Summary
RPPA支持数百个样品，印在硝酸纤维素幻灯片同时进行审讯，用荧光标记的抗体蛋白的表达。这项技术已被应用在肾透明细胞癌的药物治疗的非均质性研究的效果。
Abstract
目前还没有治愈的疾病治疗的转移性肾透明细胞癌，最常见的变种。这种治疗性的一个关键因素被认为是分子复杂性的疾病1。如酪氨酸激酶抑制剂（TKI），舒尼替尼靶向治疗已被使用，但只有40％的病人会响应，这些患者绝大多数复发1年以内2。因此在肾细胞癌患者的内在和获得性耐药的问题是高度相关的。
为了研究抗酪氨酸激酶抑制剂，制定有效的个性化治疗的最终目标，有针对性的治疗后，在规定的顺序组织是必需的，已被证明是成功的做法，在慢性粒细胞白血病4。然而，这样的策略在肾细胞癌的应用是复杂的，高层次的b超视距间和肿瘤的异质性，这是一个功能的肾细胞癌5,6以及其他实体瘤7。即使在建立类似的介绍，肿瘤的分期，分级的患者Intertumoral异质性由于转录和遗传差异的。此外，它是明确的，也有很大的形态（肿瘤内）的异质性RCC，这很可能代表更大的分子异质性。 RCC肿瘤的综合形态分析和Fuhrman分级详细的映射和分类，用户可以通过选择有代表性的地区蛋白质组学分析。
基于蛋白质的分析的RCC 8是有吸引力的，但由于其广泛的可用性，在病理实验室，它的应用可以是有问题的，因为供应量有限，特异性抗体9。由于斑点印迹性质的反相蛋白质阵列（RPPA），抗体的特异性必须Ë预先验证的，使用的抗体，这种严格的质量控制是非常重要的。尽管这一局限斑点印迹格式不允许检测的小型化，使数百个样品用于印刷到一个单一的硝酸纤维素滑动。然后，印刷幻灯片可以用类似的方式进行分析，Western印迹分析与特定目标初级抗体和荧光标记的第二抗体的使用，允许复用。在所有的样品在幻灯片上的差异蛋白质表达，然后可以同时分析在一个更具成本效益和高通量的方式进行比较的相对水平的荧光。
Protocol
1。形态学和分子肿瘤的异质性鉴定
- 肿瘤从-80℃的冰箱中取出并保持在干冰上。
- 划分成部分的约1厘米3的肿瘤。映射每个肿瘤的部分彼此相对，并与一个唯一的名称标签的原始位置。将样品存放在个别的离心管中，在-80℃，直到准备使用。
- 涂层样品在OCT和减少在低温恒温器在-22°C。
- 样品染色，苏木精和曙红counterstaining方法。
- 显微镜分析冰冻切片，以确保他们是CCRCC性质，可行肿瘤和分级（低年级，高年级或混合低/高档次，具有挑战性的，以区分富尔曼等级1到4个冰冻切片）。 图1一个与B̶（H＆E染色高，低和混合级）。
- 最多选择4个样本的从各形态不同的区域内每个肿瘤蛋白提取。
2。从肿瘤样本中提取蛋白质
- 切肿瘤样本华侨城。
- 将50-75毫克组织放入2 ml离心管，用990μl的裂解缓冲液[50 mM Tris-盐酸（pH值7.5），5mM的EGTA（pH为8.5），150mM的NaCl]补充有抑肽酶（Sigma公司A6279）（10毫克/毫升），磷酸酶抑制剂鸡尾酒2（西格玛，P5716），磷酸酶抑制剂鸡尾酒3（Sigma公司，P0044）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏，11836153001）。
- 添加一个5毫米的钢球，每个试管中，在50Hz 5分两次使用TissueLyser的水平的同质化后，每5分钟的时间内，检查和同质化。
- 匀浆后的样品转移到新的2 mL离心管，用吸管离开钢球落后。
- 在离心之前在4℃下以13,000 xg离心30分钟，向每个样品中加入10μl的Triton X-100的
- 转移上清到新鲜的离心管中。
- 确定蛋白质浓度用BCA方法（ 图2）。
- 标准化蛋白浓度为1毫克/毫升。
3。抗体验证
- 制备蛋白质样品（从合适的细胞系或组织中提取的），Western blot和10％的SDS-PAGE凝胶上运行。
- 到硝酸纤维素膜过夜转移样品在4℃下
- 座中的膜锂肺心病奥德赛阻断缓冲液（在PBS中稀释，50:50），在室温下1小时。
