Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

培養細胞からの染色体の準備

doi: 10.3791/50203 Published: January 28, 2014

Summary

染色体は、例えば、リンパ球または皮膚線維芽細胞等の生細胞から、ヒトまたはマウスを含む生物から単離することができる。これらの染色体調製物は、さらに、ルーチンG-バンディングなどsituハイブリダイゼーション (FISH)、 蛍光 、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、スペクトル核型分析(SKY)のような分子細胞遺伝学手順のために利用することができる。

Abstract

染色体(細胞遺伝学的)分析は、染色体不安定性の検出のために広く使用されている。 G-バンディングや、in situハイブリダイゼーション(FISH)蛍光として分子技術が続く場合には、このアッセイは、1つ以上の染色体が関与するゲノム再配列の部分の損益を伴う収差を個々の細胞を分析するための強力な能力を持っています。ヒトでは、染色体異常は約1 160あたりの出生1,2、すべての流産の60から80パーセントで発生する3,4、死産の10%の2,5、先天性心疾患6、3から6パーセントを持つ個人の13%不妊のケース2の、そして発達遅滞と先天性欠損7と多くの患者において。クローン性染色体異常の観察は、診断および予後的意義8,9の両方を有することが示されているように、悪性腫瘍の細胞遺伝学的分析は、日常的に、研究者や臨床医によって使用される。60、染色体の分離は、遺伝子治療のための非常に貴重であり、ヒト以外の霊長類とげっ歯類10月13日を含む生物の幹細胞研究。

染色体は、血液リンパ球、皮膚線維芽細胞、羊膜細胞、胎盤、骨髄、および腫瘍検体を含む生体組織の細胞から単離することができる。染色体は、それらが最も凝縮された場合に、有糸分裂の中期段階で分析され、したがって、よりはっきりと見える。染色体分離技術の最初のステップは、後続の後期段階に進むから細胞を防ぐためにコルセミドとのインキュベーションによって、紡錘糸の破壊を伴う。次いで、細胞を低張液で処理し、カルノア固定液との膨潤した状態で保存されている。次いで、細胞をスライドガラス上に滴下し、次いで、種々の手順のために利用することができる。 Gバンド法は、特徴的な明暗の帯を作成するためにギムザで染色し、トリプシン処理を必要とする。同じPR染色体を単離するocedureは、例えば、in situハイブリダイゼーション (FISH)、 蛍光 、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、スペクトル核型分析(SKY)14,15のような手順のための細胞の調製のために使用することができる。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

染色体分析は、染色体不安定性と遺伝性疾患や悪性腫瘍の1,2,8,9につながる再配列を診断するために、世界的に利用される従来の手法である。また、憲法および癌取得した遺伝的異常の診断および研究のための高解像度は、例えば、蛍光in situハイブリダイゼーション (FISH)などの古典的な細胞遺伝学的手順および分子細胞遺伝学的方法論の組み合わせ、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)で達成することができる、およびスペクトル核型分析(SKY)14,15。より最近では、これらの技術は、幹細胞研究に関連付けられた染色体不安定性の評価のために利用されている。そのような長期培養胚細胞(ES)および種々の生物の成体幹細胞の異数性のような核型異常は、複数の研究室により報告されている。最近の証拠は、いくつかの細胞系は本質的に、染色体に対してより傾斜していることを裏付けるinstabi関係なく、培養条件のLITY。確立および/またはヒト、マウス、アカゲザル幹細胞株を維持するときに、この理由のため、染色体分析は、品質管理プロセスの一部として推奨されている。多くの報告が文化10月13日中の幹細胞および悪性細胞または様々な生物の染色体の安定性を監視するためのルーチンおよび分子細胞遺伝学の使用の関心の高まりを説明します。これらのプロトコルは、ますます培養細胞の迅速な13染色体非遺伝的評価のために実験室で使用されている。我々は、様々な生物由来の臨床研究のため、細胞の両方に適用することができる種々の細胞型からの染色体を調製するための我々の基本的な手順を提示する。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1。接着細胞の染色体収穫

