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Biology

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

doi: 10.3791/50203 Published: January 28, 2014

Summary

Chromosomen von lebenden Zellen, wie Lymphozyten oder Fibroblasten der Haut isoliert werden und aus Organismen, einschließlich Menschen oder Mäusen. Diese Chromosomen-Präparate können weitere für die Routine G-Banding und molekulare zytogenetischen Verfahren wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH), und spektrale Karyotypisierung (SKY) genutzt werden.

Abstract

Chromosom (zytogenetische Analyse) wird weithin für den Nachweis von Chromosomen-Instabilität verwendet. Wenn durch G-Banding und molekularen Techniken wie Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), gefolgt, hat dieser Test die leistungsfähige Möglichkeit, einzelne Zellen zu Aberrationen, die Gewinne oder Verluste von Abschnitten des Genoms und Umlagerungen, die ein oder mehrere Chromosomen betreffen analysieren. Bei Menschen, in etwa 1 pro 160 Lebendgeburten 1,2, 60-80% aller Fehlgeburten treten Chromosomenanomalien 3,4, 10% der Totgeburten 2,5, 13% der Personen mit angeborenen Herzfehlern 6, 3-6% der Unfruchtbarkeit Fällen 2 und bei vielen Patienten mit Entwicklungsverzögerung und der Geburtsdefekte 7. Zytogenetische Analyse der Bösartigkeit wird routinemäßig von Forschern und Klinikern verwendet, wie Beobachtungen von klonalen Chromosomenanomalien haben gezeigt, dass sowohl diagnostische als auch prognostische Bedeutung haben 8,9.60; Chromosomentrennung ist von unschätzbarem Wert für die Gentherapie und Stammzellforschung von Organismen einschließlich nicht-menschlichen Primaten und Nagetiere 10-13.

Chromosomen von Zellen von lebenden Geweben, einschließlich Blut-Lymphozyten, Haut-Fibroblasten, Amniozyten, Plazenta, Knochenmark und Tumorproben isoliert werden. Chromosomen werden in der Metaphase-Stadiums der Zellteilung analysiert, wenn sie am meisten verdichtet werden und damit deutlich sichtbar. Der erste Schritt des Chromosoms Isolationstechnik beinhaltet die Unterbrechung der Spindelfasern durch Inkubation mit Colcemid, um die Zellen ausgehend von der nachfolgenden Stufe Anaphase verhindern. Anschließend werden die Zellen mit einer hypotonischen Lösung behandelt und in ihrem gequollenen Zustand mit Carnoy-Fixiermittel erhalten. Die Zellen werden dann auf Objektträger fallengelassen, und können dann für eine Vielzahl von Verfahren verwendet werden. G-Banding beinhaltet Trypsin-Behandlung gefolgt von einer Färbung mit Giemsa zu charakteristischen hellen und dunklen Streifen zu schaffen. Das gleiche procedure Chromosomen isolieren können zur Herstellung von Zellen für die Verfahren, wie Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), vergleichende genomische Hybridisierung (CGH), und die spektrale Karyotypisierung (SKY) 14,15 verwendet werden.

Introduction

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Chromosomenanalyse ist eine herkömmliche Technik genutzt, um den Chromosom Instabilität und Umlagerungen, die zu genetischen Störungen und Bösartigkeit 1,2,8,9 diagnostizieren. Darüber hinaus kann eine höhere Auflösung für die Diagnose und Erforschung von Krebs-und Verfassungs erworbene genetische Anomalien mit der Kombination der klassischen zytogenetischen Verfahren und molekulare zytogenetischen Methoden wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH) erreicht werden und spektrale Karyotypisierung (SKY) 14,15. In jüngerer Zeit haben diese Techniken für die Beurteilung von Chromosom Instabilität mit Stammzellen assoziiert genutzt. Karyotypischen Anomalien wie Aneuploidie von Langzeit kultivierten embryonalen Stammzellen (ES) und adulten Stammzellen aus verschiedenen Organismen wurden von mehreren Laboratorien gemeldet. Neuere Erkenntnisse unterstützt, dass einige Zelllinien sind von Natur aus eher auf Chromosom instabiNG unabhängig von den Kulturbedingungen. Aus diesem Grund wird bei der Festlegung und / oder Aufrechterhaltung von Mensch, Maus oder Rhesus Stammzelllinien, die Chromosomenanalyse wird als Teil der Qualitätskontrolle empfohlen. Viele Berichte beschreiben die zunehmendes Interesse an der Verwendung von Routine-und molekularen Zytogenetik, um die chromosomale Stabilität von Stammzellen und malignen Zellen oder verschiedenen Organismen in der Kultur 10-13 überwachen. Diese Protokolle werden zunehmend von nicht-genetischen Labors für die schnelle Chromosomen Bewertung ihrer kultivierten Zellen 13 verwendet. Wir stellen unsere grundlegende Verfahren zur Herstellung von Chromosom verschiedenen Zelltypen, die sowohl für klinische und Forschungszwecke und Zellen von verschiedenen Organismen stammen angewendet werden können.

