שומנים פחות מתרחש בטמפרטורות נמוכות יותר duriהכנת ng FAME 28. שיטה חלופית ומהירה יותר היא להשתמש 2 מ"ל 2.5% H 2 SO 4 במתנול וderivatize לשעה אחת ב 70 או 80 מעלות צלזיוס 21,22,29.
  16. למחרת בבוקר, מוריד מאמבטיה, ולאפשר להתקרר. הוסף 1.5 המ"ל H 2 O (כדי להרוות את התגובה) ולאחר מכן 0.3 המ"ל הקסאן (כדי לחלץ את FAMEs) על כל תג ושבריר PL. נערו נמרצות וסרכזת ב1000 סל"ד למשך 5 דקות.
  17. מאוד להסיר בזהירות רק שכבה עליונה הקסאן באמצעות פיפטה פסטר סטנדרטית או פיפטה. לוותר לתוך צינור autosampler. ודא שלא לכלול כל מתנול acidified כמו שזה יהרוס את העמודה וMSD GC.
  18. כובע ודגימות עומס על GC / MS. הדגימה תועבר בקסאן לבקבוקון Agilent מייקר להוסיף הכתיר עם כובע בורג PTFE-סיליקון PTFE. הוא הועבר ל6890/5973N מודל Agilent GCMS לבוש עם Supelcowax-10 (24079) 30 מטר, עמודת 250 מיקרון התמזג סיליקה נימים. microliter אחד מוזרק intכניסת splitless OA להגדיר ב 250 מעלות צלזיוס וPSI ultrapure הליום 13.33 משמשות גז מוביל. ריצת הפרוטוקול היא כדלקמן ב1 מ"ל קבוע לדקות:
שלב הוראה טמפרטורת מטרה
1 להחזיק 2 דקות 150 ° C
2 רמפה 10 מעלות צלזיוס לדקה 200 מעלות צלזיוס
3 החזק 4 דקות 200 מעלות צלזיוס
4 רמפה 5 ° C לדקה 240 ° C
5 החזק 3 דקות 240 ° C
6 רמפה 10 מעלות צלזיוס לדקה 270 ° C
7 תחזיק 5 דקות 270 ° C

עיכוב ממס דקות 3 משמש בMSD כדי למזער בלאי על filחסר דעה. לאחר מכן, המונים בין 50 ל 550 Daltons מזוהים עם הסט המרובע MS ב 150 מעלות צלזיוס ומקור ms נקבע על 230 ° C, עם טמפרטורת תרמית עזר של 270 ° C.

Representative Results

דוגמה של צלחת הדמיה שנלקחה דרך העבודה המכתימה השומן שמוצג באיור 1. פקדים ספציפיים לשומן גבוה (daf-2 האינסולין רצפטור RNAi), דל שומן (חלבון lpd-3 הנדרש לאחסון גרגרי שומנים במעי RNAi), שומן קטן ונמוך (fasn-1 חומצות שומן synthase RNAi), ווקטור ריק ( שליטה) מראה את השינויים בעוצמת קרינה בהתאם לרמות השומן של בעלי החיים, ועל הסכומים שנקבעו על ידי השומנים המתאימים GC / MS ניתוח (איור 2). שים לב שinactivations הגן מוביל למקובעים התפתחותית, חיות קטנות לעתים קרובות נראה שיש שומן נמוך בהרבה מאשר חיות בקרה מבוגרות, ללא קשר לכל קשר לחילוף חומרים של שומן (איור 3). ניתוחים משניים, כולל ניתוח מכתים וביוכימיה שומנים עם SPE-GCMS של פקד חיים פרועים מסוג של שלב התפתחותי דומה צריכים לעשות כדי להבטיח את תוקפו שלקטן או התפתחותית נעצר להיטים חיוביים. במקרה של fasn-1 RNAi (איור 2), חיות במעצר או L2 או L3 שלב זחל, ויש לי כתמי שומן נמוכים יותר מאשר השליטה RNAi למבוגרים, אבל דומה בשפע לבעלי חי L2-L3 שלב בקרת RNAi (אחוזי כתם שומן של מבוגר שליטת RNAi: 49.9 ± 4.5% לfasn-1 RNAi ו20.2 ± 2.1% לL2 השליטה RNAi, ו64.7 ± 1.3 עבור L3 השליטה RNAi). לחלופין, הניתוח ביוכימי הצביע TAG נמוך / יחס PL משלב L2 תאם חיות בקרת N2 (TAG / PL: 22.5 ± 2.9 עבור fasn-1 RNAi ו46.1 ± 3.4 לבמה תאם השליטה RNAi, P ≤ 0.05). כך, במקרה זה יכול להיות מאושר על ידי ניתוח ביוכימי שfasn-1 יש תפקיד באחסון שומנים בדם ולא רק ירידת שלב ספציפי במסת שומן.

