Summary
Citrobacter rodentium 감염이 장의 세균 감염을 공부뿐만 아니라 마우스의 면역 반응 및 대장염를 개최 할 수있는 중요한 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 장벽 무결성, 병원체 부하와 손쥐 전염성 대장염에 대한 병원체 및 호스트 공헌의 철저한 특성을 허용하는 조직 학적 손상의 측정을 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜은 전염성 질환과 대장염의 강력한 모델을 생산하는 데 필요한 단계뿐만 아니라, 마우스에 Citrobacter rodentium 감염을 특징하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. C.는 rodentium는 밀접하게 임상 적으로 중요한 인간 병원체 enteropathogenic E. 관련되어 g 제외, 손쥐 특정 세균 병원균입니다 대장균 및 enterohemorrhagic E. 대장균. C.로 감염시 rodentium, 면역 적격 마우스는 겸손과 과도 체중 감소, 설사로 고통 받고 있습니다. Histologically, 장 토굴 신장, 면역 세포 침투 및 고 블렛 셀 고갈을 준수하고 있습니다. 감염의 등급이 3-4주 후 이루어집니다. 감염 후 다른 시간 지점에서 장 상피 장벽 무결성, 박테리아 부하 및 조직 학적 손상의 측정은 감염에 민감 마우스 종자의 특성을 수 있습니다.
독성 메커니즘s이 (가) 세균성 병원체가 자신의 호스트,뿐만 아니라 감염에 대한 방어를 특정 호스트 응답의 창자를 이식하는이 제대로 이해하고 있습니다. 따라서 C. 장용 세균 감염의 rodentium 모델은 이러한 프로세스에 대한 우리의 이해에 도움이 할 수있는 유용한 도구 역할을합니다. 장용 박테리아는 또한 염증성 장 질병 (IBDs)에 연결되었습니다. 그것은 IBD 환자에서 볼 수 maladaptive 만성 염증성 반응이 장의 박테리아에 장 점막 면역 시스템의 이상 노출 후 유전자 민감한 개인에 개발하는 가설되었습니다. 따라서, 전염성 대장염의 모델의 연구는 장용 박테리아에 잠재적으로 병원성 호스트 응답을 정의하기위한 중요한 가능성을 제공합니다. C.는 rodentium 유도 대장염은 IBD의 pathogenesis의 잠재적 인 메커니즘에 대한 우리의 이해를 발전, 장용 박테리아에 대한 호스트 응답의 분석을 허용 하나의 희귀 한 모델이다;소설 예방 및 치료 치료의 개발에 필수적.
Introduction
장용 세균 병원균에 의해 감염이 위장 (GI) 염증뿐만 아니라, 설사 및 장 상피 장벽 기능 장애 등의 장 병리학 및 pathophysiology을 트리거합니다. 세균성 병원체가 자신의 호스트,뿐만 아니라 감염에 대한 방어를 특정 호스트 응답의 GI 기관을 식민지화하는이 독성 메커니즘이 잘못 이해되어 장용 세균 감염의 모델링에 그러나 최근 발전은 이러한 프로세스에 대한 우리의 이해를 돕기 위해 시작했습니다. 장용 박테리아는 또한 염증성 장 질병 (IBDs)에 연결되었습니다. IBDs Crohn의 질병 (CD)와 UC 만성 장 염증 및 조직 손상을 특징으로 알 수없는 병인의 복잡한 질병입니다. 이러한 dextran 나트륨 황산 (DSS)와 D와 같은 화합물과 화학 도전에, 마우스 - / - 장 염증의 많은 마우스 모델은 IL10와 같은 유전자 변형 종자에 자연스럽게 염증의 존재initrobenzene 설 폰산 (DNBS) 1. 그것은 IBD 환자에 존재 maladaptive 만성 염증성 반응이 장의 박테리아에 장 점막 면역 시스템의 이상 노출 2, 그러므로 전염성 대장염의 모델의 연구는 잠재적으로 병원성 호스트를 정의하는 중요한 가능성을 제공에 유전자 민감한 개인에 개발하는 가설되었습니다 . 장용 박테리아에 대한 답변 Citrobacter rodentium 유도 대장염은 장의 박테리아와 IBD의 pathogenesis의 잠재적 인 메커니즘의 추가 이해에 대한 호스트 응답의 분석을 위해 수 있도록 잘 1,3를 특징으로 한 감염성 대장염의 희귀 모델 중 하나이며, 필수 단계 소설 예방 및 치료 치료를 개발 인치