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Protocol

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1. Chromosom Ernten von adhärenten Zellen

  1. Standard-Protokoll
    1. Wachsen Zellen nach bestimmten Zellkulturbedingungen. Wenn die Zellen logarithmischen Phase (80% Konfluenz) erreicht, mit 10 ul / ml Colcemid zu der Zellkulturflasche. Ein Minimum von 2 x 10 6 Zellen empfohlen.
    2. Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator für 45 min. Verwendung einer sterilen Pipette Medien von Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Beiseite stellen.
    3. Behutsam die Zellen durch Zugabe von 2 ml HBSS-Puffer in den Kolben. Swirl Puffer und entfernen Sie dann mit einer Pipette. Entsorgen.
    4. 1 ml Trypsin, um sicherzustellen, dass es die gesamte Oberfläche der Flasche bedeckt. Nur lassen die Zellen in Trypsin für ca. 2 min. Nachdem die Mehrheit der Zellen freistehend, pipettieren, die Medien in der konischen Rohr wieder auf den Zellen.
    5. Übertragen der Zellsuspension in 10 ml-Aliquots in 15 ml konische Röhrchen.Zentrifuge bei 200 × g für 10 min. Überstand entfernen und das Pellet.
    6. 10 ml 0,075 M KCl, die auf 37 ° C zu der verbleibende Pellet im konischen Rohr vorgewärmt wurde. Wirbelrohr bei mittlerer Geschwindigkeit zu KCl und Zellen mischen.
    7. Zellen bei 37 ° C für 10 min. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei 25 ° C. Überstand entfernen (bis etwa 0,5 ml Überreste) und Pellet erneut.
    8. Zu den Zellen unter Vortexen: 5 ml frischem Carnoy-Fixativ (Eisessig 3:1-Verhältnis von Methanol) Vorsichtig. Daraufhin 5 ml mehr ohne Fixiermittel Vortexen für insgesamt 10 ml.
    9. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen. 5 ml der Fixierlösung in jedes Röhrchen.
    10. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen. 5 ml der Fixierlösung in jedes Röhrchen. Die Zellen können nun in 4 ° C für bis zu einem Jahr gelagert werden.
  2. Änderung des Protokolls Nr.: Chromosom harvesting Lymphoblastoidzelllinien
    1. Wachsen Zellen nach bestimmten Zellkulturbedingungen. (Verwenden Sie geeignete Kanne für die Menge an Zellen in Kultur). Wenn die Zellen logarithmischen Phase (etwa 2 Tage nach Zellen aufgeteilt sind) erreicht, mit 10 ul / ml Colcemid zu der Zellkulturflasche.
  3. Änderung des Protokolls Nr.: Chromosom Ernte aus Vollblut
    Phytohämagglutinin (PHA), ein Lektin aus der roten Bohne abgeleitet ist, ist ein leistungsfähiges Mitogen für humane T-Zellen 16. 72 Stunden nach der Zugabe von PHA in die Kultur, etwa 45% der Zellen in der S-Phase. Dies stellt den Peak mitotische Aktivität und der optimale Punkt, an dem für Chromosomenstudien ernten. Andere Mitogene, wie Pokeweed (1-10 ug / ml) kann, wenn B-Zellen analysiert 17,18 verwendet werden.
    1. Sammeln Sie mindestens 1 ml Vollblut in einem grünen Top Natrium-Heparin-Röhrchen. Verwenden Sie innerhalb von 3 Tagen nach der Sammlung. Shop Blut bei RT until bereit.
    2. Aliquots von 0,25 ml Vollblut in 10 ml vollständigem RPMI-Medium, das L-Glutamin (20% fötales Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% Fungizon und 1% PHA). Bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  4. Änderung des Protokolls Nr.: Chromosom Ernte aus dem Knochenmark
    Zytogenetische Analyse auf das Knochenmark ist hilfreich bei vielen malignen hämatologischen Erkrankungen, wie die Beobachtung eines chromosomal abnormen Klon kann diagnostisch für eine bestimmte Art der Leukämie. Chromosomenstudien werden auch verwendet, um den Krankheitsverlauf wie der Beginn der Blastenkrise und Ansprechen auf die Therapie zu beurteilen. Da Knochenmarkzellen werden aktiv teil ist keine Mitogenstimulation notwendig 9,19. Bei akuten Leukämien 24 und 48 h Kulturen werden ebenfalls eingerichtet.
    1. Sammeln Sie mindestens 1 ml Knochenmark in einem grünen Top Natrium-Heparin-Röhrchen. Aliquots von 0,25 ml Knochenmark in 10 ml vollständigem RPMI-Medium, das L-Glutamin (20% fötales Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% Fungizon). Bei 37 ° C mit 5% CO 2.