ניתוח המעקב של תולעי הדמיה נשען בכבדות על פלטפורמה חישובית כגון Profiler הסלולרי באמצעותWormToolbox 30. למספר קטן יותר של תמונות, פלטפורמת ניתוח תמונה זמינה לציבור כגון ImageJ, זמין באופן חופשי מ-NIH, ניתן להשתמש. לצורך הניתוח שלנו, תסריטי Matlab ייחודיים שמשו ראשון לזהות היטב, ולאחר מכן להוציא בארות ריקות או אלה עם בועות, ולהבחין בין פסולת קטנה מתולעים. בקרת איכות ידנית הכרחית עבור תמונות שמסומנות להרחקה מהסיבות שהוזכרו לעיל. מצאנו באופן אמפירי שעוצמת אחוזון ה -90 של פיקסלים תולעת פני היטב, מנורמל לאזור תולעת על פני, בתנאים עקביים מטרי של הכתמת עצמה בכל שלבי פיתוח תולעת (איור 3). שילוב מסת שומן כללית על פני השטח של התולעת, להיפך, הייתה נוטה לצבור תולעים קטנים, בהירות באופן שקול עם תולעים עמומים גדולים. בגלל השיטה שלנו אינה משתלבת אות ניאון מוחלטת על השטח של התולעת, בלקיחת אחוזון עצמה, שינויים בגודל תולעת כשלעצמה לא יעשולא הטית העצמה נמדדת. במקום זאת, הבדלים בהתפלגות עוצמת פיקסל נמדדים. עם זאת, על אף זאת, הבדלים בולטים נראים בהכתמת חלוקת עוצמת פיקסל בין חיות של שלבי התפתחות שונים, ולכן חשוב לבחון את ההשפעה של RNAi לכל גן חיות נגד של שלב התפתחות דומה (איור 3). השתנות ממוצעות בין משכפל מוצגות באיור 4 מצביעות שחזור גבוה של שיטת הכתמת השומן. שים לב כי כוחה של השיטה הוא תלוי מאוד בקבלת תמונות באיכות לכל צלחת, בתנאי תאורה אחידים, תוך שימוש בזמני חשיפה זהים, ועם בועות מינימאליות, פסולה, או מוצלב של תולעים לתוך בארות אחרות.

SPE בוצע בטרום מעורב, מטוהרי סטנדרטים כדי לקבוע את המידה שבי תגיות יכולה להיות מופרדות מפרספקטיבה (האיור 5A). בניתוח זה, השיג 100% שלeparation של TAG וPL, הצביע כעדר מוחלט של חומצות שומן 17:00 נגזרות מPL במדגם TAG והיעדר מוחלט מקביל של חומצות שומן 13:00 נגזרות מTAG במדגם PL (5A איור). כך SPE הוא יעיל ביותר בהפרדת כיתות שומנים. ניתוח זה אינו מצביע על כך שכל התגים באורכי שרשרת שונים יהיו מטוהרים באופן שקול על ידי SPE וזוהו על ידי GCMS עם יעילות דומה. זה רק מבטיח ששומני PL TAG ובסך מופרדים לחלוטין אחד מהשני.

מדגם עקבות GC-MS של חיות ברות מסוג N2 שצולמו באמצעות מיצוי שלב מוצק והכנת FAME מוצגת באיור 5 ב. עבור שניהם TAG וPL, פסגות יכולות להיות מזוהות על בסיס זמן שמירה ויונים הוריים ובתה על הספקטרום ההמוני, ושטח הכולל תחת הפסגות זוהו המנורמלות לאזור של הסטנדרטים הפנימיים בהתאמה. כדי לקבוע את הסכום המנורמל של TAG, האזורתחת כל פסגות הכרומתוגרמה TAG, למעט התקן 13:00, נוספו יחד ומחולק בשטח שמתחת לשיא 13:00. כמו כן, על מנת לקבוע את הסכום הכולל המנורמל PL, אזור נתון לכל הפסגות, למעט התקן 17:00, נוספו יחד ומחולק בשטח שמתחת לשיא 17:00. הערכים המנורמלים לדגימות PL TAG ומשמשים מכן לחשב את היחס הסופי TAG / PL לדוגמה:

