Optogenetische Stimulation von Escape Verhalten in<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Genetisch kodierte optogenetische Tools ermöglichen invasiven Manipulation von spezifischen Neuronen in der<em> Drosophila</em> Brain. Solche Tools identifizieren können Neuronen, deren Aktivierung ist ausreichend, um zu entlocken oder unterdrücken bestimmte Verhaltensweisen. Hier präsentieren wir ein Verfahren zur Aktivierung Channelrhodopsin2, die in gezielten Neuronen in frei zu Fuß Fliegen ausgedrückt wird.
Abstract
Eine wachsende Zahl von genetisch kodierte Werkzeuge sind immer zur Verfügung, dass auch nicht-invasive Manipulation der neuronalen Aktivität bestimmter Neuronen in Drosophila melanogaster 1. Chef unter diesen sind optogenetische Werkzeuge, die die Aktivierung oder Inaktivierung von bestimmten Nervenzellen im intakten und sich frei bewegenden Tieren mit hellem Licht zu ermöglichen. Channelrhodopsin (ChR2) ist ein Licht-aktivierten Kationen-Kanal, die, wenn sie von blauem Licht aktiviert, verursacht Depolarisation von Neuronen, sie auszudrücken. ChR2 wurde zur Identifizierung Neuronen entscheidend für bestimmte Verhaltensweisen, wie z. B. CO 2-Vermeidung, Rüssel Erweiterung und Riesen-Faser-vermittelten Schreckreaktion 2-4 wirksam. Da jedoch die intensive Lichtquellen verwendet werden, um ChR2 auch stimulieren stimulieren Photorezeptoren haben diese optogenetische Techniken bisher nicht in das visuelle System verwendet worden. Hier bündeln wir eine optogenetische Ansatz mit einer Mutation, die Phototransduktion beeinträchtigt die Demonstrate dass die Aktivierung von einem Cluster von Webstuhl-Neurone im Fliegenhirn Optik Lappens Foma-1 Neuronen, fahren kann ein Entweichen Verhalten verwendet, um eine Kollision zu vermeiden. Wir verwendeten ein Null-Allel von einer kritischen Komponente des Phototransduktionskaskade, an Phospholipase C-β, durch das Gen kodierte norpA, machen die Fliegen blinde und auch mit dem Gal4-UAS-Transkriptionsaktivator System zur Expression von ChR2 im Foma-1 fahren Neuronen. Individuelle Fliegen werden auf einer kleinen Plattform durch blaue LEDs umgeben ist. Wenn die LEDs beleuchtet werden, die schnell fliegt Abheben in Flug, in einer ähnlichen Weise, um visuell angetriebenen Webmaschine Fluchtverhalten. Wir glauben, dass diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Verhaltensweisen in sich frei bewegenden entfernt untersuchen.
Introduction
Eine wachsende Arsenal von genetisch kodierte Werkzeuge wurden entwickelt, um neuronale Aktivität in bestimmten Zellen in Drosophila melanogaster 1 manipulieren. Diese Werkzeuge ermöglichen die nichtinvasive Aktivierung oder Inaktivierung von bestimmten Nervenzellen im intakten und sich frei bewegenden Tier. Unter diesen greifen Channelrhodopsin2 (ChR2), ein Licht-aktivierter Kationen-Kanal, entscheidende Vorteile, da sie zeitlich gesteuert werden können und schnell induziert. Wenn Neuronen, die ausdrückliche ChR2 zu hellen Blau (470 nm) Licht, das sie schnell depolarisiert und weisen erhöhte Feuerrate 3-5 ausgesetzt sind. Solche gezielten Aktivierung von spezifischen Neuronen in sich frei bewegenden Tieren hat die Angemessenheit bestimmter Neuronen für Verhaltensweisen wie CO 2-Vermeidung 3, Rüssel-Erweiterung 2,4 und Riesen-Faser vermittelten erschrecken Antworten 4 enthüllt. Da jedoch die intensive Lichtquellen notwendig ChR2 stimulieren stimulieren auch Photorezeptoren, die Anwendung optogenetic Techniken, um das visuelle System begrenzt wurde. Durch die Kombination eines optogenetische Ansatz mit einer Mutation, die Phototransduktion beeinträchtigt haben wir gezeigt, dass die Aktivierung einer bestimmten Gruppe von Neuronen in der Fliege optischen Loben können die Escape-Verhalten verwendet, um eine Kollision zu vermeiden 6 fahren.
