Optogenetic भागने व्यवहार की उत्तेजना<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
Summary
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग optogenetic उपकरणों में विशिष्ट न्यूरॉन्स की noninvasive हेरफेर सक्षम<em> ड्रोसोफिला</em> मस्तिष्क. ऐसे उपकरण न्यूरॉन्स सक्रियण जिसका विशेष व्यवहार को प्रकाश में लाना या दबाने के लिए पर्याप्त है की पहचान कर सकते हैं. हम यहाँ मौजूद Channelrhodopsin2 को सक्रिय करने के लिए एक तरीका है कि स्वतंत्र रूप से चलने मक्खियों में लक्षित न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है.
Abstract
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरणों की बढ़ती संख्या के लिए उपलब्ध होते जा रहे हैं कि ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर 1 में विशिष्ट न्यूरॉन्स के तंत्रिका गतिविधि के गैर इनवेसिव हेरफेर की अनुमति. इनमें मुख्य optogenetic उपकरण है, जो सक्षम सक्रियण या चमकदार रोशनी का उपयोग बरकरार है और स्वतंत्र रूप से बढ़ने जानवर में विशिष्ट न्यूरॉन्स के मुंह बंद कर रहे हैं. (ChR2) Channelrhodopsin कटियन प्रकाश सक्रिय चैनल है कि, जब नीले प्रकाश से सक्रिय न्यूरॉन्स कि यह व्यक्त की विध्रुवण का कारण बनता है. ChR2 सीओ 2 परिहार, सूंड विस्तार और विशाल फाइबर मध्यस्थता डराना 2-4 प्रतिक्रिया के रूप में विशिष्ट व्यवहार, के लिए महत्वपूर्ण न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए प्रभावी किया गया है. हालांकि, तीव्र प्रकाश स्रोत के रूप में करने के लिए ChR2 भी उत्तेजित photoreceptors को प्रोत्साहित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इन optogenetic तकनीक पहले नहीं दृश्य प्रणाली में इस्तेमाल किया गया है. यहाँ, हम एक परिवर्तन है कि प्रदर्शन के लिए phototransduction impairs के साथ एक optogenetic दृष्टिकोण गठबंधनमक्खी ऑप्टिक पालि, FOMA 1-न्यूरॉन्स में करघा के प्रति संवेदनशील न्यूरॉन्स के एक क्लस्टर की है कि सक्रियण nstrate टकराव से बचने के लिए इस्तेमाल किया, एक भागने व्यवहार ड्राइव कर सकते हैं. हम phototransduction झरना के एक महत्वपूर्ण घटक के एक अशक्त एलील का उपयोग किया है, प्रस्तुत करना phospholipase सी β, norpA जीन द्वारा इनकोडिंग, अंधा मक्खियों और भी Gal4 यूएएस transcriptional उत्प्रेरक प्रणाली का उपयोग करने के लिए FOMA-1 में ChR2 की अभिव्यक्ति ड्राइव न्यूरॉन्स. व्यक्तिगत मक्खियों नीले एलईडी से घिरे एक छोटे से मंच पर रखा जाता है. जब एल ई डी प्रकाशित कर रहे हैं, जल्दी मक्खियों ले बंद उड़ान में एक नेत्रहीन प्रेरित व्यवहार करघा एस्केप-समान तरीके में. हम मानते हैं कि इस तकनीक को आसानी से करने के लिए स्वतंत्र रूप से मक्खियों को बढ़ने में अन्य कार्यों की जांच करने के लिए अनुकूलित कर सकते हैं.
Introduction
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरणों की बढ़ती शस्त्रागार ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर 1 में विशिष्ट कोशिकाओं में तंत्रिका गतिविधि में हेरफेर करने के लिए विकसित किया गया है. ये उपकरण noninvasive या बरकरार है और स्वतंत्र रूप से बढ़ने जानवर में विशिष्ट न्यूरॉन्स के सक्रियण मुंह बंद सक्षम. इनमें (ChR2) Channelrhodopsin2, एक कटियन प्रकाश सक्रिय चैनल, महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है, क्योंकि यह अस्थायी और नियंत्रित किया जा सकता है जल्दी से प्रेरित है. जब न्यूरॉन्स है कि एक्सप्रेस ChR2 चमकदार नीली प्रकाश (470 एनएम) वे तेजी से चुम्बकत्व से वंचित करना और ऊंचा फायरिंग दर 3-5 प्रदर्शन उजागर कर रहे हैं. आज़ादी से आगे बढ़ जानवरों में विशिष्ट न्यूरॉन्स के इस तरह के लक्षित सक्रियण सीओ 2 3 परिहार, सूंड 2,4 विस्तार और विशाल फाइबर मध्यस्थता डराना प्रतिक्रियाओं 4 के रूप में इस तरह के व्यवहार के लिए विशेष रूप से न्यूरॉन्स की प्रचुरता से पता चला है. हालांकि, तीव्र प्रकाश ChR2 को प्रोत्साहित करने के लिए आवश्यक स्रोतों के रूप में भी photoreceptors को प्रोत्साहित करने के लिए, सेशन लागू करने केदृश्य प्रणाली togenetic तकनीक सीमित किया गया है. एक परिवर्तन है कि phototransduction impairs के साथ एक optogenetic दृष्टिकोण के संयोजन से, हमने दिखा दिया है कि मक्खी ऑप्टिक पालि में न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट समूह के सक्रियण भागने 6 टकराव से बचने के लिए इस्तेमाल किया व्यवहार ड्राइव कर सकते हैं.