משוואה 1
יש לציין, כי הנתונים מSPE-GCMS מתירים הרבה יותר מתוחכם ניתוח של חומצות הנמצאות בכל שבריר שומנים מחישוב פשוט של TAG המוחלט ליחס PL שומן. לדוגמה, החוקר יכול לשלב שיא מקביל לחומצת שומן אחת אחת ולהשוות השפע המנורמל שלה על פני דגימות (למשל גomparing בN2 פראי מסוג לעומת daf-2 RNAi האזור המשולב של השיא 18:00 מחולק בשיא 13:00 הסטנדרטי, המנורמל למסת PL כולל חלקי אזור PL 17:00 הסטנדרטי שיא):

משוואה 1
צריך לבחור החוקר, זה גם יהיה ניתן לקבוע את האחוז של כל חומצת שומן שניתן בשברי PL TAG או כאחוז מהסכום הכולל של חומצת שומן נבדק ו( כדוגמא 18:00 בשבריר TAG בתולעי N2 ):

משוואה 1

"איור איור 1. עבודה אופיינית לניסוי הכולל. יום 1, צלחות קפואות RNAi ספרייה מוטבעות על גבי צלחות אגרו LB מגבר / ט וטופחה על 37 ° C. יום 2, צלחות מגבר / ט משמשים לתרבויות נוזליות זרעים של שיבוטי RNAi בלוקים גם עמוקים. יום 3, חיידקים מרוכזים על ידי צנטריפוגה והועברו לצלחות RNAi 96-כן. יום 4, L1 הגוזל ג elegans מתווספים לצלחות RNAi בנוזל ולהתייבש. יום 7, בעלי חיים שנאספו בנוזל, מוכתמים באדום בהנילוס 40% isopropanol, רכובים על שקופיות טפלון 96-כן, וצלמו בעזרת מיקרוסקופ תפוקה גבוהה.

איור 2
איור 2. כתמים מקבעים מבוססי הנילוס האדומים גדולים בfasn-1 (שומן קטן, נמוך), lpd-3 (דל שומן), בקרה (וקטור ריק), או daf-2 (שומן גבוה) שיבוטי RNAi. דוגמאות עובדו לפי הפרוטוקול (סכמטי באיור 1). בעלי חיים קבועים, מוכתמים באדום הנילוס, ותוצאת הדמיה ברמות שומנים דומים כפי שמתקבלת ממדידת שומנים ביוכימי. רמות Isopropanol-קבועות הנילוס האדומים פלואורסצנטי, שנרכשו מלפחות 6 משכפלים ביולוגיים, מוצגים בשורה הראשונה. רמות הטריגליצרידים כמותיים, רעיוניות של חנויות שומנים ניטראליות כוללות כאשר מנורמלת לרמות כוללות פוספוליפידים (תג / PL), שנלקחו מ4 משכפל ביולוגי, מוצגים בשורה השנייה. חשוב לציין כי quantitation המוחלט מושגת מהכתמה מקבעת הנילוס האדומים ונחישות שומנים ביוכימי לעתים קרובות אינו תואם באופן מושלם. במקרה זה, אם כי באופן איכותידומה, fasn-1 (RNAi) יש מסה שונה יותר הטריגליצרידים לעומת שליטה בשיטות הביוכימיות מכפי שצוין על ידי מיקרוסקופ, lpd-3 הן comparably שונים, וdaf-2 (RNAi) הן פחות שונים, למרות כל ההבדלים הם מאוד משמעותיים מבחינה סטטיסטית ו מדידות היו לשעתקו מאוד. הנתונים המוצגים הם ממוצעים ± SEM (*, P ≤ 0.01; **, P ≤ 0.0001 ביחס לשליטה, נקבע על ידי T-מבחן המזווג, שני זנב בהנחה שונה שווה).

איור 3
איור 3. מסת שומן נקבע על ידי כתמים אדומים הנילוס קיבעון בשלבי זחל שונים. בעלי חיים גדלו על OP50 חיידקים ונאסף בL1, L2, L3, L4 ושלבי התפתחות בוגרים הרה. תמונות נתפסו לאחר צביעת קיבעון ונותחה באמצעות סקריפט Matlab מותאם אישית כדי לקבוע 90 שנת אחוזון oעוצמת פיקסל f מעל האזור זיהה התולעת. שימו לב שאת רמות השומנים בדם של בעלי חיים להגדיל באופן משמעותי כחי מתפתח מL2 L4 לבמה, ואז להקטין מעט את החיה מתחילה להסיט קלוריות כיוון ההתפשטות של תאי המין בשלב הבוגר. הנתונים המוצגים הם ממוצעים ± SEM ל6-8 חזרות (**, P ≤ 0.0001 ביחס למבוגרים הרה, נקבע על ידי T-מבחן מזווג, שני זנב).