  1. 標準プロトコル
    1. 特定の細胞培養条件に応じて細胞を増殖させる。細胞が対数増殖期(80%コンフルエント)に達したとき、細胞培養フラスコにコルセミドを10μl/ミリリットル加える。 2×10 6セルの最小を推奨します。
    2. 45分間、5%CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートする。滅菌ピペットを使用して、15ミリリットルコニカルチューブに細胞からメディアを転送。置いておきます。
    3. 穏やかフラスコにHBSS緩衝液2 mlを添加することによって細胞を洗浄する。スワールは、バッファしてからピペットを用いて除去する。捨てる。
    4. それがフラスコの表面全体を覆​​うことを確実にする、1mlのトリプシンを加える。わずか約2分間トリプシンで細胞を残す。細胞の大部分が分離したら、戻って細胞上にコニカルチューブ内のメディアをピペット。
    5. を15mlコニカルチューブに、10mlの一定分量中の細胞懸濁液を移す。10分間200×gで遠心分離する。上清を除去し、ペレットを再懸濁。
    6. コニカルチューブ内の残りのペレットに37℃に温めておいてきた0.075MのKClを10ミリリットルを追加します。 KClおよび細胞を混合する程度の速度で渦管。
    7. 10分間37℃で細胞をインキュベートする。 25℃で5分間200×gで遠心分離(約0.5ミリリットル残るまで)上清を除去し、ペレットを再懸濁し。
    8. ボルテックスしながら細胞に:慎重に新鮮なカルノア固定液(氷酢酸メタノールの3:1比率)の5ミリリットルを追加。その後、10ミリリットルの合計ボルテックスせずに固定液より5ミリリットルを追加します。
    9. 5分間200×gで遠心分離する。上清と再懸濁細胞を除去する。各チューブに固定液の5ミリリットルを追加します。
    10. 5分間200×gで遠心分離する。上清と再懸濁細胞を除去する。各チューブに固定液の5ミリリットルを追加します。細胞はこれまでに一年間、4℃で保存することができる。
  2. 議定書の修正:染色体harvestiリンパ芽球様細胞株のngの
    1. 特定の細胞培養条件に応じて細胞を増殖させる。 (使用して、培養された細胞の量に適したフラスコ)。細胞は(細胞が分割され、約2日後)対数期に達すると、細胞培養フラスコにコルセミドの10μL/ mLを加え。
  3. 議定書の修正:全血から染色体収穫
    フィトヘマグルチニン(PHA)、金時豆に由来したレクチンは、ヒトT細胞16のための強力なマイトジェンである。 72時間の培養にPHAを添加した後、細胞の約45%がS期にある。これは、ピーク分裂活性を示し、染色体研究のために採取するれる最適点である。 B細胞17,18を分析するとき、例えばヤマゴボウ(1-10μg/ ml)をのような他のマイトジェンを使用することができる。
    1. 緑のトップヘパリンナトリウム管内における全血を少なくとも1ミリリットルを収集します。採取後3日以内に使用してください。 RT国連で保存血使用する準備がゴマ。
    2. アリコートL-グルタミン(20%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%ファンギゾン、および1%PHA)を含有する完全RPMI培地10ml中の全血0.25mlの。 5%のCO 2、37℃で培養する。
  4. 議定書の修正:骨髄から染色体収穫
    染色体異常クローンの観察は、白血病の特定のタイプのための診断され得るように、骨髄での細胞遺伝学的解析は、多くの悪性血液疾患に有用である。染色体の研究はまた、急性転化および治療に対する応答の発症などの疾患の進行を評価するために使用される。骨髄細胞が活発に分裂しているので、まだマイトジェン刺激9,19は不要である。急性白血病のために24および48時間培養も設定されています。
    1. 緑のトップヘパリンナトリウム管内における骨髄の少なくとも1ミリリットルを収集します。アリコートL-グルタミンを含む完全RPMI培地10ml中の骨髄0.25mlの(20%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%ファンギゾン)。 5%のCO 2、37℃で培養する。

2。スライドの準備とソリッド染色

1代表スライドの迅速な評価は、例えば、G-バンディング、魚、CGH、または空のようさらなる手続きに進む前に、収穫の品質に関する情報を提供します。いくつかの研究室では、固体染色するために迅速な収穫と染色体評価のための細胞を好む。代替的には、位相差顕微鏡は、この分析のために使用することができる。湿度が約50%と温度雰囲気(20〜25℃)である場合、スライドを最も良く調製される。