C. rodentium는 밀접하게 중요한 인간과 관련되어 (A / E) g 부착 부정적인 및 나온다, 손쥐 특정 세균 병원균입니다병원체 enteropathogenic E. 대장균 (EPEC) 및 enterohaemorrhagic E. 대장균 (EHEC) 3-8. A / E의 병원균의 가족은 깊은 숙주 세포에 비 침습적 받침대와 같은 구조를 형성 cecal과 colonic 상피의 꼭대기 숙주 세포 막에 첨부합니다. C.이있는 구두 도전 10 8 -10 9 생물의 rodentium은 crypts, mononuclear 면역 세포 침투와 고 블렛 셀 고갈 3,4의 colonic 증식이나 신장을 특징으로 전염성 대장염의 강력한 모델을 생산하고 있습니다. 식민지의 초기 사이트는 몇 시간 도전 한 후, cecal 패치에 2-3일 감염 3 후 말초 콜론으로 진행을합니다. 면역 적격 마우스 변종에서 병원균의 등급이 3-4주 감염 1,3,4 후에 이루어집니다. 그러나 많은 유전자 변형 종자는 즉, 유전자 결함 또는 녹아웃 (- / -) 생쥐는 increa를 표시 할 수 발견되었습니다과장 손상 및 / 또는 만성 감염과 염증 9-14의 결과로 감염에 느끼기 쉬운 상태를 SED. 이 녹아웃의 변종이 전염성 대장염 모델의 사용, 본래 신호 단백질이 부족한 많은 사람들이, 장 감염 및 염증의 해상도에 필수적인 여러 호스트 단백질을 드러내 indispensible있다.
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Protocol
1. Citrobacter rodentium Inoculum와 마우스의 사정 Gavage의 작성
- 준비와 Luria Bertani 국물 (LB)를 압력솥.
- 가능한 C.를 얻을 멸균 inoculating 루프 또는 피펫 팁을 사용하여 LB 한천 플레이트로 냉동 글리세롤 주식과 승리의 rodentium. 37 ° C 하룻밤에 품다. inoculating 루프 또는 피펫 팁을 사용하여 LB 플레이트의 식민지로 매 문화 관 멸균 LB의 국물 3 ML의 예방. inoculum의 준비는 무균 기술을 사용하여 수행해야합니다.
- C.를 품다 rodentium 문화 aerobically 37 번 ° C 200 rpm으로 benchtop 부화 흔드는에서 하룻밤. 주사 LB의 국물은 밤새 문화 흐린 후 나타납니다.
- 전구를 사용 밤새 C. 100 μl 각 마우스를 gavage하기 위해 1 ML의 주사기에 부착 된 위 gavage 바늘을 팁 rodentium 문화. 단단히 목 다시 위에 느슨한 피부를 쥐었고하여 부드럽게 안녕하세요, 마우스를,엄지와 손가락. 머리를 고정하고 gavage 바늘의 삽입을 위해 식도를 바르게 색인 손가락으로 동물의 머리를 뒤로 당겨.
- 수직 위치에 마우스를 유지하고 입의 측면을 따라와 혀 위에 gavage 바늘의 전구 팁을 지시. 부드럽게 입의 지붕을 따라 바늘을 통과하고 식도를 내려 향상. 이 절차를 수행하는 동안 느낌이 어떤 저항이있을 경우 gavage 바늘을 제거하고 다시 삽입합니다.
- 천천히 세균 inoculum 100 μl를 삽입하고 부드럽게 gavage 바늘을 제거합니다. 그 케이지에 반환 한 후 마우스의 호흡 속도와 동작을 모니터링 할 수 있습니다.
