Summary
Citrobacter rodentium инфекции предоставляет ценную модель для изучения кишечных бактериальных инфекций, а также иммунный ответ и колита у мышей. Этот протокол описывает измерение барьер целостности, патогенов и гистологическое повреждение позволяет тщательно характеристика возбудителя и принимающих вклады в мышиной инфекционных колитах.
Abstract
Этот протокол описывает шаги, необходимые для создания надежной модели инфекционного заболевания и колитах, а также методы, используемые для характеристики Citrobacter rodentium инфекции у мышей. C. rodentium представляет собой грамотрицательные, мышиный конкретных бактериальных патогенов, которые тесно связаны с клинически значимых патогенов человека энтеропатогенных E. палочки и Энтерогеморрагическая E. палочки. После инфицирования C. rodentium, иммунокомпетентных мышей страдают от скромных и переходные потери веса и диареи. Гистологически, кишечных удлинение склеп, иммунной клеточной инфильтрации и истощения бокаловидных клеток не наблюдается. Оформление инфекции достигается после 3 до 4 недель. Измерение кишечного эпителия целостности барьера, бактериальной нагрузки, и гистологическое повреждение в различные моменты времени после заражения, позволяющие характеристика штаммов мыши восприимчивы к инфекции.
Механизм вирулентностис помощью которых патогенные бактерии колонизировать желудочно-кишечного тракта их хозяев, а также конкретные ответы хоста, защититься от таких инфекций мало изучены. Поэтому C. rodentium модели кишечной бактериальной инфекции служит ценным инструментом, чтобы помочь в нашем понимании этих процессов. Кишечные бактерии также были связаны с Воспалительные заболевания кишечника (IBDs). Она была выдвинута гипотеза о том, что неадекватные хронические воспалительные реакции наблюдаются у пациентов IBD развиваются у генетически предрасположенных лиц после ненормального воздействия на слизистой кишечника иммунной системы кишечных бактерий. Таким образом, изучение моделей инфекционного колита имеет значительный потенциал для определения потенциально патогенных ответы принимающей кишечных бактерий. C. rodentium индуцированный колит является одним из таких редких моделей, что позволяет проводить анализ принимающих ответы на кишечные бактерии, углубления нашего понимания возможных механизмов патогенеза IBD;важную роль в разработке новых профилактических и лечебных процедур.
Introduction
Заражение кишечными бактериальными патогенами вызывает желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) воспаления, а также кишечной патологии и патофизиологии, в том числе диарея и кишечные эпителиальные дисфункции барьера. Вирулентности механизмы, с помощью которых патогенные бактерии колонизировать желудочно-кишечного тракта их хозяев, а также конкретные ответы хоста, защититься от таких инфекций, плохо понимается, однако последние достижения в области моделирования кишечных бактериальных инфекций начали помогать нашему пониманию этих процессов. Кишечные бактерии также были связаны с Воспалительные заболевания кишечника (IBDs). Болезнь IBDs Крона (БК) и UC являются сложными заболеваниями неизвестной этиологии, характеризующееся хроническим кишечным воспалением и повреждением тканей. Многие модели мыши кишечного воспаления существуют, от спонтанного воспаления у генетически модифицированные штаммы, такие как IL10 - / - мышей, химических проблем с соединениями, такими как декстран сульфат натрия (DSS) и гinitrobenzene кислоты (DNBS) 1. Она была выдвинута гипотеза о том, что неадекватные хронических воспалительных реакций присутствует у пациентов IBD развиваются у генетически предрасположенных лиц по ненормального воздействия на слизистой кишечника иммунной системы кишечных бактерий 2, поэтому исследование модели инфекционного колита также имеет значительный потенциал для определения потенциально патогенных хоста . ответы на кишечные бактерии Citrobacter rodentium индуцированный колит является одним из самых редких моделей инфекционных колитах, которые были охарактеризованы 1,3, что позволяет при анализе ответов на множество кишечных бактерий и дальнейшего понимания возможных механизмов патогенеза IBD; важным шагом В разработке новых профилактических и лечебных процедур.