  1. 25℃で5分間、200×gで細胞を遠心分離唯一の0.3〜0.5ミリリットル残るまで上清を取り除きます。
  2. 優しくペレットを再懸濁した後、ピペット約45°の角度で傾いたとサスペンションを許可されたスライド上では約2の距離から細胞懸濁液の3滴スライド上を流れていき。スライドに新鮮なカルノア固定液の1大粒を追加します。
  3. ペーパータオルの上のスライドの裏側を乾燥した後、少なくとも10分間乾燥さ引き出して座る。スライドは完全に乾燥する必要があります。
  4. 新鮮ギムザ染色液(ガーバッファおよびギムザ染色の3:1の比)を準備します。染色ラックにスライドを置きます。ギムザ染色液中のスライド全体をカバーしています。スライドを5分間染色溶液中に残存してみましょう。 、蒸留水でスライドをすすいで排水し、空気乾燥させ。
  5. 4パーマウント滴のスライドにカバースリップを追加します。カバースリップの下に気泡がないことを確認してください。過剰のパーマウントは、紙タオルで除去することができる。
  6. 10Xと100X拡大して光学顕微鏡で細胞を分析します。中期細胞が豊富でよく普及している場合、残りのスライドを、他の実験手順を用いることができる。

3。トリプシンおよびギムザを用いて、G-バンディング(GTG)

<のp>トリプシンは、得られたより高い転写活性を有するDNA領域にユークロマチン、ヒストンを変性タンパク質分解酵素である。ギムザ染色後、これらの領域は、光のバンドとして表示されます。ほとんど、あるいは全く転写活性(ヘテロクロマチン)と高度に凝縮クロマチンをトリプシンから保護そのヒストンの大部分を持つことになりますので、ギムザ染色後暗く染色します。それは、最初にG-バンドのスライドに状況を監視し、必要に応じてその後のスライドでトリプシンタイミングを調整することが不可欠である。

  1. 4コプリンジャーに以下の手段を追加します。
    ジャーファー#1X HBSSの1 = 30ミリリットルと10倍のトリプシン(0.5%)の4ミリリットル
    1XのHBSSのJAR#2 = 50ミリリットル
    1X HBSSおよびウシ胎児血清の5ミリリットルのジャーファー#3 = 45ミリリットル
    1X HBSSのJAR#4 = 50ミリリットル
  2. 5秒のJAR#1の各スライド、ジャー#2の迅速なリンスを浸し、少なくとも30秒間ジャー#3の各スライドのまま、ジャー#4クイックすすぎ、その後、スライドを乾燥させます。
  3. FRESを準備しますHギムザ染色液(ガーバッファおよびギムザ染色の3:1の比)。染色ラックにスライドを置きます。ギムザ染色液中のスライド全体をカバーしています。スライドを5分間染色溶液中に残存してみましょう。
  4. これらは染色されたのと同じ順序でスライドを蒸留水ですすぐ。スライドを約10分間乾燥させます。スライドは完全に乾燥する必要があります。
  5. 4パーマウント滴のスライドにカバースリップを追加します。カバースリップの下に気泡がないことを確認してください。過剰のパーマウントは、紙タオルで除去することができる。
  6. 10Xと100X拡大して光学顕微鏡で細胞を分析します。最初のスライドの結果に基づいてスライドの残りのトリプシンタイミングを調整する。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

高品質の中期スプレッドは、染色体分析のために不可欠です。成功したアッセイは、よく普及し、適切な染色体の形態である染色体が得られます。適切にG-バンド染色体特性明暗バンドパターンが含まれています。

図1
図1。染色体は平均長さである、成功した染色体スプレッドは、十分に普及し、簡単に識別できる相互に、そして明暗バンドの間に十分なコントラスト。グッド染色体の形態は示す任意の再編成のための個々の染色体と評価の同定を可能にする染色体不安定性の。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

我々は、種々のヒトから得られた細胞型、アカゲザル、ラットおよびマウス11,20-22を含む種々の生物の細胞から染色体を単離するための本手順を利用している。標準的なプロトコルが提供されるが、特定の重要なステップと変数は、細胞のこれらの多様なタイプのために調整される必要があり得る。いくつかの具体的な手順は、染色体の準備と結果の可能な限り最高の品質を確保するために、G-バンディングの両方に重要である。アッセイに影響を与えることができる変数の一つは、コルセミドのインキュベーション時間である。コルセミドでの不十分な時間が少ない中期スプレッドと長く、重なった染色体が得られます。コルセミドでのより長いインキュベーション時間を分析することは困難である短く、太く、染色体になります。もう一つの重要な変数は、低張液のモル濃度である。 0.075 M塩化カリウム溶液は、単に十分な細胞を溶解することなく、拡散適切な染色体を生成するために、細胞を膨潤する。追加しているとき混合しながら、カルノア固定液溶液は、第5mlのペレットに添加しなければならない。これは、余分なタンパク質の全てがサンプルを保存するか、スライドを準備する前に除去されることを保証します。細胞が十分に混合されていない場合には場合は、黄色のタンパク質キャップは、後続の手順中の合併症を引き起こし得る、ペレットの上に形成される。

