نقدم قوية أساليب الكيمياء الحيوية والمجهرية لدراسة<em> Caenorhabditis ايليجانس</em> مخازن الدهون. A، بسيطة السريع، وتحديد إجراءات تلطيخ الفلورسنت الدهون التصوير الحبرية روافع الخواص الطيفية للأحمر محبة للدهون النيل صباغة. ثم نقدم قياس الدهون الثلاثية والبيوكيميائية باستخدام الدهون الفوسفاتية الصلبة استخراج الغاز والمرحلة الطيف اللوني الشامل.
والديدان الخيطية C. كما برز ايليجانس نموذجا هاما لدراسة مسارات الوراثية الحفظ تنظيم التمثيل الغذائي للدهون من حيث صلته السمنة والأمراض البشرية المرتبطة به. المنهجيات السابقة عدة وضعت لتصور C. وقد أثبتت ايليجانس الدهون الثلاثية الغنية مخازن الدهون لتكون خاطئة، وتسليط الضوء مقصورات الخلوية الأخرى من قطرات الدهون. أساليب أخرى تتطلب معدات متخصصة، تستغرق وقتا طويلا، أو تسفر عن نتائج غير متسقة. ونحن نقدم ل، استنساخه السريع، مثبت على أساس تلطيخ حمراء النيل طريقة للكشف السريع والدقيق من قطرات الدهون محايدة في C. ايليجانس. خطوة قصيرة في تثبيت الأيزوبروبانول 40٪ يجعل الحيوانات قابلة للاختراق تماما إلى اللون الأحمر النيل، والذي يستخدم بعد ذلك لوصمة عار الحيوانات. الخواص الطيفية لهذه الصبغة محبة للدهون يسمح لها بقوة وبشكل انتقائي يتألق في الطيف الأصفر والأخضر عند فقط في بيئة غنية بالدهون يمكن، ولكن ليس في أكثرالقطبية البيئات. وهكذا، يمكن أن قطرات الدهون يمكن تصور على المجهر الفلورسنت مجهزة بسيطة GFP قدرة التصوير إلا بعد خطوة قصيرة النيل تلطيخ حمراء في الأيزوبروبانول. السرعة، القدرة على تحمل التكاليف، واستنساخ هذا البروتوكول جعلها مناسبة بشكل مثالي لشاشات إنتاجية عالية. علينا أن نبرهن أيضا وسيلة لتحديد الاقتران البيوكيميائية من الدهون الثلاثية والدهون الفوسفاتية باستخدام الغاز اللوني الطيفي الشامل. وينبغي استخدام هذا البروتوكول أكثر صرامة وتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها من الدهون تقرير الأحمر النيل المجهرية. ونحن نتوقع أن هذه التقنيات سوف تصبح معايير جديدة في مجال C. ايليجانس البحث الأيض.
حفظ المسارات الأيضية بين البشر والديدان الخيطية Caenorhabditis ايليجانس يجعل من كائن نموذج قوي لدراسة السمنة. بينما C. ايليجانس لم يكن لديك الخلايا الشحمية مخصصة لتخزين الدهون في الثدييات مثل، فإنها مخزن الدهون الثلاثية في قطرات الدهون (1) وتملك العديد من المنظمين من نفس تخزين الدهون واستخدام الطاقة 2،3. لفحص لمستويات الدهون في C. ايليجانس، تم اقتراح عدة أساليب مع مستويات مختلفة من سهولة ونجاح. وقد دعا مؤخرا استخدام مرة واحدة مشتركة من الأصباغ، فلوري الحيوية 4-7 في السؤال، وهذه الكواشف ثبت أن تلطيخ مقصورة متميزة من مستودع تخزين الدهون الرئيسية للC. ايليجانس 1،8-11. مثبت على أساس غير الفلورية الأصباغ، مثل الأسود والنفط السودان الحمراء O-، في حين نجحت في تسليط الضوء على قطرات الدهون في الدودة 12-14، كما لم يكن لديك مجموعة كبيرة ديناميكية لتحديد الكميات وfluoresالأصباغ 8،13،15 المائة. وعلاوة على ذلك، الأساليب المتبعة حاليا في تثبيت الأصباغ لكلا الفلورية وغير الفلورسنت، تستغرق وقتا طويلا وتنطوي على عدة خطوات تجميد ذوبان الجليد و / أو استخدام المواد الكيميائية السامة 1،9،10. تم إبلاغ الإدارة عن استخدام الدهون BODIPY محددة النظير التي تحمل علامات لتسليط الضوء على قطرات الدهون عند تغذية الديدان تعيش مع وضع العلامات على المدى القصير 15. ولكن هذا يعتمد على امتصاص الصبغة ومنحازة لذلك من قبل C. ايليجانس المناولة والتمثيل الغذائي للBODIPY النظير الأحماض الدهنية. بديل للدهون، التي أنشئت لتلطيخ الأصباغ هي التسمية خالية ومتماسكة لمكافحة ستوكس نثر رامان (CARS) أو نثر رامان حفز (SRS) المجهري، والتي تستفيد من خصائص مميزة الذبذبات من الجزيئات الدهنية لتصور مخازن الدهون 10،16، 17. ومع ذلك، المعدات المتخصصة مكلفة ضروري لهذا الأسلوب، والإنتاجية منخفضة في أحسن الأحوال.
لتلبية حاجة للanaly وسريعة قابلة للتطويرالهيئة العامة للاستعلامات من مخازن الدهون محايدة في C. ايليجانس البحث الأيضية، ونحن نقدم رواية وطريقة استنساخه للغاية من مثبت القائم على النيل تلطيخ الدهون الحمراء. الخواص الطيفية والفيزيائية والكيميائية للدهون الأحمر صبغ النيل لحث على التحول الأصفر والذهب الأطياف في ذروة الإثارة في الانبعاثات، والسماح لها يتألق في الطيف الأخضر عند الانبعاثات فقط في بيئة غنية بالدهون يمكن، ولكن ليس في البيئات القطبية أكثر 18 ، 19. بالتالي يمكن الكشف عن قطرات الدهون بعد تلطيخ بسيطة عن طريق استخدام فلتر الفلورية الخضراء (GFP) تعيين البروتين للفحص المجهري مضان. سهولة والقدرة على تحمل تكاليف هذه التقنية تجعل من مناسبة بشكل مثالي لشاشات إنتاجية عالية. علينا أن نبرهن أيضا مقترن، طريقة دقيقة جدا لتحديد البيوكيميائية من الدهون الثلاثية والدهون الفوسفاتية باستخدام الصلبة استخراج الغاز والمرحلة الطيف اللوني الشامل. البيوكيميائية قياس الدهون يرتبط بتصميم المجهرية النيل الأحمر القائم على C. ايليجانس كرة القدموينبغي أن تستخدم ر الشامل، وتأكيدا للنتائج التي بعزم الدهون المجهرية.
بروتوكول يسمح لتقديم السريع، وفحص نطاق واسع من مستويات الدهون في C. ايليجانس، والتي يمكن تكييفها بسهولة إلى شاشات إنتاجية عالية. على عكس الأساليب المستخدمة سابقا، والتي تنطوي على خطوة تثبيت مطولة في بارافورمالدهيد تليها دورات تجميد ذوبان الجليد العديد من 8،10، لدينا بروتوكول يتطلب بسيطة دقيقة 3-التثبيت في الأيزوبروبانول. وقد وجدنا أن من تلطيخ C. ايليجانس في الأيزوبروبانول 40٪، فإنها تصبح قابلة للاختراق بحرية إلى الأحمر النيل، دون استخدام خطوات إضافية تجميد ذوبان الجليد أو التثبيت. أيضا، والنيل الأحمر fluoresces انتقائي في حجرات مسعور في الطيف الأخضر 18،19،31، لا destaining ضروري. في المجموع، يمكن أن تؤخذ من الحيوانات لوحات للحيوانات رني صورة الملون وعلى استعداد لفي يزيد قليلا عن 2.5 ساعة. لا يمكن أن يؤديها غير مكلفة نسبيا هذا الأسلوب مع واستنساخ عالية. الأسلوب لا يعتمد على قدرة C. ايليجانس لامتصاص أو التركيزالصبغة، وبالتالي ليس لديها نفس القيود القائمة على استخدام أساليب التغذية الحيوية الأصباغ. نظرا للتكرار ودقة القياسات، وطريقة مناسبة لفحص أعداد كبيرة من الجينات inactivations بواسطة رني. إذا تم تحديد الكميات المطلوبة من مستويات الدهون استنادا إلى تلطيخ مثبت الأحمر النيل، من المستحسن استخدام مكررات من 4-6 البيولوجية مع الضوابط المناسبة واختبار الإحصائية المطبقة.
فمن المرجح أن الجين inactivations مما يؤدي إلى العديد من الحيوانات الصغيرة (بسبب استنساخ رني تسبب تأخر التنمية أو ألقي القبض عليهم) وتخرج من شاشة للمنظمين الدهون، بغض النظر عن أي اتصال التمثيل الغذائي للدهون. في حين أن برنامج تحليل الصور المستخدمة أننا حسابات للديدان من مختلف الأحجام من تطبيع كثافة مضان إلى منطقة دودة، قد الباحثين الفردية تحتاج أيضا إلى النظر في المقارنة بين مستويات الدهون تلطيخ من الحيوانات الصغيرة للحيوانات البرية من نوع المرحلة التنموية مماثلة. في حالة الحيوانات الصغيرة أو القبض تنمويا مع كتلة واضحة منخفض الدهون، فإننا نقترح أن لا طريقة واحدة هي كافية لإثبات تغيير استقلاب الشحوم. يمكن أن يطلب عدة تجارب المتابعة، بما في ذلك SPE-GCMS، للتأكد من وظيفة الدهون التنظيم من هذه الجينات. لمنظم التمثيل الغذائي المعروفة fasn-1، SPE-GCMS تحليل مقارنة المتطابقة تنمويا الحيوانات N2 تحكم L2 كان ضروريا لتأكيد واضح النمط الظاهري قليل الدسم وجدت بالمقارنة مع الحيوانات مراقبة الكبار. بينما الدهون النيل تلطيخ حمراء أشارت انخفاض مستويات الدهون النسبي للسيطرة الكبار رني، بالمقارنة مع مرحلة المطابقة الحيوانات L2 رني السيطرة، ولم يحدث فارق واضح. وفقا لذلك، واستخدام أسلوب الثاني، أي الكمي البيوكيميائية لنسبة TAG / PL كان من الضروري تحديد ذلك fasn-1 هو المنظم الحقيقي لكتلة الدهون، كما fasn-1 رني تكون مميزة كيميائيا من مرحلة المطابقة الحيوانات L2 رني السيطرة.
<p cمعشوقة = "jove_content"> وفي حين نقدم التصوير وتجهيز منصة عالية الإنتاجية، ويمكن بسهولة المجهر تستقيم التقليدية يمكن استخدامها لالتقاط الصور من الديدان التي شنت على منصات الاغاروز 20 أو على الحجم تفلون التقليدية المطبوعة 8 حتي 12 الشرائح المجهر بشكل جيد . والقيد الوحيد هو أنه مع مضان أخضر من قطرات الدهون ملطخة photobleaches الأحمر النيل بسرعة ومنهجية وظروف التعرض موحدة تحتاج إلى استخدامها لضمان إمكانية المقارنة بين الصور. نجد أن المجهر مؤتمتة بالكامل مع شروط الحصول على الصور موحد يعمل على نحو أفضل في هذا الصدد.واحدة من نقاط القوة العظيمة من هذا البروتوكول هو أن يتم جمع الصور بعد يمكن حفظها لمستقبل إعادة التحليل. ويمكن استخدام نفس الصور لتحديد حجم الجسم، بالإضافة إلى محتوى الدهون. علاوة على ذلك، برامج الحاسوبية أصبحت أكثر تقدما، وهناك احتمال واحد للتحليل الدودة، وتوليد نتائج ذات دلالة إحصائيةمن بئر واحد. وبالتالي لدينا طريقة التي تستخدم عالية الإنتاجية المجهري لديها بعض المزايا على الشاشة المنهجيات التي تستخدم نشرت Biosort Copas لتحديد إشارات الفلورسنت 32،33. ومع ذلك، فإن المنهجيات مجانية بالتأكيد.