איור 4
איור 4. שחזור גבוה מעבר עצמאי ביולוגי משכפל. מוצג הנה עלילת פיזור של עוצמות קרינה אדומה הנילוס ברחבי ביולוגי משכפל (n = 6-8). עבור כל לשכפל, כל הערכים מנורמלים לעצמה הממוצעת של בקרות הווקטור הריקות. נתונים המוצגים הם ממוצעים ± SEM (**, P ≤ 0.0001 ביחס לשליטה, נקבע על ידי T-מבחן מזווג, שני זנב בהנחהשונה שווה).

איור 5
איור 5. GC-MS chromatograms של SPE מופרד תקנים וTAG סוג פראי ושפע PL. () עקבות GC-MS מוצגות בהפרדת SPE של תקני PL TAG ו. שים לב להיעדר המוחלט של חומצת שומן 13:00 בזכר PL והיעדר המקביל של חומצת השומן 17:00 בשמץ TAG, המציין הפרדה מלאה של TAG (tritridecanoin) מPL (1,2-diheptadecanoyl-SN-glycero -3-phospho-(1'-RAC-גליצרול)). (ב) נציג ספקטרום מלא של TAG וPL ממדגם של N2 הפראי סוג האכלת חי וקטור שליטת RNAi (HT115 חיידקים עם L4440 הווקטור RNAi הריק). microliter אחד המדגם הוזרק לAgilent 6890/5973N GCMS על פי הפרוטוקול, ופסגות בודדות זוהו על ידי ךטהזמן ntion וספקטרום המסה שלהם. קיצורים: סקל, חומצת שומן cyclopropane; ISO: ISO-. חומצה מתיל מסועף שרשרת שומן; GLA, חומצת גמא לינולנית; ALA, חומצת אלפא לינולנית; DGLA, חומצה לינולנית גמא dihomo; EPA, חומצת eicosapentaenoic לוחצים כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

הפרוטוקול שהוצג מאפשר סינון מהיר, בקנה מידה גדול של רמות שומנים בג elegans, הניתן להתאמה בקלות למסכי תפוקה גבוהות. בניגוד לשיטות ששמשו בעבר, שכרוכים בצעד קיבעון ממושך בparaformaldehyde אחרי כמה מחזורי הקפאת הפשרת 8,10, הפרוטוקול שלנו דורש קיבוע 3-דקות פשוטים בisopropanol. אנחנו גילינו שעל ידי הכתמת ג elegans ב 40% isopropanol, הם הופכים באופן חופשי לחדיר הנילוס אדום, ללא שימוש באמצעים נוספים בהקפאה או הפשרת קיבעון. כמו כן, כנילוס אדום סלקטיבי מאיר במדורים הידרופובי בספקטרום הירוק 18,19,31, לא destaining הוא הכרחי. בסך הכל, בעלי חיים יכולים להילקח מצלחות RNAi לבעלי חי תמונה צבעוניות ומוכנים בקצת מעל 2.5 שעות. שיטה זו ניתן לבצע יחסית בזול ועם שחזור גבוה. השיטה לא תלויה ביכולתו של ג elegans לספיגה או להתרכזלצבוע, ולכן אין לו אותן המגבלות כמו האכלה באמצעות שיטות המבוססות על צבעים חיוניים. בהתחשב שחזור ודיוק של מדידות, השיטה מתאימה לסינון מספר גדול של הגנים inactivations ידי RNAi. אם לכמת את רמות שומנים בדם הוא רצוי על בסיס צביעה מקבעת הנילוס האדום, אנו ממליצים על השימוש ב4-6 ביולוגיים משכפל את הבקרות המתאימות והבדיקה סטטיסטית מיושמת.