C. rodentium является грамотрицательные крепления и скромный (A / E), мышиный конкретных бактериальных патогенов, которые тесно связаны с важными человекапатогенных энтеропатогенных E. палочка (EPEC) и энтерогеморрагическая E. палочка (EHEC) 3-8. Семейство / E патогенных тесно приложить к апикальной мембране клетки-хозяина из слепой кишки и ободочной эпителия, образуя неинвазивной пьедестал подобные структуры на клетке-хозяине. Устные проблема с C. rodentium из 10 8 -10 9 организмов создает надежную модель инфекционного колита характеризуется толстой гиперплазии или удлинение склепы, мононуклеарными иммунной клеточной инфильтрации и бокаловидных клеток истощения 3,4. Начальный участок колонизации, за несколько часов после заражения, находится в слепой патч, затем прогрессии дистального отдела толстой кишки от 2 до 3 дней после заражения 3. В иммунокомпетентных линий мышей, оформление возбудителя осуществляется от 3 до 4 недель после заражения 1,3,4. Тем не менее, многие генетически модифицированные штаммы, т.е. ген недостаточной или нокаут (- / -) мышей, были найдены просмотров increaСЭД восприимчивость к инфекции в результате преувеличенного ущерба и / или хронической инфекцией и воспалением 9-14. Использование этой модели инфекционного колита в этих нокаутом штаммов, многие не хватает врожденной сигнальных белков, был незаменимым в выявлении нескольких белков, принимающих неотъемлемой разрешения кишечной инфекции и воспаления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Citrobacter rodentium посевной и желудочный зонд мышей
- Подготовка и стерилизации Лурия Bertani бульон (LB).
- Получение жизнеспособного C. rodentium из замороженного запаса глицерина и подряд на LB агаром с помощью стерильного посева петлю или пипетки. Инкубировать при 37 ° С в течение ночи. Инокулировать 3 мл стерильного бульона LB в трубке сокол культуре колоний от LB пластины с использованием прививки петли или пипетки. Подготовка к посевной должно быть сделано с использованием асептических методов.
- Инкубируйте C. rodentium культуру аэробных условиях при 37 ° C в течение ночи в инкубационный настольных шейкер при 200 оборотах в минуту. Инокулированных LB бульоне должна появиться облачно после ночной культуры.
- Используйте лампочки наконечником желудка через зонд иглой в 1 мл шприц с зондовым каждой мыши с 100 мкл в течение ночи C. rodentium культуры. Аккуратно шкирку мыши,, крепко держа дряблая кожа на шее и спинес большим пальцем и пальцами. Потяните голову животного с указательным пальцем, чтобы обездвижить голову и выпрямите пищевода для введения через желудочный зонд иглы.
- Поддерживать мыши в вертикальном положении и направлять лампу кончике иглы через желудочный зонд вдоль стороны его рта и над его языком. Аккуратно пройти иглой по небу и продвигать его вниз по пищеводу. Если есть сопротивление чувствовал во время этой процедуры, удалить зонд иглу и вставьте ее снова.
- Медленно вводят 100 мкл бактериальной посевной и осторожно извлеките иглу через желудочный зонд. Монитор скорости дыхания и поведение мышей после возвращения его в клетку.
Примечания:
- В шаги 2 и 3, а также подготовить трубки сокола культуры с использованием асептических методов с 3 мл стерильного бульона LB быть культивировали в течение ночи, чтобы убедиться, что нет бактериального загрязнения бульона себя. LB бульоне должна появиться ясно после ночной культуры.
- Ночь культуры должны быть отброшены, если она была сделана прививка в течение 24 часов.
- Все C. rodentium инфекции и жилищных зараженных животных должно осуществляться в Уровень безопасности 2 объекта.
2. Измерение Кишечное эпителиальной проницаемости барьера в C. rodentium-инфицированных мышей
- Измерение целостности барьера в нужный момент времени после заражения.
- В день анализа, подготовки достаточно 4 кДа изотиоцианат флуоресцеина (FITC)-декстран растворяют в фосфатном буферном растворе (PBS) до концентрации 80 мг мл -1 до зондовым каждой мыши с 150 мкл и подготовить по стандартной кривой.