- 李-COR Odyssey封闭的缓冲稀释一抗（50:50 PBS稀释）在制造商推荐的稀释通常为1千。
- 在4℃下孵育膜在初级抗体过夜
- 上涨0.1％PBS-吐温20（PBS-T 1毫升吐温20 / 1L PBS）。
- 在室温下搅拌5分钟（×3），用PBS-T洗膜。
- 稀释荧光标记的二抗奥德赛封闭缓冲液（50:50 PBS稀释）0.01％SDS于1:10,000稀释液（1.5μl/15毫升）的。
- 在二次孵育膜抗体在室温下轻轻摇动45分钟 - ，重要的是从这样的时间的光，直到保护膜，因为它已被最终扫描。
- 在室温下用PBS-T洗膜5分钟（×3），在黑暗中保持膜。
- 在PBS中洗膜，在室温下搅拌5分钟（×3），以除去残留的Tween20的，再次保持在黑暗中的膜。
- 躺在膜平放在一块滤纸在黑暗中，在空气中干燥 - 干的膜增强信号，降低背景，但它是无用的剥离和重新探测。
- 扫描膜上的LICOR的奥德赛扫描仪。保持膜，然后在黑暗的时间，因为它已被扫描。
- 仅选择的抗体，产生一个单一的主要带在正确的分子量。 图3示出了用于与RPPA可接受和不可接受的抗体的例子。
4。 RPPA小学nting
- 蛋白裂解液点在硝酸纤维素镀膜玻璃幻灯片（Fastslides Whatman公司）使用微网II机器人的检举。所使用的幻灯片中包含2片上的样品被发现。每个焊盘被察觉与相同的样品，在这种情况下，100个样品。其他可用的格式包括：1，第8和16个垫幻灯片。越高的焊盘数量的小的样本数，可以察觉到每个。
- 5 2 - 倍稀释液A系列作了从每个样品中，然后发现在每个一式三份（导致每个样品中的总共15个斑点）。
5。 RPPA蛋白检测
- 湿幻灯片超过LICOR封闭液（50:50 PBS稀释）。在RT下孵育1小时上摆动平台。
- 准备800微升的初级抗体LICOR阻断缓冲液（在PBS中稀释，50:50）中，在所需浓度，并保持在冰上。
- 安装：（i）本框架芯片夹中的幻灯片或（ii）'FastFrame'四槽滑动架，以便紧密的密封之间形成的滑动和孵化室。
- 清除残留的缓冲区中井和各孔加600μl的主要抗体。
- 放置成一密封的湿盒和摆动平台4℃过夜孵育滑动和室℃。
- 化妆0.1％PBS-Tween20的PBS（PBS-T;100μl的吐温20/100毫升PBS中）。
- 删除幻灯片从寒冷的房间，小心地取出每口井的主要抗体。
- 加入600微升的PBS-T洗上滑动，在RT下5分钟（X3）的摆动平台。
- 准备荧光标记的第二抗体，稀释在Odyssey封闭缓冲液（在PBS中稀释，50:50）0.01％SDS在1:2,000稀释液（1微升/ 2毫升）中的第一个实例。
- 删除缓冲区中井和各孔加600μl荧光标记的二抗。二次抗体，在室温下孵育45分钟，轻轻摇动 - 它重要的是，直至时间，因为它已被最终扫描的光保护膜。
- 删除从以及，并简要洗涤（×3），在室温下在600μl的PBS-T中的二抗。从载体中移除滑动，转移到一个合适的容器中，并在过量的PBS-T洗15分钟，保持在黑暗中的膜。
- 删除的PBS-T，并进一步在室温下用PBS洗膜15分钟，以除去残留的Tween-20的，再在黑暗中保持膜。
- 在50°C的烘箱中10分钟，然后擦干Fastslide LI-COR的奥德赛扫描仪扫描。保持在黑暗中的幻灯片，直到它被扫描。
- 在680 nm和/或800nm的根据二次抗体/抗体用于扫描的滑动。对于两色的检测一直使用高度交叉吸附的抗体，以减少交叉反应。仔细选择两色检测原发性和继发性抗体是必要的。最重要的是选择种不同的主机（ 例如，兔和小鼠）的两个主要的抗体。这允许与易于分辨的发射光谱染料标记的抗兔抗小鼠二次抗体的歧视。
- 图像文件保存为TIFF文件。 图4（图像扫描的文件）。
6。数据分析
- 中启动MicroVigene软件（VigeneTech，卡莱尔，MA，USA）。
- 打开TIFF图像文件包含扫描的RPPA幻灯片。
- 选择预定义的模板文件，该文件将有一个网格，覆盖在图像上的RPPA幻灯片。
- 点击定义区域的利息 （ROI）按钮，调出网格。
