Vi præsenterer robuste biokemiske og mikroskopiske metoder til undersøgelse<em> Caenorhabditis elegans</em> Lipid butikker. En hurtig, simpel, fastsættelse-farvningsprocedure til fluorescerende lipid dråbe imaging udnytter de spektrale egenskaber af det lipofile farvestof Nile red. Derefter præsenterer vi biokemisk måling af triglycerider og phospholipider ved hjælp af fastfase-ekstraktion og gaschromatografi-massespektrometri.
Nematoden C. elegans har vist sig som en vigtig model til undersøgelse af konserverede genetiske veje regulerer fedtstofskiftet som den vedrører human fedme og associerede sygdomme. Flere tidligere metoder udviklet til visualisering af C. elegans triglycerid-rige fedtdepoter har vist sig at være fejlagtige, fremhæver cellulære andre rum end lipiddråber. Andre fremgangsmåder kræver specialiseret udstyr, er tidskrævende, eller give inkonsistente resultater. Vi introducerer en hurtig, reproducerbar, fixativ-baserede Nile rødfarvning metode til nøjagtig og hurtig påvisning af neutrale lipiddråber i C. elegans. En kort fiksationstrin i 40% isopropanol gør dyrene fuldstændig permeable for Nile rødt, som derefter anvendes til at farve dyr. Spektrale egenskaber af dette lipofile farvestof gør det muligt at kraftigt og selektivt fluorescerer i det gul-grønne spektrum, når i et lipid-rigt miljø, men ikke i merepolære miljøer. Således kan lipiddråber visualiseres på et fluorescensmikroskop udstyret med enkle GFP billeddannende evne efter kun en kort Nile rødfarvning trin i isopropanol. Hastigheden, overkommelige priser, og reproducerbarhed af denne protokol gør det ideelt til high throughput skærme. Vi viser også en parret fremgangsmåde til biokemisk bestemmelse af triglycerider og phospholipider ved hjælp af gaschromatografi massespektrometri. Denne mere rigoristiske protokol bør anvendes som bekræftelse af resultater opnået fra Nilen rød mikroskopisk lipid beslutsomhed. Vi forventer, at disse teknikker vil blive nye standarder inden for C. elegans metabolisk forskning.
Bevarelse af metaboliske veje mellem mennesker og nematoden Caenorhabditis elegans gør det til en kraftig modelorganisme til undersøgelse af fedme. Mens C. elegans har ikke adipocyter dedikeret til fedt oplagring ligesom hos pattedyr, de gør butik triglycerider i lipiddråber 1 og besidder mange af de samme regulatorer af fedt oplagring og anvendelse af energi 2,3. Til analyse for fedt i C. elegans, er flere metoder blevet foreslået med varierende niveauer af lethed og succes. Den engang så udbredte brug af fluorescerende, vitale farvestoffer 4-7 nylig blev draget i tvivl, og disse reagenser viste sig at komme pletter et rum adskilt fra de vigtigste fedt lager af C. elegans 1,8-11. Fikservæske-baserede ikke-fluorescerende farvestoffer, såsom Sudan sort og olie-rød-O, mens succes med at fremhæve lipiddråber i ormen 12-14, ikke har så stort et dynamikområde til kvantificering som fluorescerendecent farvestoffer 8,13,15. Endvidere nuværende metoder til fiksering for både fluorescerende og ikke-fluorescerende farvestoffer er tidskrævende og involverer flere fryse-tø trin og / eller anvendelsen af toksiske kemikalier 1,9,10. Anvendelsen af specifikke BODIPY-mærket lipid-analoger er blevet rapporteret at fremhæve lipiddråber, når tilføres til levende orme med kortvarig mærkning 15. Men dette er afhængig af optagelse af farvestoffet og derfor forspændt ved C. elegans håndtering og metabolisme af BODIPY fedtsyreanaloger. En etableret alternativ til lipid-farvning farvestoffer er etiket-fri, sammenhængende anti-Stokes Raman spredning (CARS) eller stimuleret Raman spredning (SRS) mikroskopi, som udnytter de karakteristiske vibrationelle egenskaber af lipidmolekyler at visualisere fedtdepoter 10,16, 17. Imidlertid dyrt specialudstyr er nødvendigt for denne metode, og gennemløbet er lav i bedste.