סביר להניח כי רב inactivations הגן מוביל לבעלי חיים קטנים (עקב שיבוטי RNAi גורמים פיתוח מתעכב או נעצר) היה יוצא ממסך לרגולטורי שומן, ללא כל קשר לחילוף חומרים של שומן. בזמן שתכנית ניתוח התמונה שנוצלנו חשבונות לתולעים בגדלים שונים על ידי נרמול עוצמת הקרינה לאזור התולעת, חוקרים בודדים יכולים להיות גם שירצו לשקול השוואה בין רמות מכתים השומן של חיות קטנות לבעלי חיים מסוג פראי של שלב התפתחות דומה. ב מקרה של בעלי חיים קטנים או התפתחותית נעצרו עם מסת שומן נמוכה בעליל, אנו מציעים שלא שיטה אחת מספיקה כדי להדגים מטבוליזם שומנים שונים. מעקב ניסויים אחדים, כולל SPE-GCMS, עשויים להידרש כדי לברר את תפקוד שומנים ברגולציה של גנים אלה. לרגולטור טבולים ידועים fasn-1, ניתוח SPE-GCMS בהשוואה לבעלי החיים המתאימים התפתחותית N2 L2 בקרה הייתה צורך לאשר את הפנוטיפ השומן הנמוך בעליל מצא בהשוואה לחיות בקרה למבוגרות. בעוד כתמי שומן הנילוס האדום עולים רמות שומן נמוכות יחסית למבוגר לשלוט RNAi, בהשוואה לבעלי חיים בשלב מתאים-L2 בקרת RNAi, אין הבדל ניכר היה לראות. בהתאם לכך, שימוש בשיטה שנייה, כימות יוכימי כלומר יחס TAG / PL היה צורך לקבוע כי fasn-1 הוא רגולטור אמיתי של מסת שומן, כfasn-1 RNAi הוא יוכימית מובחנת מחי במה מתאימה-L2 בקרת RNAi.

ריבה = "jove_content"> למרות שאנו מציגים הדמיה ועיבוד לפלטפורמת תפוקה גבוהה, מיקרוסקופ זקוף קונבנציונלי יכול לשמש בקלות ללכוד תמונות מתולעים רכובים על agarose 20 רפידות או על גודל קונבנציונלי טפלון מודפס 8-12 שקופיות מיקרוסקופ גם . המגבלה היחידה היא שככל שפלואורסצנטי הירוקה של טיפי שומנים המוכתמים photobleaches הנילוס האדום במהירות, בתנאי חשיפה שיטתיים ואחידים צריכים להיות בשימוש על מנת להבטיח השוואה בין תמונות. אנו מוצאים כי מיקרוסקופ אוטומטי לחלוטין עם תנאי רכישת תמונה אחידים עובד הכי טוב להשפעה זו.

אחד היתרונות הגדולים של פרוטוקול זה הוא שאחרי שהם אספו את התמונות ניתן לשמור לניתוח מחדש בעתיד. אותן תמונות יכולות לשמש כדי לקבוע את גודל גוף, בנוסף לתכולת שומן. יתר על כן, כתוכניות חישוביות מתקדמות יותר, יש סיכוי לניתוח תולעת אחת, שהניב תוצאות מובהקות סטטיסטימבאר אחת. לכן השיטה שלנו שמנצלת מיקרוסקופיה תפוקה גבוהה יש כמה יתרונות על פני שיטות שמשתמשות במסך שפורסם Copas Biosort לכמת אותות ניאון 32,33. עם זאת, מתודולוגיות בהחלט מחמיאות.

קביעה מדויקת, ביוכימי של תוכן שומנים על ידי SPE וGC / MS מאשרת המכתימה הנילוס האדום ממאגרי השומן הגדולים בג elegans. למרות quantitation המוחלט מושגת מהכתמה מקבעת הנילוס האדומים ונחישות שומנים ביוכימי לעתים קרובות אינו תואם באופן מושלם, בשתי השיטות לייצר תוצאות לשעתקו מאוד משמעותיות מבחינה סטטיסטית, שמסכימות איכותי. בנוסף, שיטה זו יכולה להיות מותאמת כדי לענות על צרכימים הספציפיים של חוקרים פרטיים שיחייבו ניתוח נוסף של המעמדות הנפרדות של glycosphingolipids, פוספוליפידים או טריגליצרידים בהווה בדגימות שונות. יש לציין שקבוצות אחרות השתמשו בטכנולוגיה tha האחרn SPE להפריד כיתות שומנים לפני GC / 22 MS. שכבה דקה כרומטוגרפיה (TLC) וכרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוהה (HPLC) יש יתרונות על פני SPE בכך שהם עשויים להיות מסוגלים שומנים טובים יותר נפרדים מובחנים ניטראליים (למשל, TAG diacylglycerols, חומצות שומן חופשיות, והאסטרים כולסטרול) משומנים קוטביים (phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine) וגליקול-sphingolipids. אנחנו בוחרים SPE כי זה דורש מינימום של חומר מוצא (2,500-5,000 תולעים), היא מדגישה את חנויות הגדולות לטווח ארוך אנרגיה, תגיות, המרכיבות את רוב שומני השבריר הניטראלי 4, והוא מהיר, אין צורך ציוד מיוחד או צלחות. יודגש, שמבוסס על תערובות סטנדרטיות, SPE מפריד לחלוטין תגיות מפרספקטיבה, וניתן לשחזור ואמין ביותר (ראה 5 איור). אמנם לכמת וניתוח של אסטרים מתיל חומצת שומן דורשים GC / MS, ציוד זה זמין בדרך כלל, ואם לא באופן מקומי, דגימות רשאיותלהיות שנוצר כאמור לעיל ואוחסן ב -80 ° C עד הניתוח תחת חנקן ע"י משת"פ או מסחרי GC / MS שירות מסודר.