참고 사항 :
- 2 단계와 3 단계에서 또한 국물 자체의 어떤 세균 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 밤새 배양 할 무균 LB의 국물 3 ML과 무균 기술을 사용하여 매 문화 튜브를 준비합니다. LB의 국물은 밤새 문화 이후에 명확 나타납니다.
- 이 24 시간 이상 주사 한 경우 숙박 문화는 폐기해야합니다.
- 모든 C. 감염된 동물의 rodentium 감염 및 주택은 바이오 레벨 2 시설에서 수행되어야한다.
2. C.에 Colonic 상피 장벽 투과율 측정 rodentium에 감염된 마우스
- 원하는 시점 이후의 감염에 장벽 무결성을 측정합니다.
- 검정의 날, 4 kDa fluorescein의 isothiocyanate (FITC) - dextran 150 μl 각 마우스를 gavage하고 표준 곡선을 준비하는 80 MG ML -1의 농도로 생리 (PBS)를 버퍼 인산에 용해 충분한 준비합니다.
- FITC-dextran의 150 μl와 안녕하세요, 마우스와 gavage. 이 시간에 우리를에서 음식을 철회 할 수 있습니다.
- 후 마우스에게 4 시간을 마취gavaging 및 심장 구멍을 통해 가능한 한 많은 양의 피 (~ 450 μl)로 수집합니다. 응고를 억제하는 microcentrifuge 관 3퍼센트 산 구연산의 덱스 트로 오스의 최종 농도에 혈액을 추가합니다. 쥐를 안락사시켜야하고 박테리아 카운트 (단계 3.1-3.5)에 대한 PBS에서 colonic 조직을 수집하고 조직 고정 용 포르말린, 그리고 궁극적으로 immunofluorescence 얼룩 10 % (단계 4.1-4.8)에 있습니다.
- 4 ° C.에서 원심 분리기에서 12 분 1,000 XG에서 혈액 샘플을 스핀 혈청을 수집하여 PBS의 10분의 1과 1 / 100 희석. 복제에 96 잘 판에이 두 dilutions 각 샘플 100 μl를 추가합니다.
- 표준 곡선을 준비하려면 원래의 80 MG ML -1 FITC-dextran은 다음과 농도에 PBS에서 쥐를 gavage하는 데 사용 희석 : 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 μg / ML . 세중의에 96 잘 판에 각 농도 100 μl를 추가합니다.
- 여기 WAV에서 fluorometer를 사용하여 각 샘플의 형광을 수량화485 나노 미터와 535 nm의 방출 파장의 elength.
- 표준 곡선을 음모하여 원시 데이터를 분석합니다. 입력 각 샘플에 FITC-dextran의 농도를 결정하기 위해 표준 곡선에 의해 생성되는 라인의 방정식에 각 샘플에 대한 원시 데이터입니다.
참고 사항 :
- 4 단계 이후로, 얼음에 혈액 샘플을 유지하고 빛에 노출을 최소화합니다.
- 심각한 조직 손상이이 시점 이후에 발생로 시점에서, 또는 그 이전에 상피 장벽 무결성을 측정 할 경우 7 일 이후 감염 최적입니다. 심각한 피해가 발생하기 전에 장벽 무결성을 측정하면 C. 동안 투자율의 최대 차이를 확인할 수 있습니다 마우스 변종 사이의 rodentium 감염.
- 감염되지 않은 컨트롤 마우스도 상피 장벽의 무결성에 대한 테스트되어 있는지 확인합니다.
3. C.의 조직에서 세균 하중 측정 rodentium에 감염된 마우스
- 한 ML 멸균 PBS를 추가ND은 원형에 구슬 autoclaved 금속은 무균 기술을 사용하여 두 ML의 원심 분리기 튜브를 버린. 각 동물로부터 수집 된 개인 조직은 별도의 PBS 튜브에 배치됩니다. 조직의 추가하기 전에 튜브를 무게.
