Summary
Citrobacter rodentium infektion ger en värdefull modell för att studera enteriska bakterieinfektioner samt värd immunsvar och kolit hos möss. Detta protokoll beskriver mätning av barriären integritet, patogener belastning och histologisk skada som möjliggör en grundlig karaktärisering av patogen och värd bidrag till murin smittsam kolit.
Abstract
Detta protokoll beskriver de steg som krävs för att producera en robust modell för infektionssjukdomar och kolit samt de metoder som används för att karakterisera Citrobacter rodentium infektion hos möss. C. rodentium är en gramnegativ, mus specifik bakteriell patogen som är nära relaterad till kliniskt viktig mänsklig patogener enteropatogen E. coli och enterohemorragisk E. coli. Vid infektion med C. rodentium, immunkompetenta möss lider blygsam och övergående viktminskning och diarré. Histologiskt är intestinala krypta töjning, immunceller infiltration och bägare cellbristen observeras. Clearance av infektion uppnås efter 3 till 4 veckor. Mätning av intestinal epitelial barriär integritet, bakteriell belastning, och histologisk skada vid olika tidpunkter efter infektion, tillåta karakterisering av musstammar som är mottagliga för infektion.
Virulensen Mekanismens genom vilken bakteriella patogener kolonisera tarmkanalen hos sina värdar, liksom specifika svar värd som försvarar mot sådana infektioner är dåligt förstådd. Därför C. rodentium modell av enterisk bakterieinfektion fungerar som ett värdefullt verktyg för att underlätta förståelsen av dessa processer. Tarmbakterier har också kopplats till inflammatoriska tarmsjukdomar (IBDs). Det har antagits att de maladaptiva kroniska inflammatoriska svar som ses i IBD-patienter utvecklas i genetiskt mottagliga individer efter onormal exponering av det intestinala mukosala immunsystemet tarmbakterier. Därför erbjuder studiet av modeller för smittsamma kolit betydande potential för att definiera potentiellt svar patogena värd för tarmbakterier. C. rodentium inducerad kolit är en sådan sällsynt modell som gör det möjligt att analysera värd svar på tarmbakterier, främja vår förståelse av potentiella mekanismer för IBD patogenes,väsentlig för utvecklingen av nya förebyggande och terapeutiska behandlingar.
Introduction
Infektion av enteriska bakteriella patogener utlöser gastrointestinala (GI) inflammation, liksom intestinal patologi och patofysiologi, inklusive diarré och intestinal epitelial barriär dysfunktion. Virulens mekanismer genom vilka bakteriella patogener koloniserar mag-tarmkanalen av sina värdar, samt särskilda svar värd som försvarar mot sådana infektioner är dåligt förstådda, har dock de senaste framstegen inom modellering av enterala bakterieinfektioner börjat hjälpa vår förståelse av dessa processer. Tarmbakterier har också kopplats till inflammatoriska tarmsjukdomar (IBDs). Den IBDs Crohns sjukdom (CD) och UC är komplexa sjukdomar med okänd etiologi, som kännetecknas av kronisk tarminflammation och vävnadsskada. Många musmodeller av tarminflammation existerar, från spontan inflammation i genetiskt modifierade stammar, såsom IL10 - / - möss, kemiska utmaningar med föreningar, såsom dextran natriumsulfat (DSS) och dinitrobenzene sulfonsyra (DNBS) 1. Det har hypoteser om att de maladaptiva kroniska inflammatoriska reaktioner som finns i IBD-patienter utvecklas genetiskt känsliga individer vid onormal exponering av tarmens slemhinna immunsystemet tarmbakterier 2, alltså studiet av modeller för smittsamma kolit erbjuder också en betydande potential för att definiera potentiellt patogena värd . svar på tarmbakterier Citrobacter rodentium inducerad kolit är en av de sällsynta modeller av smittsam kolit som har väl karakteriserade 1,3, vilket möjliggör analys av värd svar på tarmbakterier och ytterligare förståelse av potentiella mekanismer för IBD patogenes, ett viktigt steg att utveckla nya förebyggande och terapeutiska behandlingar.
C. rodentium är en gramnegativ fästa och utplåna (A / E), mus specifik bakteriell patogen som är nära relaterad till den viktiga mänskligapatogener enteropatogen E. coli (EPEC) och Enterohemorragisk E. coli (EHEC) 3-8. Familjen av A / E patogener fäster intimt till den apikala värdcellmembranet av cekala och kolon epitel, bildar en icke-invasiv piedestal-liknande struktur på värdcellen. Oral utmaning med C. rodentium av 10 8 -10 9 organismer producerar en robust modell av smittsam kolit kännetecknas av kolon hyperplasi eller förlängning av kryptor, mononukleär immunceller infiltration och bägare cellbristen 3,4. Den initiala platsen för kolonisering, några timmar efter utmaningen, är vid den cekala plåstret, följt av progression till den distala kolon 2 till 3 dagar efter infektion 3. Hos immunkompetenta musstammar är clearance av patogenen uppnått 3 till 4 veckor efter infektion 1,3,4. Emellertid, många genetiskt modifierade stammar, dvs genen bristfällig eller knockout (- / -) möss har, befunnits visa increased mottaglighet för infektion resulterar i överdriven skada och / eller kronisk infektion och inflammation 9-14. Användning av denna smittsamma kolit modell i dessa knockout stammar, många saknar medfödda signalerande proteiner, har varit oumbärlig för att avslöja flera värdproteiner integrerad lösning av intestinal infektion och inflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Citrobacter rodentium ymp och oral sondmatning av möss
- Förbered och autoklav Luria Bertani buljong (LB).
- Skaffa livskraftig C. rodentium från en frusen glycerol lager och strimma på LB-agarplatta med en steril ympa slinga eller pipettspets. Inkubera vid 37 ° C över natten. Inokulera 3 ml steril LB-buljong i en falk odlingsrör med kolonier från LB-platta med användning av en ympning slinga eller pipettspets. Beredning av inokulat bör göras med användning av aseptisk teknik.
- Inkubera C. rodentium kultur aerobt vid 37 ° C över natten i en bänk inkubation skakanordning vid 200 varv per minut. Den ympade LB-buljong bör visas grumlig efter odling över natten.
- Använd en glödlampa tippas magsond nål fäst till en 1 ml spruta för sondmatning varje mus med 100 pl av den över natten C rodentium kultur. Försiktigt nackskinnet musen, genom att ta ett ordentligt tag den lösa huden över dess nacke och ryggmed tummen och fingrarna. Dra tillbaka djurets huvud med pekfingret för att immobilisera huvudet och räta matstrupen för insättning av sondmatning nålen.
- Bibehålla musen i upprätt läge och rikta lampan spets sondmatning nålen längs sidan av munnen och över tungan. Försiktigt föra nålen längs taket i munnen och föra ner i matstrupen. Om det finns något motstånd kände under denna procedur, ta bort sondmatning nålen och sätt det.
- Injicera långsamt 100 pl av bakteriella inokulatet och ta försiktigt bort sondmatning nålen. Övervaka andning och beteende musen efter att ha återvänt till sin bur.
Anmärkningar:
- I steg 2 och 3, även utarbeta en falk kultur rör med aseptisk teknik med 3 ml steril LB-buljong som odlas över natten för att se till att det inte finns någon bakteriell kontaminering av buljongen i sig. LB buljong skall vara klar efter odling över natten.
- Övernattkultur ska kasseras om den har inokulerats i över 24 timmar.
- Alla C. rodentium infektioner och bostäder från smittade djur bör utföras i en biosäkerhetsnivå 2 anläggning.
2. Mätning Kolon epitelbarriär Permeabilitet i C. rodentium-infekterade möss
- Mät barriär integritet vid önskad tidpunkt efter infektion.
- På dagen för analysen, förbereder tillräckligt 4 kDa fluoresceinisotiocyanat (FITC)-dextran upplöst i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en koncentration av 80 mg ml -1 att sondmatning varje mus med 150 pl och förbereda standardkurvan.
- Nackskinnet musen och sondmatning med 150 pl av FITC-dextran. Dra tillbaka livsmedel från buren vid denna tidpunkt.
- Söva möss 4 timmar eftergavaging och samla in så mycket blod som möjligt (~ 450 ul) genom hjärtpunktion. Tillsätt blodet till en slutkoncentration av 3% syra-citratdextros i ett mikrocentrifugrör att avskräcka koagulering. Euthanize mössen och samla colonic vävnader i PBS för bakteriella räkningar (steg från 3,1 till 3,5) och i 10% formalin för vävnadsfixering och slutligen immunofluorescensfärgning (steg från 4,1 till 4,8).
- Snurra blodproven vid 1.000 xg i 12 min i en centrifug vid 4 ° C. Samla serum och späd till 1/10 och 1/100 i PBS. Tillsätt 100 | il av varje prov på dessa två spädningar till en 96 brunnars platta i replikat.
- För att framställa standardkurvan, späd den ursprungliga 80 mg ml -1 FITC-dextran användes för att sondmatning mössen i PBS till följande koncentrationer: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, och 0 ng / ml . Tillsätt 100 | il av varje koncentration till en 96 brunnars platta i tre exemplar.
- Kvantifiera fluorescensen hos varje prov med användning av en fluorometer vid en excitering wavelength av 485 nm och 535 nm emissionsvåglängd.
- Analysera de rådata genom att plotta standardkurvan. Mata in rådata för varje prov i ekvationen för den linje som alstras av standardkurvan för att bestämma koncentrationen av FITC-dextran i varje prov.
Anmärkningar:
- Från steg 4 och framåt, hålla blodprov på is och minimera exponeringen för ljus.
- Vid mätning epitelbarriär integritet en tidpunkt vid, eller före, är 7 dagar efter infektion optimal, eftersom allvarlig vävnadsskada uppstår efter detta. Mätning barriär integritet före svåra skador inträffar kan du bestämma maximala skillnader i permeabilitet under C. rodentium infektion mellan musstammar.
- Se till att oinfekterade kontrollmöss även testas för epitelbarriär integritet.
3. Mätning av bakteriell belastning i vävnader av C. rodentium-infekterade möss
- Tillsätt 1 ml sterilt PBS And en autoklaverad metall pärla till en rund botten 2 tub ml centrifug med aseptisk teknik. Enskild vävnad som samlats in från varje djur kommer att placeras i separata PBS rör. Väg rören före tillsats av vävnaden.
- Avlägsna blindtarmen och tjocktarmen från musen. Separera blindtarmen från kolon och tryck ut de luminala innehållet med pincett. Tillsätt innehållet i en PBS-rör. Efter separering 0,5 cm sektioner från den distala kolon och blindtarmen för 10% formalin fixering, skära upp den kvarvarande kolon och blindtarmen longitudinellt och tvätta med steril PBS innan du placerar vävnader i rör.
- Väg PBS rören med vävnaden och sedan homogenisera proverna med användning av en Bead Beater under 6 min vid 30 Hz.
- Användning av aseptiska tekniker, tillsätt 180 pl steril PBS per brunn till en 96 brunnars platta. Tillsätt 20 | il av varje homogeniserade provet till den första brunnen i varje rad. Blanda väl och seriellt utspädda, lägga 20 ul från varje tidigare väl få utspädningar från 10 -1 (första vill) till 10 -6. Platta 10 fil av varje spädning från varje prov i tre exemplar på ett torg botten LB-platta med ett rutnät. Inkubera över natten vid 37 ° C.
- Räkna kolonibildande enheter (CFU), sedan det genomsnittliga 3 räknas, och registrera utspädning vid vilken varje prov räknades. Multiplicera genomsnittlig CFU med 50, som 20 il av den ursprungliga 1 ml prov användes och med spädningsfaktorn vid vilken provet räknades resulterar i CFU / ml. Slutligen, dividera med vävnaden vikt att fastställa CFU / g.
4. Histologisk bedömning och immunofluorescensfärgning av Infekterade Colon vävnader
- Samla vävnader som i steg 3,2. Förvara vävnader i formalin över natt, sedan tvätta med 70% etanol. Embed vävnader i paraffin och skars 5 pm sektioner för färgning. Stain med hematoxylin och eosin för histologisk bedömning och vidare till följande steg för immunofluorescensfärgning.
- Att deparaffinize vävnader före färgning, glider rumen Coplin färgning burk och sätta i 65 ° C vattenbad i 10 minuter. Därefter Placera objektglasen i xylen för fyra tvättar av 2 min vardera. Objektglasen bör därefter rehydreras med två 5-minuters tvättar i 100% etanol, följt av en 5 min tvättning i vardera av följande: 95% etanol, 75% etanol och dH 2 0. Dessa tvättar bör ske i ett dragskåp för att undvika exponering för skadliga ångor.
- Placera objektglasen i Coplin-kärlet med förvärmd natriumcitratbuffert och sedan plats i en ångbåt under 30 min, sedan låta sitta i 30 minuter. Denna process bryter protein tvärbindningar bildas av formalin fixering hämta potentiella antigena ställen.
- Tvätta med PBS azid under 5 minuter, tre gånger. Torra diabilder och markera området runt vävnad med en PAP penna för att skapa en hydrofob barriär, hålla färgreagenser lokaliserade på vävnaden.
- Block vävnad under 1 timme vid rumstemperatur med blockeringsbuffert (t.ex. α-getserum) i ett immunfärgning fuktkammare.
- Späd primary antikropp till önskad koncentration med buffert antikroppsspädning. Häll av blockerande buffert och tillsätt 50-100 pl av primär antikropp till vävnader. Inkubera vid 4 ° C över natten eller vid rumstemperatur under 2 timmar.
- Tvätta med PBS azid under 5 minuter, tre gånger. Lägg 50-100 il sekundär antikropp utspädd i antikroppsspädning buffert till vävnaderna och inkubera vid rumstemperatur under 1 timme i mörker. Tvätta med dH 2 O under 5 minuter, tre gånger.
- Torkar bilder, lägga DAPI Förläng guld monteringsmedium och lägg på ett täckglas. Visa bilder under ett fluorescensmikroskop.
Anmärkningar:
- PBS-azid kan vara substituerad med nyberedd PBS som ett alternativ för att undvika bakterietillväxt i tvättmediet från steg 4 och framåt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under en vanlig infektion experiment möss infekterade med ungefär 2,5 x 10 8 CFU genom sondmatning av 100 ^ natten C. rodentium kultur. Infektion av C57BL / 6 möss med C. rodentium leder blygsam och övergående viktminskning och diarré. Även om en sällsynt företeelse med C57BL / 6 möss, kan djur blir sjuka och behöver euthanization. Därför bör möss övervakas med avseende graden av viktminskning och symtom på ångest som piloerect päls och krökt kroppshållning, för att fastställa i vilken utsträckning olika stammar påverkas av infektionen.
Resultat presenteras i figurerna 1 till 4 är representativa för en gjort infektion med en över natten kultur framställd från en frusen glycerolförråd. Vid 7 dagar efter infektion, var mössen anestetiserades och blod uppsamlades genom hjärtpunktur. Figur 1 visar FITC-dextran mätt i serumetav C57BL / 6 möss samt från toll like receptor 2 (TLR2) knockoutmöss, som tidigare har visat sig uppvisa försämrad epitelial barriär integritet under infektionen 9. I närvaro av en intakt intestinal epitelial barriär, är 4 kDa FITC-dextran dåligt permeabla genom detta skikt. Därför ökade nivåer av FITC-dextran i serum tyder på en försämring av intestinal epitelial barriär integritet under infektionen gör denna molekyl att läcka över. Som en kontroll, är serumnivåerna i oinfekterade möss sondmatades med FITC-dextran också presenteras.
Med en vecka efter infektion, har bakteriella belastningar i tjocktarmen befunnits topp kring 10 9 CFU / g 3,4. Bakteriella laster kan mätas vid önskad tid pekar efter infektion för att bekräfta infektion, samt att bedöma om olika knockoutmöss lider av ökade eller minskade bakteriella bördan. Som C. rodentium är en luminal patogen som kan intimt adhere för intestinala epitelceller, bakteriella belastningar i luminala innehåll, cekala och kolon vävnader kan mätas. Figur 2 visar typiska bakteriella belastningar mäts på dag 7 efter infektion cekala och kolon vävnad samt inom den intestinala lumen C57BL / 6 möss.
Mesta av patologin som observerades under C. rodentium infektion i C57BL / 6 möss inträffar i de distala 2 cm av colon11. Makroskopiskt vid dag 7 efter infektion, är en förtjockning av kolonslemhinnan liksom en förkortning i längd av tjocktarmen observeras med liten öppen skada ses i C57BL / 6 möss. Normalt under infektion, C57BL / 6 möss lider endast måttlig inflammation och patologi som kännetecknas histologiskt av immunceller infiltration, förlängning av kolon kryptor och bägare cellbristen (Figur 3).
Såsom framgår av H & E-sektioner i figur 3, är flera värd svar monterade underning infektion med C. rodentium. För att ytterligare karaktärisera dessa förändringar, kan immunofluorescensfärgning användas för att undersöka förändringar i proteiner av intresse, såsom markörer för proliferation, celldöd, eller medfödda och adaptiva immunsvar. Immunofluorescensfärgning är också värdefullt att undersöka aspekter av bakteriella responsen, såsom dess lokalisering inom den infekterade vävnaden. Ett exempel på denna färgningsteknik, undersöker en Ki67 värdprotein (röd), en markör för cellproliferation och C. rodentium proteinet tir, grön, att undersöka bakteriell lokalisering vid dag 12 efter infektion visas i Figur 4.
Figur 1. Mätning av serum FITC-dextran för att bedöma epitelial barriär integritet. Mösssondmatades med 4 kDa FITC-dextran enligt oinfekterade förhållanden och vid 7 dagar efter infektion, varefter serum FITC-dextran nivåer bestämdes. C57BL / 6 (WT) möss uppvisar en försumbar ökning i FITC-dextran serumhalterna vid 7 dagar efter infektion jämfört med oinfekterade förhållanden. Däremot TLR2 - / - har möss ökat markant nivåerna av FTIC-dextran i serum jämfört med utgångsvärdet tyder gravt nedsatt barriär integritet i denna stam under C. rodentium infektion, har som tidigare visats.
Figur 2. C. rodentium belastning i lumen, blindtarmen och kolon av infekterade C57BL / 6 möss vid 7 dagar efter infektion. Lumen, cekala och kolon vävnader uppsamlades, homogeniserades, och ströks ut i serie-utspädning på LB-agar. Varje cIrcle representerar ett enda prov samlas in från enskilda djur. Heldragna linjer indikerar det geometriska medelvärdet medan vertikala felstaplar visar SEM.
Figur 3. Histologisk analys av skador orsakade av C. rodentium infektion. Vid dag 7 efter infektion måttlig immun cellinfiltration, liksom förlängning av kryptor, bägare cellbristen och mild ödem observeras jämfört med kontrollgruppen infekterade vävnaden. Klicka här för att se större bild .
Figur 4. Immunofluorescensfärgning den oinfekterade och dag 12 efter infektionning vävnader av C57BL / 6 möss. Distal kolonvävnad färgas för värden proteinet Ki67 (röd) och C. rodentium protein tir (grön).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Citrobacter rodentium infektion ger en värdefull modell för studier av både infektionssjukdomar och kolit i möss. Denna unika modell gör det möjligt att karakterisera både värd svar, liksom egenskaper patogena bakterier. Stegen som beskrivs i detta protokoll detalj framgångsrik användning av denna modell.
Det finns flera viktiga steg i detta protokoll för att tänka på när framkalla kolit och analysera svaren. Först, framställning av en färsk över natten C. rodentium inokulum i LB-buljong krävs för framgångsrik infektion av möss. Som en dos av 10 8 -10 9 organismer krävs för att infektera de flesta stammar av möss, om inokulatet är kvar i skakapparat eller på bänken vid rumstemperatur under längre perioder, kommer det inte att vara tillräckligt livsdugliga organismer kvar i kulturen att inducera kolit vid infektion. Det är också viktigt att agitera den bakteriella inokulatet föreladda sprutan för infektion, för att säkerställa att varje mus får en lika dos av bakterier. Vid insamling vävnader vid terminalen av infektionen, komplett nedsänkning av kolon vävnad i en riklig volym av 10% formalin för korrekt vävnadsfixering att inträffa. Det föreslås att vävnader sättas till formalin i en 5 ml flaska, snarare än i mikrocentrifugrör som ett 10:1 förhållande av fixativ till vävnad rekommenderas. Korrekt fixering är nödvändig för senare histologisk analys, liksom immunofluorescensfärgning av dessa vävnader. Det är också viktigt att komma ihåg att olika knockout stammar kommer att ha olika svar vid induktion av C. rodentium kolit. När infekterar en ny stam för första gången, bör möss noggrant övervakas för att bestämma en human ändpunkt för experimentet, om det behövs. Tidpunkter för analys av epitelial barriär integritet, bakteriella belastningar och histologi kan definieras baserat på svaret av musenstam av intresse för infektionen.
Som plätering av vävnadshomogenat på LB-plattor för att bestämma bakteriella belastningar inte är en helt selektiv metod, utförande av PCR för ett C. rodentium specifik gen på bakteriekolonier kan göras för att skilja C. rodentium från andra bacterialcolonies på plattan. Ett annat alternativ är att homogenat plåt vävnad på MacConkey-agar, eftersom detta medium är mer selektiv för C. rodentium än LB-agar. Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda en streptomycinresistenta vild-typ C. rodentium stam instead.Substitution med streptomycin resistent stam kommer att resultera i induktion av samma kolit som beskrivs i detta protokoll. Fördelen med att använda stammen streptomycinresistenta är för enklare analys av bakteriella belastningar, som vävnadshomogenat från dessa infektioner kan pläteras på LB-agar kompletterad med streptomycin snarare än LB-agar enbart. Detta undviker potentiell tillväxt på commensal mikrober på plattan, vilket gör CFU räknar enklare och mer exakt. Ett annat alternativ samtidigt mäta bakteriella belastningar, är att inkubera plattorna efter utstrykning utspädningar av vävnadshomogenat på LB-agar vid antingen 37 ° C över natten eller vid rumstemperatur under 2-3 dagar, vilket resulterar i långsammare bakterietillväxt, före räkning.
Detta protokoll beskriver de steg som krävs för att producera en robust modell för infektiös kolit, liksom de metoder som används för att karakterisera C. rodentium infektion hos möss. Bortsett från att använda denna modell för att undersöka patogen och värd interaktioner och immunsvar, kan den också användas för att studera hur en bakteriell infektion kan öka risken för tjocktarmscancer. Detta kan göras genom exponering C. rodentium infekterade möss till cancerframkallande azoxymethane eller genom att studera hur infektion påverkan på epitelcellproliferation eller på gener involverade i epitelial celldifferentiering eller tumörutveckling 15. Ossning av smittsamma kolit modellen som beskrivs i detta protokoll, kan bakteriella nummer också bedömas på extra-intestinala ställen, såsom mesenteriala lymfkörtlar, mjälte och lever. Högre siffror i dessa organ kan indikera att musstammen testas är mycket mottagliga för infektionen. Använda immunofluorescensfärgning beskrivna tekniken, kan ett nästan oändligt antal mekanismer som svar på infektion undersökas. När förtrogen med teknikerna som beskrivs här, kan protokollet modifieras för att samla vävnad för att mäta andra slutpunkter, såsom för RNA-extraktion och bedömning av nivåer genuttryck, till mer noggrant karakterisera svar till C. rodentium infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av driftsbidrag till BAV från Crohns och kolit Foundation of Canada (CCFC) och den kanadensiska Institutes for Health Research (CIHR). S har finansierats av en examen utbildningsbidrag från CIHR. BAV är barnen med tarm och leversjukdomar (barn) Stiftelsen ordförande i pediatrisk IBD forskning och Kanada forskning ordförande i pediatrisk gastroenterologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