دقيقة، الكيمياء الحيوية من تقرير المحتوى الدهني بواسطة SPE وGC / MS يؤكد تلطيخ حمراء النيل من مخازن الدهون الرئيسية في C. ايليجانس. على الرغم من أن الكميات المطلقة من تحقيق مثبت تلطيخ الأحمر والنيل البيوكيميائية تقرير الدهون غالبا ما لا تتطابق تماما، وكلاهما الأساليب إنتاج استنساخه للغاية، والنتائج ذات دلالة إحصائية التي توافق نوعيا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون مصممة هذه الطريقة لتلبية الاحتياجات المحددة من الباحثين الفرد الذي قد يتطلب مزيدا من التحليل لفئات منفصلة من الشحميات السفنغولية السكرية، الدهون الفوسفاتية، أو الدهون الثلاثية الموجودة في عينات مختلفة. تجدر الإشارة إلى أن مجموعات أخرى استخدمت تقنية أخرى ثان SPE لفصل الطبقات الدهنية قبل GC / MS 22. طبقة رقيقة اللوني (TLC) وارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC) والمزايا على SPE في أنها قد تكون قادرة على تحسين نسبة الدهون في منفصلة متميزة محايدة (على سبيل المثال TAG، diacylglycerols، والأحماض الدهنية الحرة، واسترات الكولسترول) من الدهون القطبية (فسفاتيديل، فسفاتيديل إيثانولامين) والدهون الإسفنجية جليكول. نختار SPE لأنه يتطلب حدا أدنى من بدء المواد (2،500-5،000 الديدان)، فإنه يؤكد على مخازن كبيرة للطاقة على المدى الطويل، والعلامات، والتي تشكل أكثر من جزء الدهون محايدة 4، وسريع، لا تتطلب معدات متخصصة أو لوحات. وينبغي التأكيد على أن تستند إلى خليط القياسية، SPE يفصل تماما من الكلمات الثابتة والمتنقلة، واستنساخه للغاية ويمكن الاعتماد عليها (انظر الشكل 5A). بينما الكميات وتحليل حمض الدهنية استرات الميثيل يتطلب GC / MS، هذا الجهاز يتوفر عادة، وإذا لم يكن محليا، قد عيناتأن تتولد على النحو الوارد أعلاه وتخزينها في -80 درجة مئوية تحت النيتروجين حتى يتم ترتيب تحليلها من قبل متعاون أو خدمات تجارية GC / MS.
الإخراج GCMS يحتوي على بيانات عالية الدقة على كل الأحماض الدهنية داخل كل نوع الدهون. هذا يسمح بتحديد الاختلافات بين العينات مقارنة مفصلة. وكمثال على ذلك، يمكن للمحقق تحديد ما إذا تم تغيير مستويات معينة من الأحماض الدهنية في وفرة أكبر بكثير من غيرها في DAF-2، LPD-3-1 أو fasn رني مقابل مكافحة النواقل. وهذا يمكن أن توفر أداة قوية جدا لذلك معلومات مفصلة عن الأنواع التي يتم تغيير في وفرة الدهون مع أي تلاعب التجريبية.