अधिकांश, नहीं तो सब, दृश्य जानवरों आनेवाला वस्तुओं के साथ टकराव से बचने के लिए एक भागने व्यवहार दिखा रहे हैं. चलना या स्थिर मक्खियों, जब एक उभरते टक्कर के साथ प्रस्तुत, उड़ान में दूर ले, आनेवाला 7-9 टक्कर से दूर. इन नापसंद ले उठाया बंद करने और एक अस्थिर उड़ान 10,11 प्रक्षेपवक्र पहले पंख द्वारा विशेषता है. यह प्रतिक्रिया विशाल फाइबर मध्यस्थता डराना प्रतिक्रिया, कूदता है कि उठाया पंखों से पहले नहीं कर रहे हैं से अलग है, और आमतौर पर एक मुक्त गिरने टम्बल 4,9 में परिणाम. ऑप्टिक पालि FOMA-1 न्यूरॉन्स, कि uniqu हैं में करघा संवेदनशील न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट समूह की पहचान कीely आ वस्तुओं सांकेतिक शब्दों में बदलना देखते, हम मक्खी करघा बच व्यवहार में उनकी भागीदारी की जांच करने की मांग की है. यहाँ हम optogenetics का उपयोग करने के लिए चुनिंदा इन न्यूरॉन्स सक्रिय करने और मक्खी भागने व्यवहार प्रकाश में लाना प्रदर्शित करता है.
हम Gal4 यूएएस transcriptional उत्प्रेरक प्रणाली का उपयोग करने के लिए FOMA एक न्यूरॉन्स में ChR2 की अभिव्यक्ति ड्राइव. ChR2 cofactor सब पार रेटिना की आवश्यकता है और के रूप में इस ड्रोसोफिला केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में निम्न स्तर में पाया जाता है यह मक्खियों आहार में पूरक होना चाहिए 3,4 के रूप में चमकदार रोशनी ChR2 सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है और मक्खियों मजबूत phototactic प्रदर्शन व्यवहार. 12, हम प्रोत्साहन के लिए एक दृश्य प्रतिक्रिया की संभावना को खत्म करने की मांग की. ऐसा करने के लिए, हम जानवरों है कि जो phototransduction झरना के एक महत्वपूर्ण घटक है, phospholipase सी β encodes norpA जीन, के एक अशक्त एलील लिए homozygous उत्परिवर्ती थे इस्तेमाल किया. ऐसे उत्परिवर्ती मक्खियों में photoreceptors जिम्मेदारी असमर्थ हैंघ 13 प्रकाश. भागने की प्रतिक्रिया के optogenetic उत्तेजना का परीक्षण करने के लिए, हम एक मक्खी को अलग करने के लिए और यह चमकदार नीली रोशनी में स्नान करने की आवश्यकता है. ऐसा करने के लिए, हम pipet युक्तियों में व्यक्तिगत मक्खियों जगह. एक pipet टिप ऐसी है कि मक्खी geotactically टिप चलना होगा और बाहर एक आयताकार मंच पर एक कस्टम धारक, में रखा गया है. मक्खी के लिए स्वतंत्र रूप से इस मंच के शीर्ष पर चारों ओर चलने में सक्षम है. मंच चार नीली एलईडी arrays, प्रत्येक युक्त 3 एल ई डी, मंच के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित से घिरा हुआ है. बाद मक्खी मंच पर है, एलईडी प्रबुद्ध, कर रहे हैं और एक उच्च गति 6 कैमरे का उपयोग कर मक्खी की प्रतिक्रिया दर्ज की गई है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम स्वतंत्र रूप से स्नान चमकीले नीले प्रकाश में मक्खियों चलने से बच व्यवहार के optogenetic उत्तेजना का प्रदर्शन किया है. इस दृष्टिकोण आसानी के लिए स्वतंत्र रूप से चलने मक्खियों में अन्य कार्यों की जांच करन…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एक स्टैनफोर्ड डीन (SEJdV) फैलोशिप, स्वास्थ्य निदेशक पायनियर पुरस्कार के राष्ट्रीय संस्थानों (DP0035350 टीआरसी), McKnight फाउंडेशन विद्वान पुरस्कार (टीआरसी) और EY022638 R01 (टीआरसी) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific & Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼” ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼” NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 |
References
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