- 网格定位在RPPA点。 图6a（网格图像的图像）。
- 点击全选按钮以突出显示所有的投资回报率。
- 单击“ 查找全部”。 MicroVigene将AUTOMatically的投资回报率，发现斑点，减去的背景下，清除所有灰尘和量化点。
- 点击查看稀释曲线“按钮，将所有的样品上的RPPA的幻灯片的结果。
- 单击“ 保存”稀释数据 。
- 各一式三份，因为每个样本被印在星稀释点有15个点来分析，从而降低了发生错误的风险，提高的曲线拟合的质量。 MicroVigene产生四参数的逻辑对数模型“Supercurve”算法（ 图6b），结合点，以产生抗原抗体结合动力学的S型曲线。的假设是，相同的抗体-抗原结合动力学发生在每个采样点，即使在不同的样品，从而可以增加通过采取在阵列上的所有点，以适应一个共同的响应曲线的曲线拟合10,11的信心
Y = A +（（BA）/（1 + E（C * D-LN（X）））
其中x是dilutio的n因子和Y信号的强度。
样品可比较分析使用的Y0值，这在我们的分析到supercurve映射后的x值的中点对应的y值。 - 情节Y0在Microsoft Excel中的数据导出， 如图7所示 。
- 方差分析框架中未处理和处理过治疗的患者中，肿瘤内蛋白质的变异分别计算。结合从所有分析蛋白质的数据的方差分布进行了比较由Mann-Whitney检验（MWT）。瘤内个别蛋白质的差异进行了比较，通过F-检验，正态性和方差齐性的假设认为，分别评估使用Lillefours和Fligner测试;错误发现率（FDR）校正12。未处理和处理病人样本之间的差异蛋白质表达对于每个蛋白质进行了测试，使用学生的t检验，正态性和方差齐性的假设S分别为满足，否则MWT进行FDR应用在组合的t检验和MWT值12。蛋白表达的意义和方差Pearson相关的蛋白质，估计使用标准的方法[R参考和FDR应用12。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
一个的扫描RPPA滑动一个例子可以看出，在图4（i）与680和800 nm的通道所示。由图4（ⅱ）中的波长，使分离的图像每个焊盘上的RPPA滑动以进行分析，并确定图4（ⅲ）中的单独的蛋白表达。正如图4可以看出，在（iii）该个别蛋白质表达的整个样品与凝溶胶蛋白具有高的表达水平横跨幻灯片cMYC具有低得多的蛋白表达相比是独特的，但仍然普遍表示在所有的样品测试。相反，CD10的给变量表达式，与某些样品给予高的表达水平，尽管其他样品，具有很少或没有表达检测的。最后pJAK2没有产生任何可检测的蛋白表达上述背景水平。从质量控制的角度来看的pJAK2的结果将是不可接受的，而那些CD10将是可接受的，因为检测到的蛋白的表达水平在幻灯片上的样本的数量， 图5示出了突出另一个物种的二次抗体与第一抗体之间的交叉反应性的缺乏。可以看出，在图6的一个例子的用于通过一个单独的幻灯片来计算样品的Supercurve。这些曲线是用于产生相对的蛋白质为基础的表达数据，如在图7（交流），图7a示出了有代表性的跨的三个RPPA幻灯片突出显示，如何RPPA可以检测处理和未经处理的样品之间的差异的蛋白质的表达水平。 图7b的重点上的差异蛋白质表达水平的样品后，从图7a中被分组的基础上处理，具有较高的蛋白质的表达被发现是在预处理。 图7c重点上的较高的肿瘤内后处理样品后的样品进行了分组治疗的基础上，具有较高的变异被发现后处理样品的方差。
图1a。组织样品的预处理组织冰冻切片与的相关H＆E染色地图
图1b。组织样本的后处理组织与地图相关的H＆E染色的冰冻切片
图2。设置Bradford法测定蛋白质，我ncluding校准曲线，结果表和96孔板格式。 点击此处查看大图 。
图3实施例的合适的和不合适的初级抗体用于与RPPA
图4。RPPA扫描过程的流程图。 点击这里查看大图 。
图6a。装修网格上“RPPA滑动景点。 点击此处查看大图 。
图6b的SuperCurve 实施例，其用于比较分析的所有样本上RPPA幻灯片。绿点表示“接受能点“，红色代表”出类拔萃的人“，在分析软件中基于预定义的限制。