- 마우스에서이게 맹장과 결장을 제거합니다. 콜론에서이게 맹장을 분리하고 집게를 사용하여 luminal 내용을 밀어. PBS 관에 내용을 추가합니다. 10% 포르말린 고정의 말초 콜론과이게 맹장에서 0.5 cm 섹션을 분리 한 후 길이 방향으로 나머지 콜론과이게 맹장을 잘라 튜브에 조직을 배치하기 전에 멸균 PBS로 씻어.
- 조직과 PBS 튜브를 무게 그리고 30 Hz에서 6 분을 위해 구슬 때리는를 사용하여 샘플을 균질화.
- 무균 기술 사용 96 잘 플레이트에 잘 당 180 μl 멸균 PBS를 추가합니다. 각 행의 첫 번째도 각 균질 샘플의 20 μl를 추가합니다. 잘 섞어서 순차적으로 (먼저 10 -1에서 dilutions를 얻기 위해 잘 각 이전에서 20 μl를 추가 희석10 -6까지) 붙인다. 그리드와 사각형 바닥 LB 플레이트에 세중의 각 샘플에서 각 희석의 플레이트 10 μl. 37 박 품다 ° C.
- 그리고 평균 식민지 성형 단위 (CFU), 3 카운트를 계산하고, 각 샘플이 계산 된에 희석를 기록합니다. 원래 1 ML 샘플의 20 μl이 사용 된 것처럼, 50으로 평균 CFU를 곱하며, 샘플 CFU / ML의 결과로 계산 된에 희석 요인에 의해. 마지막으로, CFU / g를 결정하는 조직 무게로 나눕니다.
4. 조직 학적 평가와 감염된 장 조직의 Immunofluorescence 착색
- 단계 3.2에서와 같이 조직을 수집합니다. 포르말린 하룻밤에 저장 조직은 다음 70 % 에탄올로 씻는다. 파라핀에 조직을 추가하고 착색 5 μm 섹션을 잘라. 조직 학적 평가에 대한 hematoxylin & eosin으로 청바지와 immunofluorescence 얼룩을위한 다음 단계로 진행합니다.
- 이전 착색에 조직을 deparaffinize하려면, 장소에 슬라이드65 10 분에 대한 ° C 물 목욕에 coplin의 착색 병 등을 넣어. 다음, 2 분마다 네 개의 세차에 대한 크실렌의 장소 슬라이드. 95 % 에탄올, 75 % 에탄올과 DH 2 0 : 슬라이드가 다음 하나 5 분 다음 각 세척에 이어 100 % 에탄올에 두 개의 5 분 세차와 rehydrated해야합니다. 이러한 세차는 유해한 증기에 노출을 피하기 위해 퓸 배출 후드에서 수행해야합니다.
- 30 분의 증기선에 미리 예열 나트륨 구연산 버퍼 한 후 이곳의 coplin 병의 장소 슬라이드 한 다음 30 분에 앉아 보자. 이 과정은 단백질 잠재적 인 antigenic 사이트를 검색 포르말린 고정에 의해 형성된 간 링크를시킵니다.
- 5 분 세 번 PBS azide로 씻으십시오. 드라이 슬라이드와 조직에 지역화 착색의 시약을 유지, 소수성 장벽을 생성 할 수 PAP 펜과 조직 주변 마크 공간이 마련되어 있습니다.
- immunostaining 수분 챔버에서 차단 버퍼로 실온에서 1 시간 (예 : α-염소 혈청)에 대한 블록 조직.
- 꼼꼼한를 희석워 항체가 원하는 농도에 항체 희석 버퍼를 사용합니다. 버퍼를 차단 해제 넣어와 조직에 주요 항체의 50-100 μl를 추가합니다. 4 2 시간에 ° C 야간이나 실내 온도에서에 품다.
- 5 분 세 번 PBS azide로 씻으십시오. 어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서 조직 및 배양에 항체 희석 버퍼에 희석 이차 항체의 50-100 μl를 추가합니다. 5 분 세 번 DH 2 O로 씻으십시오.
- DAPI 골드 장착 중간을 연장하고 coverslip을 적용 추가 슬라이드를 탈수. 형광 현미경 슬라이드를 표시합니다.
참고 사항 :
- PBS azide는 4 단계 이후의 세척 매체의 박테리아 성장을 방지 할 수있는 대안으로 신선하게 조리 된 PBS로 대체 할 수 있습니다.
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Representative Results
표준 감염 실험이 진행되는 동안, 마우스는 100 μl 박 C.의 gavage을 통해 약 2.5 X 10 8 CFU에 감염된 rodentium 문화. C.와 C57BL / 6 마우스의 감염 겸손과 과도 체중 감소, 설사에 rodentium 결과이다. C57BL / 6 마우스와 드문, 동물은 병이되고 euthanization가 필요할 수 있습니다 있지만. 따라서, 쥐가 다른 변종은 감염에 의해 영향을받습니다 할 수있는 범위를 결정하기 위해, 체중 감소 및 piloerect 모피 hunched 자세로 고통의 증상의 정도에 대한 모니터링해야합니다.
4 그림 1에 제시 결과는 냉동 글리세롤 주식에서 준비 하룻밤 문화를 사용하여 수행 감염의 대표입니다. 칠일 후 감염에서 마우스 anesthetized 있었고, 피가 심장 주사를 통해 수집되었다. 그림 1은 FITC-dextran의 혈청에서 측정 표시C57BL / 6 마우스뿐만 아니라, 이전에 감염 9시 장애인 상피 장벽 무결성을 전시하는 것으로되어 수용체 2 (TLR2) 녹아웃 마우스 같은 전화에서. 그대로 장 상피 장벽의 존재에서, 4 kDa FITC - dextran이 계층을 통해 제대로 투과성입니다. 따라서 혈청에서 FITC-dextran의 증가 수준이 분자가에서 누출 할 수 있도록 감염시 장 상피 장벽의 무결성의 손상을 권장합니다. 제어로, FITC-dextran과 함께 gavaged 감염되지 않은 쥐 혈청 수준도 제공됩니다.
일주 후 감염으로 대장의 세균로드는 10 9 CFU / g 3,4 주위에 피크에 발견되었습니다. 세균로드는 감염을 확인하기 위해,뿐만 아니라 다른 녹아웃 마우스가 증가하거나 감소 박테리아 부담으로 고통하는 경우 평가 원하는 시간 포인트는 후 감염에서 측정 할 수 있습니다. C.로 rodentium 할 수 있습니다 밀접한 adh luminal 병원체입니다장 상피 세포, luminal 내용, cecal, 그리고 colonic 조직의 세균 하중에 오히려이 측정 할 수 있습니다. 그림 2는 C57BL / 6의 장 루멘 내에서 하루에 7 이후의 감염 cecal과 colonic 조직뿐만 아니라 측정 전형적인 세균로드를 보여줍니다 마우스.
병리학의 대부분은 C. 동안 관찰 C57BL / 6 마우스에 rodentium 감염은 colon11의 말초 2cm에 발생합니다. Macroscopically 7 일 후 감염에 의해 colonic 점막의 증점 안정제뿐만 아니라 대장의 길이 단축은 C57BL / 6 마우스에서 볼 약간의 명백한 손상과 관찰된다. 일반적으로 감염시, C57BL / 6 마우스 면역 세포 침투, colonic crypts과 블렛 세포 고갈 (그림 3)의 신장에 의해 histologically 특징 만 적당한 염증과 병리를 고통.
그림 3에서 H & E 섹션에서와 같이 여러 호스트 응답을 두어을 장착된다C.이있는 ING 감염 rodentium. 자세한 변경 사항을 특성화하기 위해 immunofluorescence 얼룩은 이러한 확산의 마커, 세포 죽음, 또는 타고난 및 적응 면역 반응으로 관심 단백질의 변화를 조사하기 위해 이용 될 수 있습니다. Immunofluorescence 착색는 감염된 조직 내에서의 현지화로 세균 응답의 측면을 검토에서도 유용합니다. 이 염색 기법의 예를 들어, 호스트 단백질 ki67 (빨간색), 세포 증식 및 C.에 대한 마커를 검토 하루에 12에서 세균 현지화를 검토 할 수 rodentium 단백질 티르, 녹색은 후 감염이 그림 4에 표시됩니다.