2. Slide Vorbereitung und Solid-Färbung

Eine schnelle Auswertung von einem Vertreter Folie wird Informationen über die Qualität der Ernte, bevor wieder weitere Verfahren wie die G-Bänderung, FISH, CGH, SKY oder bereitzustellen. Manche Labors lieber festen Fleck die Zellen für die schnelle Ernte und Chromosom Beurteilung. Alternativ kann ein Phasenkontrastmikroskop für diese Analyse verwendet werden. Objektträger werden am besten vorbereitet, wenn die Luftfeuchtigkeit etwa 50% und die Temperatur der Umgebungs (20-25 ° C).

  1. Zentrifugieren der Zellen bei 200 × g für 5 min bei 25 ° C. Entfernen Sie den Überstand bis nur 0,3-0,5 ml verbleibt.
  2. Nach vorsichtigem Resuspendieren des Pellets, Pipette drei Tropfen der Zellsuspension aus einer Entfernung von etwa 2 auf eine Folie, die in einem Winkel von etwa 45 ° geneigt und ermöglichen der Suspensionum über die Rutsche rollen. In einem großen Tropfen Frisch Carnoy-Fixativ auf der Folie.
  3. Trocknen Sie die Rückseite der Folie auf ein Papiertuch und dann sitzen die Folie zum Trocknen für mindestens 10 min. Der Schlitten sollte vollständig trocken sein.
  4. Bereiten Sie frischen Giemsa-Färbelösung (3:1-Verhältnis von Gurr Buffer und Giemsa-Färbung). Legen Sie die Folien auf eine Färbung Rack. Decken Sie die gesamte Folie in der Giemsa-Lösung. Lassen Sie die Folien in der Farblösung für 5 min zu bleiben. Spülen Sie mit destilliertem Wasser gleitet, abtropfen und an der Luft trocknen.
  5. 4 Tropfen Permount und ein Deckglas auf den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen unter dem Deckglas. Das überschüssige Permount kann mit einem Papiertuch entfernt werden.
  6. Analysieren Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop bei 10-facher und 100-facher Vergrößerung. Wenn die Metaphase Zellen reichlich und gut verteilt sind, können die restlichen Folien für andere experimentelle Verfahren verwendet werden.

3. G-Banding Mit Trypsin und Giemsa (GTG)

<p> Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das euchromatic Histone in DNA-Bereichen mit höheren Transkriptionsaktivität resultierende denaturiert. Nach Giemsa-Färbung, werden diese Regionen als Streifen treten. Hoch verdichtete Chromatin mit wenig oder ohne Transkriptionsaktivität (Heterochromatin) einen großen Teil seiner Histone vom Trypsin geschützt haben und daher dunkel färben folgenden Giemsa. Es ist wichtig, zunächst G-Band eine Folie, um die Bedingungen zu überwachen und einstellen Trypsin Timing bei Bedarf für die folgenden Folien.