- Scruff мыши и через зонд 150 мкл FITC-декстрана. Вывод пищу из клетки в это время.
- Anesthetize мышей 4 часа послеgavaging и собирать столько крови, сколько возможно (~ 450 мкл) путем пункции сердца. Добавить крови до конечной концентрации 3% кислотно-цитрат декстрозы в микроцентрифуге трубки для предотвращения свертывания крови. Усыпить мышей и собирать толстой ткани в PBS для бактерий (шаг 3,1 - 3,5) и в 10% формалине для фиксации тканей и в конечном итоге иммунофлуоресцентного окрашивания (шаг 4,1 - 4,8).
- Побочные образцы крови в 1000 х г в течение 12 мин в центрифуге при 4 ° C. Сбор сыворотки и разбавить до 1/10 и 1/100 в PBS. Добавить 100 мкл каждого образца в этих двух разведений в 96-луночный планшет в репликации.
- Для получения стандартной кривой, разбавить оригинальные 80 мг мл -1 FITC-декстрана используются для зондовым мышей в PBS в следующих концентрациях: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 0 мкг / мл . Добавить 100 мкл каждой концентрации в 96-луночный планшет в трех экземплярах.
- Количественная флуоресценции каждого образца с помощью флуорометре в возбуждении WAVelength из 485 нм и 535 нм длина волны излучения.
- Анализ исходных данных путем построения стандартной кривой. Введите исходные данные для каждого образца в уравнение прямой, порожденной стандартной кривой для определения концентрации FITC-декстрана в каждом образце.
Примечания:
- Из пункта 4 вперед, держать образцы крови на льду и свести к минимуму воздействие света.
- При измерении целостности эпителиального барьера момент времени, в, или до 7 дней после заражения является оптимальным, так как серьезные повреждения ткани происходит после этого. Измерение целостности барьера до тяжелой встречающиеся повреждения позволяет определить максимальные различия в проницаемости во C. rodentium инфекции между мышью штаммов.
- Убедитесь, что неинфицированных мышей управления, также проверяются на целостность эпителия барьер.
3. Измерение бактериальной нагрузки в тканях C. rodentium-инфицированных мышей
- Добавить 1 мл стерильной PBSм автоклавного металлическая бусина с круглым дном 2 мл центрифужные пробирки использованием асептических условиях. Индивидуальные тканей собраны от каждого животного будет размещена в отдельном труб PBS. Масса трубы перед добавлением ткани.
- Удалить слепой кишки и толстой кишки с помощью мыши. Отделить слепой кишки из толстой кишки и вытолкнуть содержимое просвета с помощью пинцета. Добавить содержимое в трубе PBS. После разделения 0,5 разделам см от дистального отдела толстой кишки и слепой кишки на 10% формалина фиксации, разрезать оставшиеся толстой кишки и слепой кишки продольно и промыть стерильной PBS перед размещением ткани в пробирках.
- Взвесьте PBS труб с тканью, а затем гомогенизации образцов с использованием шарика колотушкой в течение 6 мин при 30 Гц.
- Использование асептики, добавьте 180 мкл стерильной PBS на лунку в 96-луночный планшет. Добавить 20 мкл каждого усредненного образца в первой скважины в каждом ряду. Хорошо перемешайте и серийно разбавленных, добавляя 20 мкл из каждой предыдущей а для получения разведения от 10 -1 (сначала мыLL) до 10 -6. Пластинку по 10 мкл каждого разведения из каждого образца в трех экземплярах на площади пластины LB дно с сеткой. Выдержите в течение ночи при 37 ° C.
- Граф колониеобразующих единиц (КОЕ), то средний 3 единицы, и записать разведение, при котором каждый образец учитываются. Умножьте среднюю КОЕ на 50, а 20 мкл оригинал 1 мл образца был использован, и на коэффициент разбавления, при которой образец считался в результате КОЕ / мл. И, наконец, разделить на вес ткани для определения КОЕ / г.