For at opfylde et behov for hurtig, skalerbar anasis af neutralt lipid butikker i C. elegans metabolisk forskning, vi indfører en roman, meget reproducerbar metode til fixativ-baserede Nile rød lipidfarvningen. Spektrale og fysisk-kemiske egenskaber af den lipofile farvestof Nile red inducere en gul-guld-spektral forskydning i sin excitation-emission peak, gør det muligt at fluorescere i den grønne emissionsspektret når den er i en lipid-rigt miljø, men ikke i mere polære miljøer 18 , 19. Således lipiddråber kan detekteres efter simpel farvning ved anvendelse af et grønt fluorescerende protein (GFP) filter indstillet til fluorescensmikroskopi. Den lethed og overkommelige af denne teknik gør det ideelt til high throughput skærme. Vi viser også en parret, stringent fremgangsmåde til biokemisk bestemmelse af triglycerider og phospholipider ved hjælp af fastfase-ekstraktion og gaschromatografi-massespektrometri. Biochemical lipid måling korrelerer med Nile red-baseret mikroskopisk bestemmelse af C. elegans fat masse, og bør bruges som en bekræftelse af konklusionerne med mikroskopisk lipid beslutsomhed.
Den præsenterede protokol tillader hurtig, omfattende screening af lipidniveauer i C. elegans, som let kan tilpasses til højt gennemløb skærme. Modsætning til tidligere anvendte fremgangsmåder, der medfører en langvarig fiksering trin i paraformaldehyd efterfulgt af flere fryse-tø cykler 8,10, kræver vores protokol en simpel 3-min fiksering i isopropanol. Det har vist sig, at ved farvning C. elegans i 40% isopropanol, de bliver frit permeabel for Nile rødt, uden brug af yderligere fryse-tø-eller fiksering trin. Også, som Nile rødt selektivt fluorescerer i hydrofobe rum i den grønne spektrum 18,19,31, ingen affarvning er nødvendig. I alt kan dyrene tages fra RNAi plader til indfarvede og klar til billede dyr i lidt over 2,5 timer. Denne fremgangsmåde kan udføres relativt billigt og med høj reproducerbarhed. Fremgangsmåden er ikke afhængig af evnen af C. elegans til optagelse eller koncentratfarvestoffet, og derfor ikke har de samme begrænsninger som fodring baserede metoder ved hjælp af vitale farvestoffer. Given reproducerbarhed og præcision, er fremgangsmåden egnet til screening af store antal gen inactivations ved RNAi. Hvis kvantificering af lipidniveauer ønskes baseret på fiksativ Nile rødfarvning, anbefaler vi brug på 4-6 biologisk replikater med de relevante kontroller og statistisk anvendt test.
Det er sandsynligt, at mange gen inactivations fører til små dyr (på grund af RNAi kloner forårsager forsinket eller arresteret udvikling) ville komme ud af en skærm for fede regulatorer, uanset enhver forbindelse til fedtforbrændingen. Mens billedet analyseprogram vi udnyttet konti for orme af forskellige størrelser ved at normalisere fluorescensintensiteten til ormen område, kan de enkelte forskere også overveje at sammenligne de fede farvningsegenskaber niveauer af små dyr til vildtype dyr på tilsvarende udviklingstrin. Itale om små eller udviklingsmæssigt anholdt dyr med tilsyneladende lavt fedtmasse, foreslår vi, at ingen enkelt modalitet er tilstrækkelig til at påvise ændret lipidmetabolisme. Adskillige opfølgende forsøg, herunder SPE-GCMS, kunne være forpligtet til at fastslå lipid-regulerende funktion af disse gener. For kendt metabolisk regulator fasn-1, SPE-GCMS-analyse sammenlignet med udviklingsmæssigt matchede N2 L2 kontroldyr var nødvendigt at bekræfte den tilsyneladende fedtfattig fænotype fundet, når sammenlignet med voksne kontroldyr. Mens Nile rødt fedt farvning angivet lavere fedtindhold i forhold til kontrol voksen RNAi, sammenlignet med fase-matchede L2 kontrol RNAi dyr, blev ingen åbenlyse forskelle ses. Følgelig anvendelse af en anden metode blev dvs biokemisk kvantificering af TAG / PL-forhold nødvendigt at bestemme, at fasn-1 er en sand regulator af fedtmasse, som fasn-1 RNAi er biokemisk skelnes fra fase-matchede L2 kontrol RNAi dyr.