图6c中的斑点的样品的再现性实施例中，所示的例子包括对单个样品中除空白5稀释的一式三份斑点。
图7a典型RPPA 数据的蛋白质（MLH1）相比，在多张幻灯片。每个样品对应于肿瘤的子区域。
图7b。分化人MLH1前和治疗后的样品蛋白的表达。
图7c。前处理和后处理样品之间的差异在MLH1表达。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RPPA这里介绍的方法代表一个高吞吐量的替代广泛使用，但相对较低的吞吐量的蛋白质分析的免疫印迹技术。该方法允许数百个样品是半定量的分析和比较，同时允许在很宽的选择的细胞系和组织样品中的关键蛋白的直接比较。复用与不同的抗体物种进一步增加电源的技术允许同时使用多种抗体。这里介绍的例子强调的能力RPPA在研究肿瘤的异质性和异质性靶向治疗的效果。
作为一种技术RPPA一些关键步骤抗体的选择是最重要的。由于斑点印迹技术抗体特异性的性质不能被证实在分析过程中，必须是确定的，在使用之前。在目前的研究中，83抗体是有效的ated在西方通过印迹，其中只有58〜30％的失败率。在这58，55的抗体给了可接受的结果分析在RPPA（成功率95％）。其他关键步骤包括选择时的浓度，发现样品的RPPA以及滑动均匀的点状出血。较高浓度更敏感的结果，但可能会导致较少的样本被发现由于没有足够的蛋白质的存在。的最小量的组织，这将提供足够的蛋白RPPA斑点是肿瘤依赖。 RCC的最低使用允许多个子部分的肿瘤是分析，同时仍然保持了斑点的1毫克/毫升的浓度50毫克。均匀点状出血的分析也很关键假设所有样本都在一个单一的浓度发现，虽然这可以验证使用总蛋白抗体滑动后点滴出血。最后考虑的是要使用的控制样品使用样品时，数字是如此之高，他们可以不被发现的情况一样，在这里的例子在一个幻灯片。在此处使用的示例中，我们引入蛋白从肾细胞线，以及从人脐静脉内皮细胞株作为对照。细胞系的蛋白质允许使用大量的蛋白质提取和使用多张幻灯片。控制补偿任何由于斑点或抗体孵育的固有误差，并补偿的偏差由于被用于在不同的日子不同的用户和幻灯片。
RPPA作为一种技术是灵活的与要使用的样本的数目。这里介绍的例子〜300个样本，45个肿瘤样本分布在三个幻灯片，每张幻灯片上2片。此外，目前已发现1垫在一个幻灯片格式。这样的格式可以定制的个性化需求的实验，垫在投影片上更多的抗体可以同时使用，但限制的样品数普莱斯。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者FCO，DF，JN，DJH和GDS的工作上面提到的由由英国癌症研究中心实验癌症医学中心的首席科学家办公室，项目编号：ETM37和支持。 AL的工作是由皇家爱丁堡外科的护理和治疗癌症和医学研究理事会罗伯逊信托，梅尔维尔信托。 IO的支持，玛丽·居里行动和英国医学研究理事会共同资助的英国皇家学会的爱丁堡苏格兰政府奖学金。作者想感谢SCOTRRCC共同申请人及其合作者提出了有用的讨论本文讨论的主题。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aprotinin | Sigma | A6279 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 | |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 | |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | ||
| FastFrame' four bay slide holder | Whatman | 10486001 | |
| FAST Slide - 2-Pad | Whatman | 10485317 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
- Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