لتحليلنا، ونحن في معظم الأحيان إلى تطبيع الشامل TAG الشامل PL. بينما يمكن أيضا البروتين DNA أو استخدامها لتطبيع الشامل الدهون بعد أن تقرر من قسامة من بيليه دودة sonicated، نجد أن هذه الأساليب تخضع إلى intالإنسان الخطأ roduced خلال جميع الخطوات pipetting والانتعاش في كل عينة من الاستخراج. ولهذا السبب اخترنا لاستخدام بدلا PL الشامل، وعامل تطبيع لدينا. معايير غير طبيعية قدم في بداية البروتوكول (tritridecanoin لTAG، 1،2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-الفوسفات-(1'-RAC-الجلسرين) لPL) وتنفذ من خلال جميع الخطوات لاستخراج الطور الصلب و FAME إعداد، وضمان الانتعاش الكمي وممثل لكل من والكسور TAG PL. لا يمكن ضمان نفس بذل المحققون إذا استخدام البروتين أو الحمض النووي لتطبيع الشامل TAG. نعتقد PL أن تكون أقوى مقياس يمكن من خلالها مقارنة مستويات TAG عبر عينات، كما هو موضح في وقت سابق ان وبدقة فقط تغيير PL من قبل نفس الحوافز إحداث تحولات كبيرة في مستويات الشامل TAG والتجويع الموسعة على سبيل المثال أو زيادة ممارسة 34 – 36. ويعتقد PL أن تلعب دورا الهيكلية، وضمان سيولة الغشاء الخلوي والأسواق العالمية ضغطهاgrity والأدوار يشير بدلا من تخزين الطاقة 37-39. في أيدينا، فإن نسبة TAG / PL الأكثر تطابقا يطابق ما يتم الحصول على تلطيخ من الدهون مثبت القائم مع أحمر النيل، وتتفق مع تلك التي وجدت من قبل الجماعات الأخرى 21. ويستخدم استراتيجية بديلة من قبل المختبر واتس، حيث يتم حساب النسبة المئوية للدهن TAG مقابل الدهون الكلية 9،22،29.
استخدام أنواع غير أصلية من وTAG القياسية PL يضمن أنه سيتم إدراج أي الأحماض الدهنية الأصلية في حساب التطبيع. ويستند بحتة اختيار طول السلسلة على ضرورة هذه المعايير لعدم التدخل في أطياف الشامل من الأحماض الدهنية الأصلية. لقد وجدنا أن الأحماض الدهنية من 13:00 17:00 وخدمة أفضل لهذا الغرض. فمن الممكن، وبالنظر إلى خصائص كيميائية مختلفة من الأحماض الدهنية سلسلة أقصر، أن لدينا معايير الأحماض الدهنية غير طبيعية قد لا تكون ممثلة لاسترداد جميع الأحماض الدهنية سلسلة ذات طول أو سلاسل مع فرقمؤشرات التشبع erent. وبالتالي فمن الممكن أنه خلال SPE أو GCMS أننا قد نرى الاختلافات في كفاءة تنقية أو الكشف الدهون من بين أطوال السلسلة مختلفة. بناء على هذا، والتأين مختلفة من الأحماض الدهنية المختلفة في GCMS، فإنه ليس من الممكن لجعل عبارة عن وفرة مطلقة من الحمض الدهني أي معين. لذلك، ما قارنا بين عينات فقط ضمن الكميات المتوفرة تجربة واحدة من الحمض الدهني أي معين. يمكن إذا كان أحد يريد أن quantitate على الاطلاق الأحماض الدهنية، واحدة بطريقة يمكن تحقيق هذا من شأنه أن يكون لتشغيل عينة أعدت على النحو الوارد أعلاه ارتفعت مع كمية معروفة من إصدار ثابت المسمى isotopically C 13 من ذلك أو الأحماض الدهنية مماثلة، بحيث يمكن أن يكون تميز على أساس كتلة أيون الأصل في MSD، على سبيل المثال. نظرا لأننا تقارن سوى كميات النسبية للفئات الدهون أو أي حمض الدهنية نظرا، لدينا TAG 13:00 17:00 والمعايير PL تخدم هذا الغرض على نحو كاف، على الأقل من حيث التكلفة، إلىأؤكد التأهيل وممثل عن كل فئة الدهون.