<p cLass = "jove_content"> Selvom vi præsenterer billedbehandling og behandling til en high-throughput platform, kan et konventionelt opretstående mikroskop nemt bruges til at fange billeder fra orme monteret på agarose puder 20 eller på konventionel størrelse Teflon-trykte 8 til 12 og mikroskopobjektglas . Den eneste begrænsning er, at den grønne fluorescens af lipiddråber farvet med Nile Red photobleaches hurtigt, systematisk, ensartet eksponeringsbetingelser skal bruges til at sikre sammenlignelighed mellem billeder. Vi finder, at en fuldt automatiseret mikroskop med ensartede Image Acquisition betingelser virker bedst til dette formål.En af de store styrker ved denne protokol er, at efter billederne indsamles de kan gemmes til senere re-analyse. De samme billeder kan anvendes til at bestemme kropsstørrelse foruden fedtindhold. Desuden som beregningsmæssige programmer bliver mere avancerede, er der udsigt til en enkelt orm analyse, genererer statistisk signifikante resultaterfra en enkelt boring. Således vores metode, der anvender high-throughput mikroskopi har nogle fordele i forhold til offentliggjorte skærm metoder, der bruger en Copas Biosort at kvantificere fluorescerende signaler 32,33. Men de metoder er absolut gratis.
Præcis, biokemisk bestemmelse af fedtindholdet ved SPE og GC / MS bekræfter Nilen rødfarvning af de store fedtdepoter i C. elegans. Selv om den absolutte kvantificering opnås fra fiksativ Nile rød farvning og biokemisk lipid beslutsomhed ofte ikke passer perfekt, begge metoder producere meget reproducerbare, statistisk signifikante resultater, der er enige kvalitativt. Desuden kan denne fremgangsmåde tilpasses til at opfylde de specifikke behov hos individuelle forskere, som kan kræve yderligere analyse af de separate klasser af glycosphingolipider, phospholipider eller triglycerider til stede i forskellige prøver. Det skal bemærkes, at andre grupper har brugt teknologi andre than SPE at adskille lipidklasser Inden GC / MS 22. Tyndtlagskromatografi (TLC) og højtryksvæskekromatografi (HPLC) har fordele i forhold SPE, idet de kunne være i stand til bedre separate forskellige neutrale lipider (fx TAG, diacylglyceroler, frie fedtsyrer og cholesterol estere) fra polære lipider (phosphatidylcholin, phosphatidylethanolamin) og glycol-sphingolipider. Vi vælger SPE, fordi det kræver et minimum af udgangsmateriale (2,500-5,000 orme), det fremhæver de store langsigtede energipolitiske butikker, Tags, der udgør det meste af det neutrale lipid fraktion 4, og er hurtig og kræver ingen specialiseret udstyr eller plader. Det skal understreges, at på grundlag af standardblandinger, SPE fuldstændigt adskiller TAG fra PL'er, og er yderst reproducerbar og pålidelig (se figur 5A). Mens kvantificering og analyse af fedtsyremethylestere kræver en GC / MS, dette udstyr er almindeligt tilgængelige, og hvis ikke lokalt, prøver kangenereres som ovenfor og opbevaret ved -80 ° C under nitrogen indtil analyse ved aktiv eller kommercielt GC / MS tjenesten er anbragt.