4. Гистологическая оценка и иммунофлюоресцентного окрашивания инфицированных тканей толстой кишки
- Сбор ткани, как в пункте 3.2. Магазин тканей в формалине в течение ночи, затем вымыть с 70% этанола. Добавить в парафин тканей и сократить 5 мкм разделы для окрашивания. Пятно гематоксилином и эозином для гистологической оценки и перейти к следующие шаги для иммунофлуоресцентного окрашивания.
- Для deparaffinize тканей до окрашивания, место скользит вбанку Коплин окрашивания и положить в 65 ° С водяной бане в течение 10 мин. Далее, место слайдов в ксилоле в течение четырех промывки 2 мин каждый. Слайды должны быть регидратации с двумя 5-ти минутах моет в 100% этанола, а затем один 5 минут мыть в каждом из следующих действий: 95% этанола, 75% этанола и дН 2 0. Эти моет должно быть сделано в вытяжном шкафу, чтобы избежать воздействия вредных паров.
- Место слайдов в банке Коплин с предварительно нагретым цитрат натрия буфера, а затем поместите в пароход в течение 30 минут, затем дайте постоять 30 мин. Этот процесс разрушает белки поперечные связи образуются формалином фиксации получения потенциальных антигенных сайтах.
- Промыть PBS азид в течение 5 минут, три раза. Сухие горки и знак область вокруг ткани с PAP пера создают гидрофобный барьер, сохраняя окрашивания реагентов локализован на ткани.
- Блок ткани в течение 1 часа при комнатной температуре с блокирующим буфером (например, α-козьей сыворотки) в иммунной влажности камеры.
- Развести чопорнойарных антител к желаемой концентрации антител использованием буфера разбавления. Вылейте блокирующий буфер и добавить 50-100 мкл первичных антител к тканям. Инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи или при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Промыть PBS азид в течение 5 минут, три раза. Добавить 50-100 мкл вторичного антитела, разведенного в буфере разбавления антител к тканям и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте. Промыть дН 2 O в течение 5 минут, три раза.
- Высушить слайдов, добавить DAPI продлить Золотой монтажа средних и применять покровное. Просмотр слайдов под флуоресцентным микроскопом.
Примечания:
- PBS азид может быть заменен свежеприготовленный PBS в качестве альтернативы, чтобы избежать роста бактерий при стирке среды от шага 4 и далее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Во время стандартного эксперимента инфекции, мышей, инфицированных примерно 2,5 х 10 8 КОЕ через желудочный зонд 100 мкл в течение ночи C. rodentium культуры. Заражение мышей C57BL / 6 с C. rodentium результаты скромны и переходные потери веса и диареи. Хотя редкое явление с C57BL / 6 мышей, животные могут заболеть и требуют euthanization. Таким образом, мыши должны быть проверены на степень потери веса и симптомы бедствия, такие как piloerect меха и сгорбленная осанка, чтобы определить, в какой степени различные штаммы страдают от инфекции.
Результаты представлены на рисунках 1 по 4 представителя инфекции осуществляется с помощью ночной культуры получают из замороженного запаса глицерина. Через 7 дней после инфицирования мышей анестезировали и кровь была собрана с помощью пункции сердца. Рисунке 1 показана FITC-декстрана измеряли в сыворотке кровиC57BL / 6 мышей, а также от Toll подобный рецептор 2 (TLR2) нокаутных мышей, которые ранее были найдены проявлять нарушения целостности эпителиального барьера при инфекции 9. В присутствии нетронутыми кишечного эпителиального барьера, 4 кДа FITC-декстрана плохо проницаемой через этот слой. Таким образом, повышение уровня FITC-декстрана в сыворотке предложить нарушение целостности эпителия кишечника барьера при инфекции позволяет этой молекуле течь поперек. В качестве контроля сыворотке крови у неинфицированных мышей gavaged с FITC-декстрана также представлены.
По одной недели после заражения, бактериальных нагрузки в толстой кишке было обнаружено пика около 10 9 КОЕ / г 3,4. Бактериальная нагрузка может быть измерена в нужное время точках после заражения, чтобы подтвердить инфекцию, а также для оценки, если различные мышей страдают от увеличена или уменьшена бактериальной нагрузки. Как C. rodentium является просвета возбудителя, который может тесно АДГпрежде чем в эпителиальные клетки кишечника, бактериальной нагрузки в просвете содержание, слепой кишки и толстой ткани может быть измерена. рисунке 2 показаны типичные бактериальной нагрузки оценивается по 7-й день после заражения слепой кишки и толстой ткани, а также в просвете кишечника C57BL / 6 мышах.
Большинство патология наблюдается при C. rodentium инфекции в C57BL / 6 мышей происходит в дистальных 2 см colon11. Макроскопически на 7-й день после заражения, утолщение слизистой оболочки толстой кишки, а также сокращение длины толстой кишки наблюдается, с небольшой открытой повреждения видели в C57BL / 6 мышей. Обычно во время инфекции, C57BL / 6, страдают только умеренное воспаление и патология характеризуется гистологически иммунной клеточной инфильтрацией, удлинение толстой склепы и кубок лимфоцитов (рис. 3).
Как видно из H & E разделов на рисунке 3, несколько ответов хоста установлены мажорING инфекции C. rodentium. Для дальнейшего характеризуют эти изменения, иммунофлуоресцентного окрашивания может быть использован для изучения изменений в белках интерес, таких как маркеры пролиферации, клеточной смерти, или врожденного и адаптивного иммунного ответа. Иммунофлуоресцентного окрашивания также ценным в исследовании аспекты бактериальных ответа, такие как его локализации в инфицированной ткани. Примером этой техники окрашивания, рассматривая множество белков Ki67 (красный), маркер клеточной пролиферации и C. rodentium белка МДП, зеленый, для изучения бактериальных локализации на 12-й день после заражения представлена на рисунке 4.
Рисунок 1. Измерение сыворотки FITC-декстрана для оценки целостности эпителиальных барьер. Мышейgavaged с 4 кДа FITC-декстрана при неинфицированных условиях и в течение 7 дней после заражения, после чего сыворотку FITC-декстрана уровни были определены. C57BL / 6 (WT) мышей демонстрируют незначительное увеличение FITC-декстрана уровни сыворотки в течение 7 дней после заражения по сравнению с неинфицированными условиях. В отличие от TLR2 - / - мышей значительно увеличили уровни FTIC-декстрана в сыворотке крови по сравнению с исходным предлагая тяжелыми нарушениями целостности барьера в этом напряжение во время C. rodentium инфекции, как было показано ранее.
Рисунок 2. C. rodentium нагрузки в просвет слепой кишки, толстой кишки и зараженных мышей C57BL / 6 на 7 дней после заражения. Lumen, слепой кишки и толстой ткани были собраны, гомогенизированный, и покрытие в серийных разведений на агаре LB. Каждый сircle представляет собой единый образец, собранный из отдельных животных. Сплошные линии указывают на среднее геометрическое в то время как вертикальные полоски указывают на ошибки SEM.
Рисунок 3. Гистологический анализ повреждений, вызванных C. rodentium инфекции. По 7-й день после заражения умеренный иммунный клеточной инфильтрации, а также удлинение крипт, истощение бокаловидных клеток и отек мягких наблюдается по сравнению с контрольной неинфицированных тканях. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 4. Иммунофлуоресценции пятна на неинфицированных и 12-й день после инфекцииния ткани мышей C57BL / 6. Дистальный толстой ткани окрашиваются для принимающей белка Ki67 (красный) и C. rodentium белка МДП (зеленый).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Citrobacter rodentium инфекции предоставляет ценную модель для изучения как инфекционные болезни и колитов у мышей. Эта уникальная модель позволяет для характеристики как хозяин ответы, а также патогенных свойств бактерий. Действия, описанные в этом протоколе подробно успешного использования этой модели.