حتى هذه النقطة، كان هناك عدم وجود توافق في الآراء حول تفسير بعض النتائج التي حصل عليها مختلف المنهجيات، وإلى أي المنهجيات السائدة ينبغي أن يكون. وينبغي أن يلاحظ عموما أن يعتبر مثاليا لا أسلوب واحد في عزلة لدراسة التمثيل الغذائي للدهون في C. ايليجانس. ومع ذلك، باستخدام الفحص متعددة وطرائق التحقق من الصحة، يمكن للمرء أن تحقيق الثقة في البيانات التي تم الحصول عليها على الجينات التنظيمية الدهون. وبالتالي، فإننا نعتزم لبروتوكول لدينا لتكون بمثابة مؤشر للعمل في المستقبل في مجال C. ايليجانس البحث الدهون.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر Kacergis مايكل للمساعدة التقنية ووو Lianfeng للمناقشات وقراءة المخطوط. وأيد هذا العمل من قبل مهنة جائزة التنمية من المعاهد الوطنية للصحة / NIDDK (K08DK087941 لAAS)، والمعاهد الوطنية للصحة / NIDDK التدريب منحة (5T32DK007028 لECP)، واليسون الباحث الطبي الجديد في مؤسسة جائزة الشيخوخة (لAAS)، وتشارلز H . هود صحة الطفل مؤسسة جائزة بحوث (لAAS).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-pin replicator | Nunc | 250520 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LB Agar | US Biologicals | L1500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Agarose | Invitrogen | 16500500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Mechanical Pipettors | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Electronic Pipettor | Biohit E Line | E1200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0 Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M MgSO4 | Sigma | M2643 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaCl | Sigma | S5886 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5 mg/ml Cholesterol | Sigma | C8667 | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
200 mg/ml Carbenicillin | US Biologicals | C1100 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
100 mg/ml Ampicillin | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5 mg/ml Tetracycline | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bacto Agar | BD | 214040 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well TC Plates | BD-Falcon | 353072 | For 96-well RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rectangular A/T Plates | Thermo Scientific | 242811 | For stamping RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LB Media | US Biologicals | L1530 | Prepared as per manufacturer instructions | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Deep Well Assay Blocks | Corning | Costar 3960 | Rectangular V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Shallow Well Assay Block | Corning | Costar 3956 | Round V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sterile Sealing Film | VWR | 89134-432 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aluminum Sealing Film | Corning | Costar 6570 | Thermowell Sealing tape for 96-well plates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
M9 Buffer | See Hope et al.20 | See recipe below | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nile red | Invitrogen | N-1142 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Isopropanol | Fisher | BP2632-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-pin aspirator | VP Scientific | VP177A-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Teflon Masked Microscope Slides | Thermo Scientific | Custom | Can also order Trevigen 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Gold-Seal Coverslides | Thermo Scientific | Custom | Can also use second 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deep-well PCR plate | VWR | 89049-178 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-sterile adhesive film | VWR | 60941-070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
High-Throughput Microscope | Leica | DM6000 fully automated with Prior 96-well stage | With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bath Sonicator | Diagenode | Bioruptor XL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Chloroform | Sigma | 366927-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Methanol | Fisher | Optima F456-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phospholipid Standard | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triglyceride Standard | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Wiretrol 50 μl Pipet | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientfic | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Acetone | Sigma | 320110-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sulfuric Acid | Fisher | A300-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hexane | Fisher | Optima H306-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SPE Silica Column | Thermo Scientific | 60108-317 | Hypersep SI, 100 mg resin bed | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Solid Phase Chromatography Manifold | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Pipets | Fisher | 13-678-27F | 10 ml size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-8B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Culture Tubes | Fisher | 14-961-27 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Threaded Borosilicate Tubes | VWR | 14235-460 | 8 ml capacity | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phenolic Caps for Culture Tubes | Fisher | 14-823-211 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GC/MS Autosampler Vials | Agilent | 5188-6592 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Caps for Autosampler Vials | Agilent | 5185-5861 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GC/MS | Agilent | 6890 GC / 5973 MSD | Outfitted with a Supelcowax-10 column | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:
Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:
LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy. 100 mg/ml Ampicillin Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Tetracycline Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container. 200 mg/ml Carbenicillin Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Cholesterol Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months. 1 M MgSO4 Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M CaCl2 Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M KH2PO4, pH 6.0 Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature. 10 N NaOH Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature. 1 M IPTG Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use. Nile red stock solution Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner. Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use. Phospholipid Standard Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. Triglyceride Standard Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. |