פלט GCMS מכיל נתונים ברזולוציה גבוהה על כל חומצת שומן בתוך כל מיני שומנים. זה מאפשר קביעת הבדלים מפורטים בין דגימות מושוות. כדוגמה, החוקר יכול לקבוע אם רמות חומצות שומן מסוימות שונו בשפע באופן משמעותי יותר מאחרים בdaf-2, lpd-3-1 או fasn RNAi לעומת בקרת וקטור. כלי עצום וחזק זה ולכן יכול לספק מידע מפורט על אילו מיני שומנים הם שינו בשפע בכל מניפולציה ניסויית.

לצורך הניתוח שלנו, אנחנו לרוב לנרמל המוניים TAG למסת PL. בעוד חלבון או DNA יכול לשמש גם כדי לנרמל את מסת שומנים בעקבות נחישות מaliquot של תולעת גלולת sonicated, אנו מוצאים כי שיטות אלה כפופים לintטעות אנושה roduced במהלך כל שלבי pipetting והתאוששות במדגם מכל מוצא. זה מסיבה זו עלינו בחרתי במקום להשתמש המונית PL כגורם הנורמליזציה שלנו. סטנדרטים טבעיים הציגו בתחילת הפרוטוקול (tritridecanoin לTAG, 1,2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-phospho-(1'-RAC-גליצרול) לPL) מתבצעים דרך כל השלבים של מיצוי השלב המוצק ו הכנת תהילה, ולהבטיח התאוששות כמותית ונציג של שניהם שברים PL TAG ו. אותה הערבות לא יכולות להתבצע אם חוקרים להשתמש בחלבון או DNA כדי לנרמל המוני TAG. אנו מאמינים PL להיות מד החזק ביותר שבאמצעותו להשוות את רמות TAG פני דגימות, כפי שכבר הראה בעבר כי PL משתנה רק בדקדקנות על ידי אותו הגירוי ולחולל משמרות המוניות גדולות ברמות TAG, רעב ממושך למשל או פעילות גופנית מוגברת - 34 36. PL כנראה משחקי תפקיד מבני, הבטחת נזילות הממברנה והסלולרי integrity ותפקידי איתות, ולא כאמצעי לאחסון האנרגיה 37-39. בידות שלנו, יחס TAG / PL קרוב ביותר למה שמתקבל על ידי צביעת שומנים מקבעים מבוססת עם הנילוס אדום, ומסכים עם זה שנמצא על ידי קבוצות אחרות 21. אסטרטגיה חלופית משמשת וטס המעבדה, שבו אחוז TAG שומנים מחושב לעומת שומנים כלל 9,22,29.

