Vi presenterar robusta biokemiska och mikroskopiska metoder för att studera<em> Caenorhabditis elegans</em> Lipid butiker. En snabb, enkel, fixering-färgning förfarande för fluorescerande lipid droppe avbildning utnyttjar de spektrala egenskaperna hos den lipofila färgämnet Nile Red. Vi presenterar då biokemisk mätning av triglycerider och fosfolipider med fastfasextraktion och gaskromatografi-masspektrometri.
Nematoden C. elegans har blivit en viktig modell för studier av bevarade genetiska vägar reglerar fettomsättningen eftersom det gäller mänskliga fetma och dess associerade sjukdomar. Flera tidigare metoder utvecklats för visualisering av C. elegans triglycerid-rika fettdepåer har visat sig vara felaktiga, lyfta cellulära fack än lipid droppar. Andra metoder kräver specialutrustning, är tidskrävande, eller ge motsägande resultat. Vi introducerar en snabb, reproducerbar, fixativ-baserade Nilen röd färgning metod för noggrann och snabb detektion av neutral lipid droppar i C. elegans. En kort fixering steg 40% isopropanol gör djuren helt genomsläppliga för Nile Red, som sedan används för att färga djur. Spektrala egenskaperna hos denna lipofila färgämne gör det möjligt att starkt och selektivt fluorescerar i det gulgröna spektrum endast när en lipid-rik miljö, men inte i merpolära miljöer. Således kan lipiddroppar visualiseras på ett fluorescerande mikroskop utrustat med enkel GFP avbildande förmåga efter endast en kort Nile röd färgning steg i isopropanol. Hastigheten, överkomliga och reproducerbarhet av detta protokoll gör den idealisk för hög kapacitet skärmar. Vi visar också en parad metod för biokemisk bestämning av triglycerider och fosfolipider med gaskromatografi-masspektrometri. Detta strängare protokoll ska användas som en bekräftelse på resultaten från Nilen röd mikroskopisk lipid beslutsamhet. Vi räknar med att dessa tekniker blir nya standarder inom C. elegans metabolisk forskning.
Bevarande av metaboliska vägar mellan människa och nematoden elegans Caenorhabditis gör den till en kraftfull modell organism för att studera fetma. Medan C. elegans har inte adipocyter tillägnad fett lagring som i däggdjur, de lagrar triglycerider i lipiddroppar 1 och har många av samma regulatorer av fett lagring och energianvändning 2,3. För att analysera fettnivåer i C. elegans, har flera metoder föreslagits med varierande nivåer av lätthet och framgång. Den en gång gemensamma användningen av fluorescerande, viktiga färgämnen 4-7 nyligen ifrågasatts, och dessa reagenser visade sig vara färgning en avdelning skild från den huvudsakliga fett lager som av C. elegans 1,8-11. Fixativ-baserade icke-fluorescerande färgämnen, såsom Sudan svart och Oil-röd-O, medan framgångsrika i att belysa lipid droppar i masken 12-14, inte har så stor dynamiskt område för kvantifiering som fluorescerandecent färgämnen 8,13,15. Dessutom, nuvarande metoder för fixering för både fluorescerande och icke-fluorescerande färgämnen är tidskrävande och innebär flera frys-tö steg och / eller användning av giftiga kemikalier 1,9,10. Användning av särskilda BODIPY-märkta lipid-analoger har rapporterats att belysa lipiddroppar när de ges till levande maskar med kortsiktiga märkning 15. Men detta bygger på upptag av färgämnet och därför förspänd med C. elegans hantering och metabolism av BODIPY fettsyraanaloger. En etablerad alternativ till lipid-färgning färgämnen är etikett-fri, sammanhängande anti-Stokes Ramanspridning (CARS) eller stimulerad Raman-spridning (SRS) mikroskopi, som utnyttjar de karakteristiska vibrationella egenskaper lipidmolekyler att visualisera fettdepåer 10,16, 17. Emellertid är dyrbar specialiserad utrustning som behövs för denna metod, och genomströmningen är låg i bästa.
För att uppfylla ett behov av snabba, skalbara anasis av neutrala lipid butiker i C. elegans metabolisk forskning, introducerar vi en ny, mycket reproducerbar metod för fixativ-baserade Nilen röd lipid färgning. Spektrala och fysikalisk-kemiska egenskaper hos lipofila färgämnet Nile Red inducerar en guldgul-spektral förändring i sin excitation-emissionstoppen, gör det möjligt att fluorescera i det gröna emissionsspektrum endast när i en lipid-rik miljö, men inte i mer polära miljöer 18 , 19. Sålunda lipiddroppar kan detekteras efter enkel färgning med användning av ett grönt fluorescerande protein (GFP)-filter in för fluorescensmikroskopi. Den lätthet och överkomliga priser på denna teknik gör den idealisk för hög kapacitet skärmar. Vi visar också en parad, rigorös metod för biokemisk bestämning av triglycerider och fosfolipider med fastfasextraktion och gaskromatografi-masspektrometri. Biokemisk lipid mätning korrelerar med Nile Red-baserad mikroskopisk bestämning av C. elegans fat massa och bör användas som en bekräftelse av iakttagelser som gjorts med mikroskopisk lipid beslutsamhet.
