Kromosomer kan bli isolert fra levende celler slik som lymfocytter eller hudfibroblaster, og fra organismer inkludert mennesker eller mus. Disse kromosompreparater kan videre benyttes for rutinemessig G-banding og molekylære cytogenetiske prosedyrer som for eksempel fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH), og spektral karyotyping (SKY).
Kromosom (cytogenetisk) analyse er mye brukt for påvisning av kromosom ustabilitet. Ved etterfulgt av G-striper og molekylære teknikker som fluorescens in situ hybridisering (FISH), har denne analysen den kraftige evne til å analysere de enkelte celler for forstyrrelser som involverer gevinster eller tap av deler av genomet, og rearrangementer som omfatter en eller flere kromosomer. Hos mennesker, kromosomfeil forekommer hos ca 1 pr 160 levendefødte 1,2, 60-80% av alle spontanaborter 3,4, 10% av dødfødsler 2,5, 13% av personer med medfødt hjertesykdom 6, 3-6% av ufruktbarhet tilfeller to, og i mange pasienter med forsinket utvikling og fødselsskader 7. Cytogenetisk analyse av malignitet er rutinemessig brukt av forskere og klinikere, som observasjoner av klonale kromosomavvik har vist seg å ha både diagnostisk og prognostisk betydning 8,9.60; Kromosom isolasjon er uvurderlig for genterapi og stamcelleforskning organismer, inkludert ikke-menneskelige primater og gnagere 10-13.
Kromosomer kan bli isolert fra celler av levende vev, inkludert blod-lymfocytter, hudfibroblaster, amniocytes, placenta, benmargen, og vevsprøver. Kromosomene er analysert ved meta stadium av mitose, når de er mest kondensert og derfor mer synlig. Det første trinn i kromosomet isolasjon teknikken innebærer oppbrytning av spindefibre ved inkubasjon med Colcemid, for å hindre at celler fra å gå frem til det etterfølgende anaphase stadium. Cellene blir deretter behandlet med en hypoton løsning og bevart i sin utvidete form med Carnoy sin fikseringsmiddel. Cellene blir deretter slippes på ved sidene, og kan deretter benyttes for en rekke prosedyrer. G-banding omfatter trypsin behandling etterfulgt av farging med Giemsa å skape karakteristisk lys og mørke striper. Den samme procedure å isolere kromosomer kan anvendes for fremstilling av celler for prosedyrer som for eksempel fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH) og spektral karyotyping (SKY) 14,15.
Kromosomanalyse er en konvensjonell teknikk benyttes over hele verden til å diagnostisere kromosom ustabilitet og rearrangements fører til genetiske lidelser og malignitet 1,2,8,9. I tillegg kan en høyere oppløsning for diagnose og forskning av konstitusjonelle og kreft-ervervet genetiske avvik oppnås med en kombinasjon av de klassiske cytogenetiske prosedyrer og molekylære cytogenetiske metoder som fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH) , og spektral karyotyping (SKY) 14,15. I den senere tid har disse teknikker blitt benyttet for evaluering av kromosom ustabilitet forbundet med stamceller. Karyotypic abnormaliteter som aneuploidy av langsiktige dyrkede embryonale celler (ES) og voksne stamceller av ulike organismer har blitt rapportert av flere laboratorier. Nyere bevis støtter at noen cellelinjer er iboende mer tilbøyelig til kromosom instabiLity uavhengig av kultur forhold. Av denne grunn, ved å etablere og / eller opprettholde menneske, mus eller Rhesus stamcellelinjer, er kromosom analyse anbefalt som en del av kvalitetskontrollen. Mange rapporter beskriver den økende interesse for bruk av rutinemessige og molekylære cytogenetikk å overvåke det kromosomale stabiliteten av stamceller og maligne celler eller forskjellige organismer i kulturen 10-13. Disse protokollene er i økende grad blir brukt av nongenetic laboratorier for rask kromosom vurdering av sine dyrkede celler 13. Vi presenterer våre grunnleggende prosedyrer for kromosom forberedelse fra ulike celletyper, som kan brukes for både klinisk og forskningsformål og celler som stammer fra ulike organismer.
Vi har benyttet dagens prosedyre for kromosom isolert fra celler av ulike organismer, inkludert ulike celletyper hentet fra menneske, rhesus-aper, rotter og mus 11,20-22. Standarden protokollen er gitt, men enkelte viktige skritt og variabler kan være nødvendig å justere for disse ulike typer celler. Flere konkrete tiltak er avgjørende både i kromosom forberedelse og G-banding for å sikre best mulig kvalitet på resultatene. En av de variable som kan påvirke analysen, er den Colcemid inkubasjonstid. Ut…
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet er beskrevet i dette manuskriptet ble gjort mulig ved midler fra Patrick F. Taylor Foundation.
KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |