גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em> דרוזופילה melanogaster</em
Summary
כלי optogenetic מקודד גנטי מאפשרים מניפולציה לא פולשנית של תאי עצב ספציפיים ב<em> דרוזופילה</em> מוח. כלים כאלה יכולים לזהות נוירונים הפעלה שדי בכך כדי לעורר או לדכא התנהגויות מסוימות. כאן אנו מציגים שיטה להפעלת Channelrhodopsin2 המתבטאת בתאי עצב ממוקדים בזבובי חופשיות הליכה.
Abstract
מספר הולך וגדל של כלים גנטיים מקודדים הופכים זמין המאפשר מניפולציה לא פולשנית של הפעילות העצבית של הנוירונים ספציפיים בדרוזופילה melanogaster 1. ראשי בין אלה הם כלי optogenetic, המאפשרים הפעלה או ההשתקה של תאי עצב מסוים בחיים השלמים ונעו בחופשיות באמצעות אור בהיר. Channelrhodopsin (ChR2) הוא ערוץ קטיון אור פעיל, שכאשר מופעלים על ידי אור כחול, גורם לאובדן קיטוב של נוירונים שמבטאים אותו. ChR2 היה יעיל לזיהוי תאי עצב קריטיים להתנהגויות ספציפיות, כגון הימנעות 2 CO, סיומת חוטם ותגובה בהלה תיווך ענקי בסיבי 2-4. עם זאת, כמקורות האור החזקים המשמשים כדי לעורר ChR2 גם לעורר photoreceptors, טכניקות optogenetic אלה לא עודכנה בעבר בשימוש במערכת הראייה. כאן, אנו משלבים גישת optogenetic עם מוטציה הפוגעת phototransduction להדגמהnstrate כי הפעלת מקבץ של נוירונים נול רגישים באונה האופטית של הזבוב, Foma-1 נוירונים, יכול לנהוג התנהגות בריחה המשמשת למניעת התנגשות. אנחנו השתמשנו אלל ריק של רכיב חיוני של מפל phototransduction, פוספוליפאז C-β, מקודד על ידי גן norpA, כדי להבהיר את הזבובים עיוורים וגם להשתמש במערכת activator תעתיק Gal4-כטב"מ לנהוג ביטוי של ChR2 בפומה-1 הנוירונים. זבובים בודדים מונחים על משטח קטן המוקפים נוריות כחולות. כאשר הנוריות מוארות, עף במהירות המראה לטיסה, באופן דומה להתנהגות מונעת חזותי נול-בריחה. אנו מאמינים כי טכניקה זו ניתן להתאים בקלות כדי לבחון התנהגויות אחרות בהעברת זבובים בחופשיות.
Introduction
ארסנל גובר של כלים גנטיים מקודדים פותח כדי לתפעל פעילות עצבית בתאים ספציפיים בדרוזופילה melanogaster 1. כלים אלה מאפשרים הפעלה או השתקה לא פולשנית של תאי עצב מסוימים בחיים השלמים ונעו בחופשיות. בין אלה, Channelrhodopsin2 (ChR2), ערוץ קטיון אור פעיל, מציע יתרונות חשובים, שכן הוא יכול להיות נשלט באופן זמני ומושרה במהירות. כאשר נוירונים ההמפורש ChR2 נחשפים לאור בהיר כחול (470 ננומטר) שהם במהירות depolarize ולהציג שיעורי ירי גבוה 3-5. הפעלה ממוקדת כגון תאי עצב ספציפי בבעלי חיים שנעו בחופשיות חשפה את התלות של נוירונים מסוימים להתנהגויות כגון הימנעות 2 CO 3, חוטם 2,4 הארכה, ותגובות בהלה בתיווך ענקי בסיבי 4. עם זאת, כמקורות האור החזקים הדרושים כדי לעורר ChR2 גם לעורר photoreceptors, החלת אופטכניקות togenetic למערכת הראייה היו מוגבלות. על ידי שילוב של גישת optogenetic עם מוטציה הפוגעת phototransduction, אנו מראים כי הפעלה של אשכול ספציפי של תאי עצב באונה האופטית של הזבוב יכולה לנהוג התנהגות הבריחה המשמשת למניעת התנגשות 6.
רוב, אם לא כל, חיות חזותיות מפגינות התנהגות בריחה כדי למנוע התנגשויות עם אובייקטים מתקרבים. הליכה או נייח זבובים, כאשר הציגו עם התנגשות ממשמשת ובאה, המראה לטיסה, הרחק מההתנגשות המתקרבת 7-9. המראות אלו מאופיינים בכנפיים לפני ההמראה ומסלול טיסה יציבה 10,11 שהועלו. תגובה זו שונה מהתגובה ענקית בסיבי תיווך הלה, הקפיצות שלא קדמו להם כנפיים שהועלו, ובדרך כלל תוצאה של נפילה בנפילה חופשיה-4,9. לאחר זיהה אשכול ספציפי של תאי עצב רגיש נול באונה האופטית, Foma-1 נוירונים, שהם uniquאיליי מכוון כדי לקודד אובייקטים מתקרבים, בקשו לחקור את מעורבותם בהתנהגות בריחת נולו של הזבוב. כאן אנו מדגימים את שימוש optogenetics סלקטיבי להפעלת הנוירונים האלה וגרם להתנהגות בריחתו של הזבוב.
אנו משתמשים במערכת activator תעתיק Gal4-כטב"מ לנהוג ביטוי של ChR2 בנוירונים Foma-1. ChR2 דורש cofactor כל טרנס הרשתית וזה נמצא ברמות נמוכות במערכת העצבים המרכזית תסיסנית יש להשלימו בתזונה של הזבובים. 3,4 כאור בהיר משמש להפעלת ChR2 וזבובים מפגינים התנהגויות phototactic חזקות 12, שבקשנו לשלול את האפשרות של תגובה לגירוי ויזואלי. כדי לעשות זאת, השתמש בעלי חיים שהיו מוטצית הומוזיגוטים לאלל ריק של גן norpA, אשר מקודד מרכיב קריטי של מפל phototransduction, C-β פוספוליפאז. קולטני אור בזבובים מוטנטיים כאלה אינם מסוגלים responד להדליק 13. כדי לבדוק את גירוי optogenetic של תגובת הבריחה, אנחנו צריכים לבודד זבוב אחד ולשטוף אותו באור כחול בהיר. כדי לעשות זאת, אנו שמים זבובים בודדים בטיפי pipet. טיפ pipet אחד ממוקם בבעל מותאם אישית, כגון שזבוב geotactically יצעד טיפ ויצא על גבי פלטפורמה מלבנית. הזבוב הוא מסוגל ללכת בחופשיות על גבי פלטפורמה זו. הפלטפורמה היא מוקפת בארבעה מערכים LED כחולים, כל 3 נוריות המכילות, התמקדו בחלק העליון של הפלטפורמה. אחרי הזבוב הוא על הרציף, הנוריות מוארות, ותגובתו של הזבוב נרשמת באמצעות מצלמה במהירות גבוהה 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנחנו הוכחנו גירוי optogenetic של התנהגויות בריחה ידי רחיצת הליכת זבובים באור כחול בהיר באופן חופשי. גישה זו ניתן להתאים בקלות כדי לבחון התנהגויות אחרות בזבובי חופשיות הליכה, וניתן לשנותם לפלטפורמות גדולות יותר, פשוט על ידי ריצוף את מערכי LED ששמשנו אותנו על פני שטח גדו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מלגת הדיקן של אוניברסיטת סטנפורד (SEJdV), מכונים לאומיים פרס פיוניר מנהל בריאות (TRC DP0035350), פרס קרן מק 'נייט של Scholar (TRC) וR01 EY022638 (TRC).
Materials
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific & Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼” ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼” NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 |
References
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O’Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