Die meisten, wenn nicht alle, weisen eine visuelle Tieren Fluchtverhalten um Kollisionen mit entgegenkommenden Objekten zu vermeiden. Wandern oder stationär fliegt, wenn sie mit einer drohenden Kollision vorgestellt, Take-off in die Flucht, weg von der entgegenkommenden Kollision 7-9. Diese take-offs sind durch erhöhte Flügeln vor Take-off und einer instabilen Flugbahn 10,11 gekennzeichnet. Diese Antwort unterscheidet sich von dem Riesen-Faser-vermittelten Schreckreaktion, Sprünge, die nicht durch erhöhte Flügel voraus, und in der Regel in einem frei fallenden Wäschetrockner 4,9 führen. Nachdem eine bestimmte Cluster von Webstuhl sensiblen Neuronen in der optischen Loben, Foma-1 Neuronen, die uniqu sindely abgestimmt auf sich nähernde Objekte kodieren, haben wir versucht, ihre Beteiligung an der Fliege loom Fluchtverhalten sondieren. Hier zeigen wir die Verwendung von Optogenetik selektiv zu aktivieren diese Neuronen und entlocken der Fliege Flucht Verhalten.
Wir verwenden die Gal4-UAS-Transkriptionsaktivator System, um die Expression in den ChR2 Foma-1 Neuronen anzutreiben. ChR2 erfordert die Cofaktor all-trans-Retinal und da dies in geringen Mengen in der Drosophila zentralen Nervensystems gefunden wird, muss in der Fliegen "Ernährung ergänzt werden. 3,4 Als helles Licht verwendet wird, um ChR2 aktivieren und Fliegen zeigen eine starke phototaktischen Verhaltensweisen 12, versuchten wir, die Möglichkeit einer visuellen Antwort auf den Reiz zu eliminieren. Dazu verwendeten wir Tiere, die homozygot mutierte für eine Null-Allel des norpA Gen, das eine kritische Komponente des Phototransduktionsprozess, Phospholipase C-β kodiert waren. Photorezeptoren in solchen mutierten Fliegen sind keine Verantwortungd ans Licht 13. Um die optogenetische Stimulation der Flucht Reaktion zu testen, müssen wir eine Fliege zu isolieren und baden sie in helles blaues Licht. Um dies zu tun, legen wir individuelle Fliegen in Pipettenspitzen. Eine Pipettenspitze in einer benutzerdefinierten Halters, so dass die Fliege wird geotactically Fuß bis die Spitze und hinaus auf einer rechteckigen Plattform gesetzt. Die Fliege ist in der Lage, sich frei herumlaufen auf der Oberseite dieser Plattform. Die Plattform wird von vier blaue LED-Arrays mit jeweils 3 LEDs, auf der Oberseite der Plattform ausgerichtet umgeben. Nachdem die Fliege ist auf der Plattform sind die LEDs beleuchtet, und die Fliege Reaktion wird mittels eines High-Speed-Kamera 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben optogenetische Stimulation der Flucht Verhaltensweisen durch Baden frei zu Fuß Fliegen in helles blaues Licht gezeigt. Dies kann leicht angepasst werden, um andere Verhaltensweisen in frei zu Fuß Fliegen zu untersuchen, und können zu größeren Plattformen, indem Sie einfach Tiling die LED-Arrays wir über eine größere Fläche verwendet skaliert werden. Verwenden Sie entweder die kostengünstige Kamera, die wir beschreiben, oder andere verfügbare Kamera-Systeme, kann der Anwender individuell die Bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von einem Stanford Deans Fellowship (SEJdV), einem National Institutes of Health Director der Pioneer Award (TRC DP0035350), ein McKnight Foundation Scholar Award (TRC) und R01 EY022638 (TRC) finanziert.
Materials
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific & Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼” ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼” NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 |
References
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