  1. Fügen Sie die folgenden Lösungen bis 4 Coplin Gläser.
    Glas # 1 = 30 ml 1X HBSS und 4 ml 10x Trypsin (0,5%)
    Jar # 2 = 50 ml 1x HBSS
    Glas # 3 = 45 ml 1X HBSS und 5 ml fötales Rinderserum
    Jar # 4 = 50 ml 1x HBSS
  2. Tauchen Sie jede Folie im Glas Nr. 1 für 5 Sekunden, schnelle Spülung in Jar # 2, lassen jede Folie im Glas Nr. 3 für mindestens 30 sec, schnelles Spülen im Glas Nr. 4 dann lassen Folien zu trocknen.
  3. Bereiten fresh Giemsa-Lösung (3:1-Verhältnis von Gurr Buffer und Giemsa-Färbung). Legen Sie die Folien auf eine Färbung Rack. Decken Sie die gesamte Folie in der Giemsa-Lösung. Lassen Sie die Folien in der Farblösung für 5 min zu bleiben.
  4. Spülen Sie gleitet in destilliertem Wasser in der gleichen Reihenfolge, dass sie gefärbt wurden. Die Objektträger für 10 min trocknen. Der Schlitten sollte vollständig trocken sein.
  5. 4 Tropfen Permount und ein Deckglas auf den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen unter dem Deckglas. Das überschüssige Permount kann mit einem Papiertuch entfernt werden.
  6. Analysieren Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop bei 10-facher und 100-facher Vergrößerung. Einstellen Trypsin Zeitpunkt der Rest der Schlitten auf der Basis der Ergebnisse der ersten Folie.

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Representative Results

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Hochwertige Metaphasespreitungen sind für die Chromosomenanalyse. Ein erfolgreicher Test ergibt Chromosomen, die gut verteilt sind und von geeigneten Chromosomenmorphologie. Richtig G-gebänderten Chromosomen enthalten den charakteristischen hellen und dunklen Bandenmuster.

Figur 1
Abbildung 1. Eine erfolgreiche chromosomalen Ausbreitung in der die Chromosomen mit einer durchschnittlichen Länge, gut verteilen und leicht erkennbar voneinander und ausreichend Kontrast zwischen hellen und dunklen Streifen. Gute Chromosom Morphologie ermöglicht die Identifizierung der einzelnen Chromosomen und Bewertung für alle Umlagerungen Richt von Chromosom Instabilität.

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Discussion

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Wir haben die vorliegenden Verfahren für Chromosom Isolierung aus Zellen von verschiedenen Organismen, einschließlich von verschiedenen humanen Zelltypen zu erhalten, Rhesus-Makaken, Ratten und Mäuse verwendet 11,20-22. Das Standardprotokoll vorgesehen ist, aber bestimmte Schlüsselschritte und Variablen benötigen, um für diese verschiedenen Arten von Zellen eingestellt werden. Mehrere spezifische Schritte in dem sowohl die chromosomale Herstellung und G-banding, um die bestmögliche Qualität der Ergebnisse sicherzustellen entscheidend. Eine der Variablen, die den Assay beeinflussen kann, ist die Inkubationszeit Colcemid. Zu wenig Zeit in Colcemid ergibt weniger Metaphasespreitungen und länger, überlappt Chromosomen. Längere Inkubationszeiten in Colcemid wird kürzer und dicker Chromosomen, die schwierig zu analysieren sind, führen. Eine weitere wichtige Variable ist die Molarität der hypotonischen Lösung. Eine 0,075 M Kaliumchlorid-Lösung werden die Zellen gerade genug, um die richtige Chromosom verbreiten, ohne Lyse der Zellen ergeben anschwellen. Beim Hinzufügen vonder Carnoy-Fixativ-Lösung, müssen die ersten 5 ml zu dem Pellet unter Mischen zugegeben werden. Dies gewährleistet, dass alle zusätzliche Proteine ​​werden vor dem Speichern der Herstellung von Folien oder Proben entnommen. Wenn in dem Fall, dass die Zellen nicht gut genug gemischt, wird eine gelbe Kappe Protein auf der Oberseite des Pellet zu bilden, die bei der anschließenden Verfahren zu Komplikationen führen kann.