Den GCMS output indeholder højopløselige data om hver fedtsyre inden for hver lipidarter. Dette tillader bestemmelse af detaljerede sammenlignet forskelle mellem prøver. Som et eksempel kunne undersøgeren afgøre, om niveauerne af visse fedtsyrer blev ændret i overflod mere signifikant end andre i DAF-2, lpd-3 eller fasn-1 RNAi versus vektorkontrol. Denne enormt kraftfulde værktøj kan derfor give detaljerede oplysninger om, hvor lipidarter ændres i overflod med nogen eksperimentel manipulation.
For vores analyse, oftest vi normalisere TAG masse til PL masse. Mens protein eller DNA også kan anvendes til at normalisere lipid masse efter bestemmelse af en alikvot af sonikerede orm pellet, finder vi, at disse metoder er omfattet af introduced menneskelig fejl under alle pipetteringstrin og i prøven fra hver ekstraktion. Det er grunden til, at vi valgte at i stedet bruge PL masse som vores normalisering faktor. Unaturlige standarder indføres ved starten af protokollen (tritridecanoin for TAG, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) for PL) føres gennem alle trin af fastfaseekstraktion og FAME forberedelse, og sikre kvantitativ og repræsentativ inddrivelse af både TAG og PL fraktioner. Det samme garanti kan ikke foretages, hvis efterforskere bruge protein eller DNA til at normalisere TAG masse. Vi mener PL for at være den mest robuste sporvidde ved at sammenligne TAG niveauer på tværs af prøver, som det tidligere er blevet vist, at PL kun minutiøst ændres af den samme stimulus bevirke stor masse forskydninger i TAG niveauer, f.eks udvidet sult eller øget motion 34 – 36. PL menes at spille en strukturel rolle, sikrer membranfluiditet og cellulære integrity og signalanlæg roller snarere end som energilager 37-39. I vores hænder, mest TAG / PL-forholdet svarer til det opnås ved fiksativ-baserede lipidfarvningen med Nile rødt, og er enig med den, der findes af andre grupper 21. En alternativ strategi anvendes af Watts laboratoriet, hvor procentdelen af lipid TAG beregnes versus total lipider 9,22,29.
Brugen af ikke-hjemmehørende typer af TAG og PL standard sikrer, at ingen indfødte fedtsyrer vil blive medtaget i normaliseringen beregningen. Valget af kædelængden er udelukkende baseret på behovet af disse standarder til ikke interfererer med massespektre af native fedtsyrer. Det har vist sig, at fedtsyrer 13:00 og 17:00 tjene bedst til dette formål. Det er muligt på grund af de forskellige kemiske egenskaber af kortere kædede fedtsyrer, at vores unaturlige fedtsyrer standarder måske ikke repræsentativ for at hente alle kædelængde fedtsyrer eller kæder med different mætning indekser. Det er således muligt, at der i SPE eller GCMS vi kan se forskelle i effektiviteten af oprensning eller detektion mellem lipider med forskellige kædelængder. Baseret på denne og de forskellige ionisering af forskellige fedtsyrer i GCMS, er det ikke muligt at foretage en absolut erklæring om forekomsten af en given fedtsyre. Derfor har vi kun sammenligne mellem prøver inden et enkelt eksperiment mængderne af enhver given fedtsyre. Hvis man ønskede at absolut kvantificering en fedtsyre, en måde dette kan opnås er at køre en prøve, fremstillet som ovenfor tilsat en kendt mængde af en stabilt isotopmærket 13C version af denne eller tilsvarende fedtsyre, således at det kunne være skelnes baseret på massen af moderion i MSD, f.eks. Da vi kun sammenligner relative mængder af lipidklasser eller enhver given fedtsyre, vores 13:00 TAG og 17:00 PL-standarder tjener dette formål tilstrækkeligt, på et minimum af omkostninger, atsikre en passende og repræsentative genopretning af hver lipid-klasse.