Den presenterade protokoll möjliggör snabb, storskalig screening av lipidnivåer i C. elegans, som lätt kan anpassas till hög kapacitet skärmar. Till skillnad från tidigare metoder, som innebär en lång fixering steg paraformaldehyd följt av flera frysnings-upptiningscykler 8,10, kräver vår protokoll en enkel 3-min fixering i isopropanol. Vi har funnit att genom färgning C. elegans i 40% isopropanol, blir de fritt permeabel för Nile Red, utan användning av ytterligare frysning-upptining eller fixering steg. Också, som Nilen röd selektivt fluorescerar i hydrofoba fack i det gröna spektrat 18,19,31, ingen avfärgning behövs. Totalt kan djuren tas från RNAi plattor till färgade och redo att bilden djur i drygt 2,5 timmar. Denna metod kan utföras relativt billigt och med hög reproducerbarhet. Metoden beror inte på förmågan av C. elegans till upptag eller koncentratfärgen och därför inte har samma begränsningar som utfodring metoder med viktiga färgämnen. Given reproducerbarhet och precision av mätningar, är metoden lämplig för screening av ett stort antal gener inactivations från RNAi. Om kvantifiering av lipidnivåer önskas baserat på fixativ Nilen röd färgning, rekommenderar vi användning av 4-6 biologisk replikerar med lämpliga kontroller och statistisk testning tillämpas.
Det är troligt att många gener inactivations leder till små djur (på grund av RNAi-kloner som orsakar försenade eller gripits utveckling) skulle komma ut ur en skärm för fett tillsynsmyndigheter, oavsett eventuella koppling till fettomsättningen. Medan bildanalysprogram vi utnyttjade står för maskar av olika storlek genom att normalisera fluorescensintensiteten till masken område, kan enskilda forskare vill också överväga att jämföra de feta fläckar nivåerna av små djur till vildtyp djur i samma utvecklingsstadium. Ismå eller utvecklingsmässigt gripits djur med uppenbar låg fettmassa, föreslår vi att ingen enskild modalitet är tillräcklig för att påvisa förändrad lipidmetabolism. Flera uppföljning experiment, inklusive SPE-GCMS, skulle krävas för att fastställa lipid-reglerande funktion av dessa gener. För kända metabolisk regulator fasn-1, SPE-GCMS-analys jämfört med utvecklingsmässigt matchade N2 L2 kontrolldjur var nödvändigt att bekräfta den skenbara låg fetthalt fenotyp fann jämfört med vuxna kontrolldjur. Medan Nile red fett färgning visade lägre fettnivåer i förhållande till kontroll vuxen RNAi, jämfört med steg-matchade L2 kontroll RNAi djur fanns ingen tydlig skillnad ses. Följaktligen, användning av en andra metod, var dvs biokemiska kvantifiering av TAG / PL-förhållandet som krävs för att fastställa att fasn-1 är en sann regulator av fettmassa, såsom fasn-1 RNAi är biokemiskt särskiljbara från steg-matchade kontroll L2 RNAi djur.
<p class = "jove_content"> Samtidigt som vi presenterar avbildning och behandling för en hög genomströmning plattform kan en konventionell upprätt mikroskop lätt användas för att ta bilder från maskar monterade på agaros kuddar 20 eller konventionell storlek Teflon-tryckt 8 till 12 och mikroskopobjektglas . Den enda begränsningen är att när den gröna fluorescens av lipiddroppar färgade med Nile Red photobleaches snabbt systematiska, enhetliga exponeringsförhållanden måste användas för att säkerställa jämförbarhet mellan bilderna. Vi finner att en helt automatiserad mikroskop med enhetliga villkor bildupptagning fungerar bäst för detta ändamål.En av de stora styrkorna detta protokoll är att efter bilderna samlas de kan sparas för framtida ny analys. Samma bilder kan användas för att bestämma kroppens storlek utöver fetthalt. Dessutom, eftersom beräkningsmetoder program blir mer avancerade, finns det utsikter för enstaka mask analys genererar statistiskt signifikanta resultatfrån en enda brunn. Således vår metod som utnyttjar hög genomströmning mikroskopi har vissa fördelar jämfört med publicerade skärm metoder som använder en Copas Biosort att kvantifiera fluorescerande signaler 32,33. Men metoderna är definitivt gratis.