Die richtige Folie Vorbereitung ist unerlässlich. Während Fallenlassen des resuspendierten Zellpellet auf Objektträger, stellen Sie sicher, dass der Schieber auf ca. 45 ° Winkel geneigt und es gibt genügend Abstand (mindestens 2 cm) aus der Pipette auf den Objektträger, so dass die Chromosomen korrekt auf den Objektträger für die Analyse zu verteilen . Überschwemmung die Folie mit Fixiermittel unmittelbar nach Ablegen der Zellen auf dem Objektträger wird auch helfen, die Chromosomen zu verbreiten. Temperatur und Luftfeuchtigkeit, die, wie schnell die Zellsuspension trocknet an der Folie beeinflussen, sind andere Faktoren, die Einfluss auf Chromosom verbreiten. Diese können Herstellung von Folien in einer Umgebung mit etwa 50% Feuchte und einer Temperatur von etwa 20-25 ° C kontrolliert, und / oder indem gleitet auf einer Trägerwärmer für schnelleres Trocknen. G-Banding, der Hauptfaktor, der die Qualität der Chromosomen beeinflusst, ist die Trypsin Belichtungszeiten. Bei einer längeren Exposition Trypsin, erscheinen Chromosomen verteilt und geschwollen. Umgekehrt wird ein unzureichend kurze Chromosomen mit Trypsin-Inkubation nicht zu unterscheiden Bands und wenig Kontrast ergeben. Das Trypsin Inkubation Timing ist Änderungen vorbehalten abhängig von jedem spezifischen Zelllinie und Erntebedingungen. Deshalb sollte ein Vertreter G-gebändert Folie zuerst bereit ist, die Bedingungen vor der Färbung Trypsin den Rest der Folien zu evaluieren. Fetales Rinderserum verwendet, um die Trypsin-Aktivität vor der Färbung zu inaktivieren. Wir stellen das Protokoll mit Giemsa (GTG), aber Wright-Färbung anstelle Giemsa für GTW Streifenbildung und führt zu ähnlichen Ergebnissen verwendet werden.

t "> Dieses Verfahren ist relativ preiswert und effektiv durchzuführen. G-Banding kann verwendet werden, um Chromosomenanomalien, wie Translokationen, Deletionen und Aneuploidie, die üblicherweise bei malignen Erkrankungen, genetischen Störungen gesehen werden Diagnose-und Stammzellen in vitro kultiviert werden 10,11 , 13. Dies bietet die unverzichtbaren Visualisierung des Chromosoms Verfassung und die globale Bewertung des gesamten Genoms in mehreren Zellen. Es wird allgemein in klinischen und Forschungslabors weltweit für die Diagnose, Prognose und Bewertung der therapeutischen Krebszellen 10. Pränatale und verwendet postnatale Gewebeproben werden routinemäßig zur Identifizierung von numerischen und strukturellen Anomalien, genetische Erkrankungen wie z. B. Down-Syndrom verursachen ausgewertet. Stammzellen können schnell auf das Vorhandensein von Chromosom Instabilität ausgewertet werden. Jedoch ist die Auflösung von G-Bändelung für die Identifizierung von begrenzt Mikrodeletionen oder komplexe Chromosomenanomalien wie in metas gesehentatic Malignomen.

Deshalb, wenn Routine-Chromosom G-Banding ist mit Verfahren wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH), und spektrale Karyotypisierung (SKY) ergänzt, die Erkennungsrate von Chromosomenanomalien 23 drastisch erhöht. Aus diesem Grund ist die Verwendung des vorliegenden Protokolls in Kombination mit diesen anderen molekularen zytogenetischen Verfahren wird zunehmend von verschiedenen Laboratorien für die Auswertung von Chromosomen Instabilität sowohl in der klinischen Forschung und die Einstellung von 13 bis 15 verwendet.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

In dieser Handschrift beschriebenen Arbeiten wurden mit Mitteln des Patrick F. Taylor Stiftung ermöglicht.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KaryoMAX Colcemid Gibco 15212-012
HBSS Buffer Gibco 24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x Gibco 15400-054
Permount Fisher Scientific SP15-100
Buffer Tablets "GURR" Gibco 10580-013
Geimsa Stain Ricca Chemical Company 3250-16
Centrifuge 5810 Eppendorf
Methanol Caledon Laboratory Chemicals 6700130
Glacial Acetic Acid Krackeler Scientific Inc. 11-9508-05

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Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).More

Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).

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