השימוש בסוגים שאינם ילידים של TAG וPL הסטנדרטי מבטיח שלא חומצות שומן מקומיות תיכללנה בחישוב הנורמליזציה. הבחירה של אורך שרשרת מבוססת אך ורק על הצורך של תקנים אלו שלא להתערב בספקטרום ההמוני של חומצות שומן מקומיות. מצאנו כי חומצות שומן של 13:00 ו17:00 לשרת טובה ביותר למטרה זו. זה אפשרי, בהתחשב בתכונות הכימיות השונות של חומצות שומן קצרות שרשרת, שהסטנדרטים של חומצת השומן הטבעי שלנו לא יכולים להיות נציג של התאוששות של כל החומצות או שרשרות עם הבדל שומן שרשרת באורךמדדי רוויה erent. כך אפשר כי במהלך SPE או GCMS אנו עשויים לראות הבדלים ביעילות של טיהור או זיהוי בין שומנים באורכי שרשרת שונים. בהתבסס על זה והיינון השונה של חומצות שומן שונות בGCMS, אין זה אפשרי לעשות הצהרה מוחלטת על השפע של כל חומצת שומן נתון. לכן, אנו משווים רק בין דגימות בטווח של שכיחות ניסוי יחידה של כל חומצת שומן נתון. אם אחד לא רצה לכמת חומצת שומן לחלוטין, אופן זה יכול להיות מושגת תהיה לרוץ מדגם הוכן כאמור מתובל בכמות ידועה של גרסת יציבות כותרת isotopically 13 C של חומצת שומן או שדומה, כך שזה יכול להיות להבדיל מתבסס על מסה של יון ההורה בMSD, למשל. בהתחשב בכך שאנו משווים רק כמויות יחסיות של סוגי שומנים או כל חומצת שומן נתון, סטנדרטי PL 17:00 TAG ו13:00 לשרת מטרה זו במידה מספקת, במינימום עלות, ללהבטיח התאוששות נאותה ונציג של כל כיתת שומנים בדם.

עד לנקודה זו, חלה חוסר הקונצנזוס באשר לפרשנות של תוצאות מסוימות מתקבלת על ידי שיטות שונות, ומה המתודולוגיות הרווחות צריכות להיות. בסך הכל זה יש לציין כי אין שיטה אחת בבידוד הוא אידיאלי ללמוד חילוף חומרים של שומן בג elegans. עם זאת, באמצעות הקרנה מרובה ושיטות אימות, ניתן להשיג את האמון בנתונים המתקבלים על גני רגולצית שומנים. לפיכך, אנו מתכוונים לפרוטוקולנו לשרת כסמן לעבודה בעתיד בתחום ג מחקר השומן elegans.

Disclosures

המחברים אין אינטרסים מנוגדים לגילוי.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לKacergis מיכאל לקבלת סיוע טכני וLianfeng וו לדיונים וקראתי את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי פרס פיתוח קריירה מ-NIH / NIDDK (K08DK087941 לAAS), NIH / NIDDK אימוני מענק (5T32DK007028 לECP), ניו Scholar הקרן הרפואית אליסון פרס הזדקנות (לAAS) ובצ'ארלס H פרס. הוד קרן ילד בריאות מחקר (לAAS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-pin replicator Nunc 250520
LB Agar US Biologicals L1500
Agarose Invitrogen 16500500
Mechanical Pipettors Biohit M Line M10, M100, M300
Electronic Pipettor Biohit E Line E1200
1 M KH2PO4 Sigma P0662 pH 6.0 Sterilized by Autoclaving
1 M MgSO4 Sigma M2643 Sterilized by Autoclaving
1 M CaCl2 Sigma C2661 Sterilized by Autoclaving
NaCl Sigma S5886
5 mg/ml Cholesterol Sigma C8667 In 100% Ethanol
200 mg/ml Carbenicillin US Biologicals C1100 Filter Sterilized 0.2 μ
1 M IPTG US Biologicals I8500 Filter Sterilized 0.2 μ
100 mg/ml Ampicillin Filter Sterilized 0.2 μ
5 mg/ml Tetracycline In 100% Ethanol
Bacto Agar BD 214040
96-well TC Plates BD-Falcon 353072 For 96-well RNAi
Rectangular A/T Plates Thermo Scientific 242811 For stamping RNAi
LB Media US Biologicals L1530 Prepared as per manufacturer instructions
96-well Deep Well Assay Blocks Corning Costar 3960 Rectangular V-bottom assay block
96-well Shallow Well Assay Block Corning Costar 3956 Round V-bottom assay block
Sterile Sealing Film VWR 89134-432
Aluminum Sealing Film Corning Costar 6570 Thermowell Sealing tape for 96-well plates
M9 Buffer See Hope et al.20 See recipe below
Triton X-100 Bio-Rad 161-0407
Nile red Invitrogen N-1142
Isopropanol Fisher BP2632-4
96-pin aspirator VP Scientific VP177A-1
96-well Teflon Masked Microscope Slides Thermo Scientific Custom Can also order Trevigen 96-well Cometslide
96-well Gold-Seal Coverslides Thermo Scientific Custom Can also use second 96-well Cometslide
Deep-well PCR plate VWR 89049-178
Non-sterile adhesive film VWR 60941-070
High-Throughput Microscope Leica DM6000 fully automated with Prior 96-well stage With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective
Bath Sonicator Diagenode Bioruptor XL
Chloroform Sigma 366927-4L
Methanol Fisher Optima F456-4
Phospholipid Standard Avanti Polar Lipids 830456P 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)
Triglyceride Standard NuChek Prep T-135 tritridecanoin
Wiretrol 50 μl Pipet Fisher 21-176-3A Drummond Scientfic
Acetone Sigma 320110-4L
Sulfuric Acid Fisher A300-500
Hexane Fisher Optima H306-1
SPE Silica Column Thermo Scientific 60108-317 Hypersep SI, 100 mg resin bed
Solid Phase Chromatography Manifold Sigma 57265 Supelco Visiprep 24-DL
Borosilicate Pipets Fisher 13-678-27F 10 ml size
Borosilicate Pasteur Pipets Fisher 13-678-8B
Borosilicate Culture Tubes Fisher 14-961-27
Threaded Borosilicate Tubes VWR 14235-460 8 ml capacity
Phenolic Caps for Culture Tubes Fisher 14-823-211
GC/MS Autosampler Vials Agilent 5188-6592
Caps for Autosampler Vials Agilent 5185-5861
GC/MS Agilent 6890 GC / 5973 MSD Outfitted with a Supelcowax-10 column

Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
NaCl 3 g
Agarose 17 g
Bacto peptone 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
1 M MgSO4 1 ml
5 mg/ml cholesterol 1 ml
1 M KH2PO4 (pH 6.0) 25 ml
1 M CaCl2 1 ml
200 mg/ml carbenicillin 1 ml
1 M IPTG 5 ml
Dispense into 96-well RNAi plates. Store at 4 °C until use, up to 2 weeks.

Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
LB agar (US Biologicals) 32 g
2 M NaOH 1.5 ml
Bacto agar 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
Tetracycline 3 ml
100 mg/ml Ampicillin 0.5 ml
Dispense 45 ml into each plate. Store in dark at 4 °C until use, up to 4 weeks.

LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks

Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy.

100 mg/ml Ampicillin

Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Tetracycline

Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container.

200 mg/ml Carbenicillin

Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Cholesterol

Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months.

1 M MgSO4

Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M CaCl2

Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M KH2PO4, pH 6.0

Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches

Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature.

10 N NaOH

Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature.

1 M IPTG

Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation

Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use.

Nile red stock solution

Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner.

Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates

Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use.

Phospholipid Standard

Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.

Triglyceride Standard

Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans. BMC Cell. 11, 96 (2010).
  2. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).
  3. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official. Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).
  4. Ashrafi, K., et al. Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature. 421, 268-272 (2003).
  5. Arda, H. E., et al. Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network. Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).
  6. Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage. Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).
  7. Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322, 957-960 (2008).
  8. O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, 430-435 (2009).
  9. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLoS ONE. 4, e7545 (2009).
  10. Yen, K., et al. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PLoS ONE. 5, (2010).
  11. Rabbitts, B. M., et al. glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis. Genetics. 180, 857-871 (2008).
  12. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277, 942-946 (1997).
  13. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes Dev. 23, 496-511 (2009).
  14. McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage. Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).
  15. Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).
  16. Hellerer, T., et al. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).
  17. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).
  18. Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red. 33, 833-836 (1985).
  19. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
  20. Hope, I. L. C. elegans: A Practical Approach. Oxford University Press. New York. 304 (1999).
  21. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).
  23. Wang, T. J., et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature medicine. 17, 448-453 (2011).
  24. Rhee, E. P., et al. Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans. The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).
  25. Lewis, G. D., et al. Metabolic signatures of exercise in human plasma. Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).
  26. Rhee, E. P., et al. Metabolite profiling identifies markers of uremia. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).
  27. Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida). Glycobiology. 7, 265-275 (1997).
  28. Christie, W. W. Advances in Lipid Methodology - Two. Oily Press. 69-111 (1993).
  29. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
  30. Wahlby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nat. Methods. (2012).
  31. Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).
  32. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).
  33. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains. J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).
  34. Comizio, R., et al. Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models. The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).
  35. Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus. J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).
  36. Lee, S. S., et al. Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation. J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).
  37. Singer, S. J. A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).
  38. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  39. Turkish, A. R., Sturley, S. L. The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).
הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (73), e50180, doi:10.3791/50180 (2013).More

Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (73), e50180, doi:10.3791/50180 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter