Optogenetic Stimulering af flugt Opførsel i<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Genetisk kodede optogenetic værktøjer muliggør invasiv manipulation af specifikke neuroner i<em> Drosophila</em> Hjernen. Sådanne redskaber kan identificere neuroner, hvis aktivering er tilstrækkelig til at fremkalde eller undertrykke bestemte adfærd. Her præsenterer vi en metode til aktivering Channelrhodopsin2 der er udtrykt i målrettede neuroner i frit gå fluer.
Abstract
Et stigende antal genetisk kodede værktøjer på vej, som tillader ikke-invasiv manipulation af den neurale aktivitet af specifikke neuroner i Drosophila melanogaster 1. Chief blandt disse er optogenetic værktøjer, der gør det muligt for aktivering eller undertrykkelse af bestemte neuroner i den intakte og frit flytte dyr ved hjælp af skarpt lys. Channelrhodopsin (CHR2) er en lysaktiveret kation-kanal, der, når de aktiveres af blåt lys, forårsager depolarisering af neuroner, som udtrykker det. CHR2 har været effektiv til at identificere neuroner kritiske for aktivitet, såsom CO 2 unddragelse, snabel udvidelse og gigant-fiber medieret respons på lyd 2-4. Da de stærke lyskilder anvendes til at stimulere CHR2 også stimulere fotoreceptorer har disse optogenetic teknikker ikke tidligere været anvendt i det visuelle system. Her kombinerer vi en optogenetic tilgang med en mutation, som forringer fototransduktionen til demonstrate at aktivering af en klynge af væven-følsomme neuroner i flue optiske lap, FOMA-1 neuroner, kan køre en flugt adfærd bruges til at undgå kollision. Vi anvendte en nul allel af et kritisk element i lysoverførelsen, til phospholipase C-β, der kodes for af norpA genet, gør flyver blinde og også bruge Gal4-UAS transkriptionsaktivator system til at drive ekspression af CHR2 i Foma-1 neuroner. Individuelle fluer er placeret på en lille platform omgivet af blå lysdioder. Når lysdioderne lyser, den flyver hurtigt take-off i flyvning, på en måde der ligner visuelt drevet væven-escape adfærd. Vi mener, at denne teknik kan let tilpasses til at undersøge andre adfærd i frit flytte fluer.
Introduction
Et stigende arsenal af genetisk kodede værktøjer er blevet udviklet til at manipulere neurale aktivitet i specifikke celler i Drosophila melanogaster 1. Disse værktøjer gør det muligt noninvasive aktivering eller undertrykkelse af bestemte neuroner i den intakte og frit flytte dyr. Blandt disse giver Channelrhodopsin2 (CHR2), en lysaktiveret kation-kanal, vigtige fordele, eftersom den kan temporært reguleres og hurtigt induceres. Når neuroner, som udtrykker CHR2 er udsat for lys blå (470 nm) lys, de hurtigt depolarisere og udviser forhøjede fyring satser 3-5. En sådan målrettet aktivering af specifikke neuroner i frit bevægelige dyr har afsløret tilstrækkeligheden af bestemte neuroner for adfærd, såsom CO 2 unddragelse 3, snabel udvidelse 2,4, og gigant-fiber medierede startle svar 4. Men da de intense lyskilder nødvendige for at stimulere CHR2 også stimulere fotoreceptorer, anvender optogenetic teknikker til det visuelle system har været begrænset. Ved at kombinere en optogenetic tilgang med en mutation, som forringer fototransduktionen har vi vist, at aktivering af en bestemt klynge af neuroner i flue optiske lap kan drive escape opførsel anvendes til at undgå kollision 6.
De fleste, hvis ikke alle, visuelle dyr udviser en flugt adfærd for at undgå kollisioner med modkørende objekter. Gåture eller stationær fluer, når de præsenteres med en truende kollision, take-off i flugt, væk fra modkørende kollision 7-9. Disse take-offs er kendetegnet ved hævede vinger før take-off og en ustabil flyveveje 10,11. Denne reaktion er forskellig fra den gigantiske fiber medieret startle response, hopper, der ikke indledes med hævede vinger, og som regel resultere i en frit faldende tørre 4,9. Efter at have identificeret en bestemt klynge af væven følsomme neuroner i den optiske lap, Foma-1 neuroner, som er UNIQUely tunet til at indkode nærmer objekter, vi søgte at sondere deres engagement i flue Loom flugt adfærd. Her har vi demonstrere brugen af optogenetics til selektivt at aktivere disse neuroner og fremkalde fluen flugt adfærd.
Vi bruger den Gal4-UAS transkriptionsaktivator system til at drive ekspressionen af CHR2 i FOMA-1 neuroner. CHR2 kræver cofaktor all-trans-retinal og da dette er fundet i lave niveauer i Drosophila centralnervesystemet den skal suppleres i fluerne "kost. 3,4 Som skarpt lys anvendes til at aktivere CHR2 og fluer udviser stærke phototactic adfærd 12, har vi forsøgt at eliminere muligheden for en visuel reaktion på stimulus. For at gøre dette har vi benyttet dyr, der var homozygote mutant i en nul-allel af norpA genet, som koder for et afgørende element i lysoverførelsen, phospholipase C-β. Fotoreceptorer i sådanne mutante fluer er i stand til at respond til lys 13. For at teste optogenetic stimulering af flugt reaktion, er vi nødt til at isolere en enkelt flue og bade det i lyse blå lys. For at gøre dette, vi anbringe de enkelte fluer i pipettespidser. En pipettespids er anbragt i en tilpasset holder, således at flyve geotactically vil gå op spidsen og ud på en rektangulær platform. Fluen er i stand til frit gå rundt på toppen af denne platform. Platformen er omgivet af fire blå LED arrays, der hver indeholder tre lysdioder, der fokuserer på toppen af platformen. Efter fluen er på platformen, er lysdioderne lyser, og fluen svar er optaget på en high-speed kamera 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har vist optogenetic stimulering af flugtveje adfærd ved at bade frit vandre fluer i lyse blå lys. Denne fremgangsmåde kan let tilpasses til at undersøge andre adfærd i fritgående fluer, og kan skaleres til større platforme ved blot flisebelægning af LED arrays vi brugte over et større område. Brug enten den billige kamera beskriver vi, eller andre tilgængelige kamerasystemer, kan brugeren skræddersy frame rate og rumlig opløsning af billederne erhvervet så de passer til opførsel af interesse. De…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af en Stanford Dean Fellowship (SEJdV), en National Institutes of Health direktørs Pioneer Award (TRC DP0035350), en McKnight Foundation Scholar Award (TRC) og R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific & Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼” ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼” NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 |
References
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O’Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