1 그림. 상피 장벽 무결성을 평가하는 혈청 FITC - dextran. 마우스 측정였다혈청 FITC - dextran 수준이 결정 된 후, 감염되지 않은 조건 아래 4 kDa FITC - dextran과 및 사후 감염 칠일에 gavaged. C57BL / 6 (WT) 마우스는 감염되지 않은 조건에 비해 칠일 후 감염의 FITC-dextran 혈청 수준에서 무시할 증가를 나타냅니다. 반면, TLR2 - / - 마우스는 상당히 C. 중에이 변형의 기준 제안 심각하게 손상 장벽의 무결성에 비해 혈청에서 FTIC-dextran의 수준을 증가 rodentium 감염은 이전과 같이 표시되어 있습니다.
그림 2. C. rodentium의 루멘,이게 맹장의 부하, 그리고 감염된 C57BL / 칠일 후 감염 6 마우스의 결장. cecal 루멘, 그리고 colonic 조직은 균질 수집 및 LB 한천에 시리얼 희석에 도금되었습니다. 각 Circle 개별 동물에서 수집 한 샘플을 나타냅니다. 수직 오차 막대는 SEM을 표시하면서 튼튼한 줄은 기하 평균을 나타냅니다.
그림 3. C.로 인한 손상의 조직 학적 분석 rodentium 감염. 7 일 후 감염 중간 면역 세포 침투뿐만 아니라 crypts, 고 블렛 셀 고갈과 온난 한 부종의 신장으로는 관찰이 감염되지 않은 조직을 제어 할 수 비교하면. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
4 그림. 감염되지 않은 그리고 하루에 12 포스트 infec에 Immunofluorescence 착색C57BL / 6 마우스의 기의 조직. 말초 colonic 조직은 호스트 단백질 ki67 (적색)와 C.에 물들어있는 것 rodentium 단백질 티르 (녹색).
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Discussion
Citrobacter rodentium 감염은 전염성 질병과 쥐 대장염 모두의 연구 귀중한 모델을 제공합니다. 이 독특한 모델은 두 호스트 응답뿐만 아니라 세균의 병원성 속성의 특성을 허용합니다. 단계는이 프로토콜 세부 사항에이 모델의 성공적인 사용을 설명했다.
대장염을 유도하고 응답을 분석 할 때 염두에 두어야 할이 프로토콜의 여러 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 신선한 밤 C.의 준비 LB의 국물에 rodentium의 inoculum는 마우스를 성공적으로 감염이 필요합니다. 10 8 -10 9 생물체의 복용이 inoculum가 흔드는 또는 오랜 시간 동안 실온에서 벤치 상단에 남아있는 경우, 마우스의 대부분 변종을 감염하는 데 필요한 때, 문화에 남아있는만큼 가능한 생물이되지 않습니다 감염시 대장염을 유발합니다. 그것은 전에 박테리아 inoculum을 선동하는 것도 중요합니다각 마우스가 박테리아의 동등한 복용량을받을 수 있도록, 감염 주사기를로드 할 수 없습니다. 감염의 말단에 따라 조직을 수집 할 때 발생하는 적절한 조직 고정이 필요합니다 포르말린 10 %의 충분한 볼륨에서 colonic 조직의 침수를 완료합니다. 그것은 조직이 아니라 조직 정착액을 권장하는 10시 1분 비율로 microcentrifuge 튜브에 비해 5 ML의 유리 병에 포르말린에 추가하는 것이 좋습니다. 적절한 고정 나중에 조직 학적 분석뿐만 아니라, 이러한 조직의 immunofluorescence 얼룩 필수적입니다. 이것은 다른 한방의 변종은 C.의 유도에 반응을 변화 한 것을 명심하는 것도 중요합니다 rodentium의 대장염. 필요한 경우 처음으로 새로운 변종에 감염되면, 마우스가 밀접하게, 실험 엔드 포인트 인간적를 결정하기 위해 모니터링해야합니다. 상피 장벽 무결성, 세균로드, 그리고 조직학 분석을위한 시간 포인트 마우스의 반응에 따라 정의 할 수 있습니다감염에 관심 변형.
세균 하중을 결정하기 위해 LB 플레이트에 조직 homogenates의 도금은 C.에 대한 PCR을 수행, 완전히 선택적 방법은 아닙니다으로 세균성 식민지에 rodentium 특정 유전자는 C.을 차별화하는 데 수행 할 수 있습니다 판의 다른 bacterialcolonies에서 rodentium. 이 매체는 C.에 대한 더 많은 선택이기 때문에 또 다른 방법은, MacConkey 한천에 판 조직 homogenates하는 것입니다 LB 한천보다 rodentium. 다른 방법은 스트렙토 마이신 내성 야생 형 C.를 사용하는 것입니다 스트렙토 마이신을 방지 스트레인과 rodentium 변형 instead.Substitution이 프로토콜에 설명 된 동일한 대장염 모델의 유도하게됩니다. 이러한 감염의 조직 homogenates은 혼자 LB 한천보다 스트렙토 마이신과 보충 LB 한천에 도금 할 수 있으므로 스트렙토 마이신의 저항력 변형을 사용의 장점은, 박테리아로드보다 쉽게 분석입니다. 이 통신의 잠재적 인 성장을 방지CFU 계산 과정이 쉽고 더 정확하게 만드는 판에 ensal 미생물. 또 다른 대안이 박테리아 부하를 측정, 37 중 하나에 LB 한천에 조직 homogenates의 dilutions을 도금 한 후 번호판을 배양하는 것입니다 동안 ° C 야간이나 계산하기 전에, 느린 세균 성장의 결과로 2-3 일 동안 실온에서.
이 프로토콜은 전염성 대장염의 강력한 모델을 생산하는 데 필요한 단계를 설명뿐만 아니라, C.을 특징하는 데 사용되는 방법 쥐 rodentium 감염. 이외에도 병원체 - 호스트 상호 작용과 면역 반응을 조사하기 위해이 모델을 사용하여에서, 또한 세균 감염이 대장 암의 위험을 증가시킬 수 방법을 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 C.를 노출하여이 작업을 수행 할 수 있습니다 rodentium, 또는 상피 세포 증식에, 또는 유전자에 감염 영향이 상피 세포의 분화 또는 종양 개발 15 참여 방법을 공부하여 발암 물질의 azoxymethane에 쥐를 감염. 우리이 프로토콜에 설명 된 감염성 대장염 모델 들죠, 세균 번호는 또한 창 자간 막 림프절, 비장 및 간 같은 추가 - 장 사이트에서 평가 될 수있다. 이 기관에서 높은 번호는 테스트중인 마우스 스트레인 감염에 매우 민감 것을 나타낼 수 있습니다. 설명 immunofluorescence 얼룩 기법을 사용하여, 감염에 대응 메커니즘의 거의 끝없는 번호를 탐색 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 기술과 일단 잘 알고, 프로토콜은 더 철저히 C.에 대한 응답을 특성화 등 RNA 추출 및 유전자 발현 수준의 평가를위한과 같은 다른 끝점을 측정하기 위해 조직을 수집하기 위해 수정할 수 있습니다 rodentium 감염을.
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Disclosures
제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 Crohn의 및 캐나다의 대장염 재단 (CCFC)과 건강 연구 (CIHR)에 대한 캐나다 연구소에서 BAV에 운영 보조금에 의해 지원되었다. 기가바이트는 CIHR에서 대학원 학생이기로 운영되었습니다. BAV는 장과 간 장애 (아동) 소아 Gastroenterology의 소아 IBD 연구 및 캐나다 연구 의자 재단 위원장과 어린이입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
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