Indtil dette punkt, har der været en mangel på konsensus med hensyn til fortolkningen af visse resultater opnået ved forskellige metoder, og i hvilket de fremherskende metoder bør være. Samlet skal det bemærkes, at ingen fremgangsmåde isoleret ideelt egnet til at studere fedtstofskiftet i C. elegans. Men ved hjælp af multiple screening og validering modaliteter, kan man opnå tillid til data opnået på lipid regulatoriske gener. Således agter vi for vores protokol til at tjene som et benchmark for det fremtidige arbejde på området C. elegans fedt forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Michael Kacergis til teknisk bistand og Lianfeng Wu til diskussioner og læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en karriereudvikling udmærkelse fra NIH / NIDDK (K08DK087941 til AAS), en NIH / NIDDK træning tilskud (5T32DK007028 til ECP), den Ellison Medical Foundation New Scholar i Aging Award (til AAS) og Charles H . Hood Foundation Child Health Research Award (til AAS).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-pin replicator | Nunc | 250520 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LB Agar | US Biologicals | L1500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Agarose | Invitrogen | 16500500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Mechanical Pipettors | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Electronic Pipettor | Biohit E Line | E1200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0 Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M MgSO4 | Sigma | M2643 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaCl | Sigma | S5886 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5 mg/ml Cholesterol | Sigma | C8667 | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
200 mg/ml Carbenicillin | US Biologicals | C1100 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
100 mg/ml Ampicillin | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5 mg/ml Tetracycline | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bacto Agar | BD | 214040 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well TC Plates | BD-Falcon | 353072 | For 96-well RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rectangular A/T Plates | Thermo Scientific | 242811 | For stamping RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LB Media | US Biologicals | L1530 | Prepared as per manufacturer instructions | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Deep Well Assay Blocks | Corning | Costar 3960 | Rectangular V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Shallow Well Assay Block | Corning | Costar 3956 | Round V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sterile Sealing Film | VWR | 89134-432 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aluminum Sealing Film | Corning | Costar 6570 | Thermowell Sealing tape for 96-well plates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
M9 Buffer | See Hope et al.20 | See recipe below | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nile red | Invitrogen | N-1142 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Isopropanol | Fisher | BP2632-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-pin aspirator | VP Scientific | VP177A-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Teflon Masked Microscope Slides | Thermo Scientific | Custom | Can also order Trevigen 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Gold-Seal Coverslides | Thermo Scientific | Custom | Can also use second 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deep-well PCR plate | VWR | 89049-178 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-sterile adhesive film | VWR | 60941-070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
High-Throughput Microscope | Leica | DM6000 fully automated with Prior 96-well stage | With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bath Sonicator | Diagenode | Bioruptor XL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Chloroform | Sigma | 366927-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Methanol | Fisher | Optima F456-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phospholipid Standard | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triglyceride Standard | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Wiretrol 50 μl Pipet | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientfic | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Acetone | Sigma | 320110-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sulfuric Acid | Fisher | A300-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hexane | Fisher | Optima H306-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SPE Silica Column | Thermo Scientific | 60108-317 | Hypersep SI, 100 mg resin bed | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Solid Phase Chromatography Manifold | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Pipets | Fisher | 13-678-27F | 10 ml size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-8B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Culture Tubes | Fisher | 14-961-27 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Threaded Borosilicate Tubes | VWR | 14235-460 | 8 ml capacity | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phenolic Caps for Culture Tubes | Fisher | 14-823-211 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GC/MS Autosampler Vials | Agilent | 5188-6592 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Caps for Autosampler Vials | Agilent | 5185-5861 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GC/MS | Agilent | 6890 GC / 5973 MSD | Outfitted with a Supelcowax-10 column | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:
Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:
LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy. 100 mg/ml Ampicillin Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Tetracycline Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container. 200 mg/ml Carbenicillin Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Cholesterol Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months. 1 M MgSO4 Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M CaCl2 Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M KH2PO4, pH 6.0 Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature. 10 N NaOH Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature. 1 M IPTG Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use. Nile red stock solution Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner. Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use. Phospholipid Standard Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. Triglyceride Standard Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. |