Exakt, biokemiska bestämning av fetthalten genom SPE och GC / MS bekräftar Nilen rödfärgning av de stora fettdepåer i C. elegans. Även om den absoluta kvantifiering uppnås från fixativ Nilen röd färgning och biokemiska lipid beslutsamhet ofta inte stämmer perfekt, båda metoderna producera mycket reproducerbara, statistiskt signifikanta resultat som överensstämmer kvalitativt. Dessutom kan denna metod skräddarsys för att uppfylla de särskilda behoven hos enskilda forskare som kan kräva ytterligare analys av de separata klasser av glykosfingolipider, fosfolipider eller triglycerider som finns i olika prover. Det bör noteras att andra grupper har använt annan teknik THAn SPE att separera lipidklasser före GC / MS 22. Tunnskiktskromatografi (TLC) och högtrycksvätskekromatografi (HPLC) har fördelar jämfört med SPE i att de skulle bättre kunna separata distinkta neutrala lipider (t.ex. TAG, diglycerider, fria fettsyror och kolesterol estrar) från polära lipider (fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin) och glykol-sfingolipider. Vi väljer SPE eftersom det kräver ett minimum av utgångsmaterial (2,500-5,000 maskar), betonas de stora långsiktiga energi-butiker, taggar, som utgör merparten av den neutrala lipidfraktionen 4, och är snabb och kräver ingen speciell utrustning eller plattor. Det bör understrykas att baseras på vanliga blandningar skiljer SPE helt taggar från PL, och är mycket reproducerbar och pålitlig (se figur 5A). Medan kvantifiering och analys av fettsyrametylestrar kräver en GC / MS, är denna utrustning allmänt tillgänglig, och om inte lokalt, prover kangenereras enligt ovan och lagrades vid -80 ° C under kväve tills analys av en medarbetare eller kommersiell GC / MS-tjänsten är anordnad.
I GCMS utgång innehåller högupplösta data på varje fettsyra i varje lipid arter. Detta medger bestämning av detaljerade skillnader jämfört mellan prover. Som ett exempel, kan undersökaren bestämma huruvida nivåerna av vissa fettsyror förändrades i överflöd mer signifikant än andra i daf-2, lpd-3 eller fasn-1 RNAi mot vektorkontroll. Detta oerhört kraftfullt verktyg kan därför ge detaljerad information om vilka lipid arter förändras i överflöd med någon experimentell manipulation.
För vår analys har vi oftast normalisera TAG massa till PL massa. Medan protein eller DNA kan också användas för att normalisera lipid massa efter fastställande av en alikvot av sonikerad mask pellets, finner vi att dessa metoder är föremål för introducerad mänskliga fel under alla pipetteringssteg och prov återhämtning från varje extraktion. Det är av denna anledning som vi valde att istället använda PL massa som vår normalisering faktor. Onaturliga standarder införs i början av protokollet (tritridecanoin för TAG, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) för PL) sker genom alla steg i fast fas extraktion och FAME beredning och garantera kvantitativ och representativ återvinning av både TAG och PL fraktioner. Samma garanti kan inte göras om utredarna använder protein eller DNA för att normalisera TAG massa. Vi tror PL vara den mest robusta spårvidd genom att jämföra TAG nivåer över prover, eftersom det har tidigare visats att PL endast obetydligt ändras genom samma stimulus åstadkommer stora massa förändringar i TAG nivåer, t ex förlängd svält eller ökad motion 34 – 36. PL tros spela en strukturell roll, säkerställa membranfluiditet och cellulär integregrity och signalering roller snarare än som energilagring 37-39. I våra händer, TAG / PL-förhållande närmast motsvarar vad som erhålls genom fixativ-baserade lipid färgning med Nile Red, och håller med den som finns i andra grupper 21. En alternativ strategi används av Watts laboratoriet, där andelen lipid TAG beräknas kontra totala lipider 9,22,29.
Användningen av främmande typer av TAG och PL standarden garanterar att inga infödda fettsyror kommer att ingå i normaliseringen beräkningen. Valet av kedjans längd helt baserad på behovet av dessa standarder för att inte störa masspektra av infödda fettsyror. Vi har funnit att fettsyror av 13:00 och 17:00 tjänar bäst för detta ändamål. Det är möjligt, med tanke på de olika kemiska egenskaperna hos kortare fettsyror, som våra onaturliga fettsyror standarder inte skulle vara representativ för återvinning av alla kedjelängd fettsyror eller kedjor med different mättnad index. Därför är det möjligt att under SPE eller GCMS vi kan se skillnader i effektivitet rening eller detektion mellan lipider med olika kedjelängd. Baserat på detta och olika jonisering av olika fettsyror i GCMS, är det inte möjligt att göra en absolut uttalande om överflödet av varje given fettsyra. Därför jämför vi endast mellan prov inom ett enda experiment bestånd av en viss fettsyra. Om man ville absolut kvantifiera en fettsyra, ett sätt detta skulle kunna uppnås skulle vara att köra ett prov framställt enligt ovan spetsas med en känd mängd av en stabilt isotopmärkt 13 C-versionen av det eller liknande fettsyra, så att det kan vara särskiljas baserat på massa av moderjonen i MSD, till exempel. Med tanke på att vi bara jämför relativa mängderna av lipid klasser eller en viss fettsyra, vår 13:00 TAG och 17:00 PL standarder tjänar detta syfte lämpligt, till minst kostnad,garantera lämplig och representativ återvinning av varje lipid klass.
Fram till denna punkt har det funnits en brist på enighet om tolkningen av vissa resultat som erhållits genom olika metoder, och i vilken de rådande metoderna ska vara. Sammantaget bör det noteras att ingen metod i isolering är idealiskt lämpad för att studera fettmetabolismen i C. elegans. Men genom att använda flera screening och villkor validering kan man uppnå förtroende för data som erhållits för lipid regulatoriska gener. Därför vill vi för vår protokoll för att tjäna som ett riktmärke för framtida arbete inom området C. elegans fett forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Michael Kacergis för tekniskt bistånd och Lianfeng Wu för diskussioner och läsa manuskriptet. Detta arbete stöddes av en karriärutveckling utmärkelse från NIH / NIDDK (K08DK087941 till AAS), en NIH / NIDDK utbildningsstipendium (5T32DK007028 till ECP), den Ellison Medical Foundation Nya Scholar i åldrande Award (till AAS) och Charles H . Hood Foundation Child Health Research Award (till AAS).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-pin replicator | Nunc | 250520 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LB Agar | US Biologicals | L1500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Agarose | Invitrogen | 16500500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Mechanical Pipettors | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Electronic Pipettor | Biohit E Line | E1200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0 Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M MgSO4 | Sigma | M2643 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaCl | Sigma | S5886 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5 mg/ml Cholesterol | Sigma | C8667 | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
200 mg/ml Carbenicillin | US Biologicals | C1100 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
100 mg/ml Ampicillin | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5 mg/ml Tetracycline | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bacto Agar | BD | 214040 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well TC Plates | BD-Falcon | 353072 | For 96-well RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rectangular A/T Plates | Thermo Scientific | 242811 | For stamping RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LB Media | US Biologicals | L1530 | Prepared as per manufacturer instructions | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Deep Well Assay Blocks | Corning | Costar 3960 | Rectangular V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Shallow Well Assay Block | Corning | Costar 3956 | Round V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sterile Sealing Film | VWR | 89134-432 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aluminum Sealing Film | Corning | Costar 6570 | Thermowell Sealing tape for 96-well plates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
M9 Buffer | See Hope et al.20 | See recipe below | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nile red | Invitrogen | N-1142 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Isopropanol | Fisher | BP2632-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-pin aspirator | VP Scientific | VP177A-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Teflon Masked Microscope Slides | Thermo Scientific | Custom | Can also order Trevigen 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Gold-Seal Coverslides | Thermo Scientific | Custom | Can also use second 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deep-well PCR plate | VWR | 89049-178 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-sterile adhesive film | VWR | 60941-070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
High-Throughput Microscope | Leica | DM6000 fully automated with Prior 96-well stage | With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bath Sonicator | Diagenode | Bioruptor XL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Chloroform | Sigma | 366927-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Methanol | Fisher | Optima F456-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phospholipid Standard | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triglyceride Standard | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Wiretrol 50 μl Pipet | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientfic | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Acetone | Sigma | 320110-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sulfuric Acid | Fisher | A300-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hexane | Fisher | Optima H306-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SPE Silica Column | Thermo Scientific | 60108-317 | Hypersep SI, 100 mg resin bed | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Solid Phase Chromatography Manifold | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Pipets | Fisher | 13-678-27F | 10 ml size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-8B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Culture Tubes | Fisher | 14-961-27 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Threaded Borosilicate Tubes | VWR | 14235-460 | 8 ml capacity | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phenolic Caps for Culture Tubes | Fisher | 14-823-211 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GC/MS Autosampler Vials | Agilent | 5188-6592 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Caps for Autosampler Vials | Agilent | 5185-5861 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GC/MS | Agilent | 6890 GC / 5973 MSD | Outfitted with a Supelcowax-10 column | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:
Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:
LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy. 100 mg/ml Ampicillin Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Tetracycline Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container. 200 mg/ml Carbenicillin Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Cholesterol Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months. 1 M MgSO4 Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M CaCl2 Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M KH2PO4, pH 6.0 Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature. 10 N NaOH Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature. 1 M IPTG Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use. Nile red stock solution Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner. Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use. Phospholipid Standard Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. Triglyceride Standard Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. |