Есть несколько важных шагов в этом протоколе, чтобы иметь в виду при вызывая колиты и анализа ответов. Во-первых, подготовка свежих ночь C. rodentium посевного материала в LB бульоне необходимо для успешного заражения мышей. В дозе 10 8 -10 9 организмов требует, чтобы заразить большинство штаммов мышей, если посевной остается в шейкере или на скамью верхней при комнатной температуре в течение длительного времени, не будет достаточно жизнеспособных организмов, оставшихся в культуре , чтобы вызвать колит на инфекции. Важно также, чтобы агитировать бактериальной посевной дозагрузка шприц для инфекции, чтобы каждая мышь получает равную дозу бактерий. При сборе ткани на конце инфекции, завершить погружение толстой ткани достаточным объемом 10%-ного формалина необходим для правильной фиксации тканей происходит. Предполагается, что ткани быть добавлены в формалине в 5-мл флаконе, а не в микроцентрифуге трубы, соотношении 10:1 фиксирующих в ткани рекомендуется. Правильная фиксация необходима для последующего гистологического анализа, а также иммунофлуоресцентного окрашивания этих тканей. Важно также иметь в виду, что различные штаммы нокаутом будут различные ответы на индукцию C. rodentium колит. При заражении новым штаммом в первый раз, мышей необходимо внимательно следить, чтобы определить гуманного конечной точкой для эксперимента, если это необходимо. Временные точки для анализа целостности эпителиальных барьеров, бактериальной нагрузки, и гистология может быть определена на основе реакции мышинапрягаться, представляющих интерес для инфекции.
В качестве обшивки гомогенатах тканей на LB пластины для определения бактериальной нагрузки не является полностью селективным методом ПЦР для выполнения C. rodentium конкретных генов на бактериальных колоний можно сделать, чтобы дифференцировать C. rodentium от других bacterialcolonies на тарелку. Другой вариант заключается в гомогенатах ткани пластины на агар MacConkey, так как эта среда является более селективным для C. rodentium, чем LB агар. Альтернативный подход состоит в использовании стрептомицина устойчивы дикого типа C. rodentium штамм instead.Substitution с штамма, устойчивого стрептомицин приведет к индукции и той же модели колита, описанные в данном протоколе. Выгода от использования штамма стрептомицин устойчивые является для облегчения анализа бактериальной нагрузки, а гомогенатах тканей от этих инфекций может быть высевают на LB агаре со стрептомицином, а не LB агар в одиночку. Это позволяет избежать потенциального роста коммensal микробов на пластине, что делает процесс подсчета КОЕ проще и точнее. Другой альтернативой при измерении бактериальной нагрузки, является для инкубации пластин после посева разведений гомогенатах тканей на LB агаром при 37 ° С в течение ночи или при комнатной температуре в течение 2-3 дней, что приводит к замедлению роста бактерий, перед подсчетом.
Этот протокол описывает шаги, необходимые для создания надежной модели инфекционного колита, а также методы, используемые для характеристики C. rodentium инфекции у мышей. Кроме использования этой модели для изучения патоген-хозяин взаимодействия и иммунного ответа, она также может быть использована для изучения того, как бактериальная инфекция может увеличить риск рака толстой кишки. Это может быть сделано путем воздействия C. rodentium инфицированных мышей к канцерогенным azoxymethane, или на изучении того, как инфекция воздействия на пролиферации эпителиальных клеток, или на генах, участвующих в дифференциации эпителиальных клеток или развития опухоли 15. НамING инфекционных модели колита, изложенные в этом протоколе, бактериальные номера также может быть оценена в экстра-кишечные сайтов, таких как мезентериальных лимфатических узлов, селезенки и печени. Более высокие числа в этих органах может означать, что мыши штамма проходит испытания весьма восприимчивы к инфекции. С помощью иммунофлюоресценции техники окрашивания описано, практически бесконечный ряд механизмов, в ответ на инфекцию могут быть изучены. Как только знакомы с методами, описанных здесь, протокол может быть изменен, чтобы собрать тканей для измерения других конечных точек, например, для выделения РНК и оценки уровня экспрессии гена, более тщательно охарактеризовать ответы на C. rodentium инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами для операционных BAV от Крона и колит фонда Канады (CCFC) и Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR). ГБ была профинансирована выпускников аспирантуры с CIHR. BAV это дети с кишечными и заболеваний печени (CHILD) Председатель Фонда исследований в педиатрии IBD и Канада заведующая кафедрой в детской гастроэнтерологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