適切なスライド準備が不可欠です。スライド上に再懸濁した細胞ペレットを落としながら、染色体が正常に解析用のスライド上に分散させることができるように、スライドにスポイトから(少なくとも2インチ)スライドは、約45°の角度に傾け、十分な距離があるされていることを確認してください。すぐにスライド上に細胞を落とし、次の固定液とスライドをあふれさせることも広めるために染色体を助ける。細胞懸濁液をスライドに上で乾燥する速影響し、温度と湿度は、染色体拡散に影響を与えるその他の要因である。これらは、することができます約50%の湿度および約20〜25℃の温度を有する環境において、および/またはより高速な乾燥用スライドウォーマー上にスライドを配置することによってスライドを調製することにより制御される。 G-バンディングのために、染色体の品質に影響を与える主な要因は、トリプシン露光時間である。長いトリプシン露出で、染色体が拡散し、腫れて表示されることがあります。逆に、不適切に短いトリプシンインキュベーションは区別できないバンドや少しコントラストの染色体を得られます。トリプシンインキュベーションタイミングは、それぞれの特定の細胞株や収穫状況に応じて変更されることがあります。このため、代表的なG-バンドのスライドは、スライドの残りの部分を染色する前に、トリプシン条件を評価する最初の準備する必要があります。ウシ胎児血清は、染色前にトリプシン活性を不活性化するために使用される。我々は、ギムザ(GTG)を使用してプロトコルを提供するが、ライト染色はGTWバンディング及び収率同様の結果を得るためにギムザ代わりに用いてもよい。

t "の>この手順は、実行するのに比較的安価で効果的である。Gバンド法は、例えば、一般に悪性疾患、遺伝的障害に見られる転座、欠失、及び異数性などの染色体異常を診断し、およびインビトロ 10,11 培養された幹細胞に使用することができる、13。これは、染色体の構成や、複数のセル内の全ゲノムの全体的な評価の不可欠な可視化を提供します。これは、一般的にがん細胞10。出生前およびの診断、予後、および治療 ​​評価のために世界的な臨床および研究実験室で使用されている生後組織サンプルは、日常的ダウン症候群などの遺伝的障害を引き起こす数値と構造異常の同定のために評価される。幹細胞が急速に染色体不安定性の存在について評価することができるが、Gバンド法の分解能はの同定のために制限されるメタ情報に見られるように、微小欠失または複合染色体異常tatic悪性腫瘍。

ルーチン染色体Gバンド法は、このようなin situハイブリダイゼーション (FISH)、 蛍光 、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、スペクトル核型分析(SKY)のような手順で補充されたときしたがって、染色体異常の検出率は劇的に23に増加している。このため、これらの他の分子細胞遺伝学的手順と組み合わせた本プロトコルの利用がますます臨床および研究の両方が13〜15の設定で染色体不安定性を評価するための異なる研究室で使用されている。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

本稿で説明した作業は、パトリック·F·テイラー財団からの資金によって可能になりました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KaryoMAX Colcemid Gibco 15212-012
HBSS Buffer Gibco 24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x Gibco 15400-054
Permount Fisher Scientific SP15-100
Buffer Tablets "GURR" Gibco 10580-013
Geimsa Stain Ricca Chemical Company 3250-16
Centrifuge 5810 Eppendorf
Methanol Caledon Laboratory Chemicals 6700130
Glacial Acetic Acid Krackeler Scientific Inc. 11-9508-05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
  2. Nussbuam, R., et al. Genetics in Medicine: 7th Edition. Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).
  3. Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84, (11), 1103-1107 (2005).
  4. Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81, (12), 896-901 (2010).
  5. Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114, (4), 901-914 (2009).
  6. Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115, (23), 3015 (2007).
  7. Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21. PubMed Health. (2010).
  8. Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. (2003).
  9. Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115, (3), 118-124 (2002).
  10. Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24, (4), 1095-1103 (2006).
  11. Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68, (11), 4229-4238 (2008).
  12. Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20, (12), 1248-1255 (2012).
  13. Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7, (2), 471-477 (2011).
  14. Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
  15. Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6, (10), 782-792 (2005).
  16. Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  17. Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. (2011).
  18. Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. ACT. Houston, TX. (1997).
  19. Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).
  20. Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19, (7), 1139-1151 (2012).
  21. Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4, (4), 177-181 (2005).
  22. Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8, (1), 13-21 (2002).
  23. McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61, (8), 903-908 (2008).
培養細胞からの染色体の準備
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).More

Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter