Summary
Microdissezione laser è una tecnica che consente il recupero di cellule scelte da piccole quantità di parenchima. Qui si descrive un protocollo per l'acquisizione di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici da utilizzare per gli studi di trascrittomica. Il nostro protocollo migliora l'autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane, facilitando così la loro collezione.
Abstract
Microdissezione laser (LMD) è una tecnica che consente il recupero di cellule e tessuti selezionati da piccole quantità di parenchima 1,2. Le cellule sezionato possono essere utilizzati per una varietà di indagini, come gli studi di proteomica, trascrittomica o di valutazione o analisi del DNA cromosomico 2,3. Un'applicazione particolarmente impegnativa LMD è l'analisi del trascrittoma, che, a causa della instabilità del RNA 4, può essere particolarmente importante quando le cellule vengono sezionati da tessuti che sono ricchi di RNasi, come il pancreas. Un protocollo microdissezione che consente una rapida identificazione e raccolta delle cellule bersaglio è essenziale in questa impostazione per abbreviare il tempo di movimentazione del tessuto e, di conseguenza, per garantire la conservazione dell'RNA.
Qui si descrive un protocollo per l'acquisizione di cellule beta pancreatiche da campioni chirurgici di essere utilizzati per lo studio trascrittomica 5. Piccoli pezzi di pancreas di circa 0,5-1 cm 3 sono stati tagliati dai margini sani figuranti di campioni resecati pancreas, incorporati in Tissue-Tek Compound ottobre, immediatamente congelati in refrigerata 2-metilbutano, e conservati a -80 ° C fino al sezionamento. Quaranta sezioni seriali di spessore 10 um sono state tagliate su un criostato in un ambiente -20 ° C, trasferite individualmente i vetrini, essiccate all'interno del criostato per 1-2 min, e conservati a -80 ° C.
Immediatamente prima della procedura microdissezione laser, le sezioni sono state fissate in ghiaccio freddo, preparata etanolo al 70% per 30 sec, lavato da 5-6 cali di ghiaccio freddo acqua trattata con DEPC, e disidratato per un minuto due incubazioni in ghiaccio freddo 100% etanolo seguita da xilene (che viene usato per la disidratazione del tessuto) per 4 min, sezioni di tessuto sono state poi essiccate dopo per 3-5 min. È importante sottolineare che tutti i passi, eccetto l'incubazione in xilene, sono stati eseguiti utilizzando ghiacciata reagenti - una modifica su un protocollo precedentemente descritto 6. Utilization di reagenti ghiaccio freddo ha determinato un aumento marcato della autofluorescenza intrinseca delle cellule beta, e facilitato il loro riconoscimento. Per microdissezione, quattro sezioni erano disidratati ogni volta: due sono stati posti in una pellicola protettiva tubo da 50 ml, per proteggere i tessuti da umidità e sbiancamento, gli altri due sono stati immediatamente microdissezione. Questa procedura è stata eseguita utilizzando un PALM MicroBeam strumento (Zeiss) che impiega il laser a pressione Auto catapultando (AutoLPC) modalità. Il completamento di cellule beta / dissezione isolotto da quattro criosezioni necessari non più di 40-60 min. Le cellule sono state raccolte in un unico AdhesiveCap e lisate con 10 microlitri di tampone di lisi. Ogni singolo campione di RNA per analisi trascrittomica stata ottenuta combinando 10 campioni cellulari microdissezione, seguita da estrazione RNA utilizzando il Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Questo protocollo migliora l'autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane, facilitando così la loro rilevazione rapida e precisa e Collezione. Ulteriore miglioramento di questa procedura potrebbe consentire la dissezione delle cellule beta fenotipicamente diversi, con possibili implicazioni per una migliore comprensione dei cambiamenti associati al diabete di tipo 2.
Protocol
1. Congelamento di tessuto pancreatico umano
- Rimuovere il tessuto adiposo, vasi sanguigni, nervi e tessuto parenchimale non con un bisturi e pinzette, e tagliare il tessuto pancreatico in pezzi (~ 0,5-1 cubetti di cm).
- Posizionare un pezzo tessuto pancreatico nel centro di un Cryomold, e coprire completamente con freddo Tissue-Tek Compound ottobre Mettere il Cryomold in un vaso il cui fondo è ricoperto di pre-raffreddato 2-metilbutano e snap-congelamento in azoto liquido. Conservare il campione congelato a -80 ° C.
2. Preparazione di sezioni congelate
- Indossare guanti durante tutte le misure per evitare la denaturazione di RNA.
- Pulire il coltello criostato, portacampione e pennello con il freddo di etanolo 100% e RNase Away. Posizionare il tessuto congelato all'interno del criostato.
- Attendere che il, coltello e pennello tessuto raggiungere -20 ° C. Etichettare il SuperFrost Plus diapositive e pre-raffreddare dentro la camera di criostato in attesaper il tessuto di raggiungere -20 ° C.
- Applicare il Tissue-Tek Compound PTOM porta campione e posizionare il tessuto congelato in alto.
- Una volta che il Tissue-Tek OCT è congelato tagliare il cryoblock e rimuovere ogni eccesso di Tissue-Tek Compound ottobre con una lama di rasoio.
- Tagliare un totale di 40 consecutivi 10 fette micron dal blocco di tessuto pancreatico. Inoltre si consiglia di tagliare una prima fetta e mezzo per essere salvati per i disegni panoramica della sezione del pancreas che può facilitare l'individuazione di isole all'interno delle fette durante il processo di microdissezione.
- Trasferire la sezione della lama al centro di un vetrino SuperFrost Plus toccando il retro del vetrino con il dito (coperta da un guanto) per riscaldare solo la regione in cui la sezione deve aderire.
- Asciugare il 1-2 min sezioni all'interno del criostato a -20 ° C, dopo di che li metti in una scatola scorrevole posta in ghiaccio secco. Conservare le sezionia -80 ° C.
- Se necessario, pulire la lama del coltello con tovaglioli di carta e fredda di etanolo al 100%.
3. Disidratazione delle sezioni congelate
- Preparare i reagenti: versare 30 ml preparata etanolo 70%, 30 ml di acqua trattata con DEPC, 2x30 ml di etanolo 100% e 30 ml di xilene in provette da 50 ml Cellstar (Falcons); freddo e conservare tutti i reagenti (tranne xilene) su ghiaccio.
- Pulire lo spazio di lavoro sotto il cofano con il 100% di etanolo e RNaseZAP.
- Processo due criosezioni come segue: fissare in ghiaccio freddo etanolo al 70% per 30 secondi, lavare con 5-6 rapidi cali in ghiaccio freddo DEPC-acqua trattata, disidratare due volte per 1 minuto in etanolo ghiacciato al 100%, incubare per 4 min in xilene a temperatura ambiente (25 ° C), e asciugare all'aria per 3-5 min. Ripetere questa operazione con un altro paio di criosezioni.
- Inserire due criosezioni secchi back to back in una provetta da 50 ml Cellstar avvolto con un foglio di alluminio per proteggerli dalla luce e dall'umidità.
- Pulire il microscopio con RNaseZAP e montare il tappo adesivo in RoboMover.
- Impostare le seguenti impostazioni: set di filtri 09 (eccitazione: 450-490 nm, emissione> 515 nm), AutoLPC modo, l'energia laser del 50%, 65% fuoco del laser, laser 100% della velocità, distanza di 5 micron tra gli scatti AutoLPC, 6 distanza pm alla linea, altezza di lavoro: -10.100.
- Inserire una diapositiva nello stadio.
- Individuare le cellule beta autofluorescenti sotto visualizzazione microscopica (5x o 10x).
- Passare alla lente 40x, selezionare le cellule beta con lo strumento "mano libera" di selezione e microdissect utilizzando il laser.
- Cattura il tessuto di quattro criosezioni disidratati in una AdhesiveCap.
Commento 1: il tempo per analizzare le cellule beta di un cryosection disidratato non deve superare i 10-20 minuti, per evitare la reidratazione delle sezioni di tessuto che porterebbe aRNA degrado.
Commento 2: verificare la riuscita del processo di microdissezione mediante ispezione visiva dopo aver spostato il palco per il checkpoint.
5. Lisi di microdissezione tessuto cellulare Beta Enriched
- Rimuovere il AdhesiveCap dal RoboMover.
- Pipettare 10 microlitri di tampone di estrazione (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) nel coperchio del AdhesiveCap e incubare capovolta a 42 ° C per 30 min.
- Centrifugare a 10.000 xg e mettere il lisato in ghiaccio secco. Conservarlo a -80 ° C fino a quando l'estrazione dell'RNA viene eseguita.
- Ripetere i passaggi da 3.) A 5.) Con tutte le altre sezioni.
6. Estrazione RNA
- Unire tutti e dieci i lisati 10 pl
- Procedere con l'isolamento di RNA, lavorando a temperatura ambiente secondo il protocollo del RNA Isolation Kit PicoPure, Arturo, con un rapporto di 1:1 tampone di estrazione (XB) al 70% di etanolo (incluso il trattamento DNasi).
7. RNA Analisi
- Utilizzare 1 RNA pl per l'analisi di qualità e quantità utilizzando un Agilent 2100 Bioanalyser (picoChip). Valutazione quantitativa viene effettuata in riferimento ad un RNA standard, caricati in parallelo sul chip.
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Representative Results
Come mostrato in figura 1, il protocollo modificato disidratante portato ad un miglioramento di autofluorescenza cellule beta rispetto al precedente protocollo pubblicato 6. L'applicazione del protocollo descritto, ciascuno dei 39 campioni chirurgici pancreatiche è stato usato per generare 40 criosezioni seriali per una media di 31'544'704 micron 3 tessuto / pancreatico campione (range: 8'742'390 - 81'522'153 micron 3) come mostrato nella Tabella 1. Questo rappresenta il volume di circa 18 isole pancreatiche di 150 micron di diametro, o di 35.000 β-cellule. Il tessuto origine da una media di 38 isolotti pancreatici diversi / campione (range: 19-80 isolotti), ciascuno dei quali era tipicamente osservato in due o più sezioni consecutive. La grande variabilità nella resa di isolette esemplari differenti riflette l'eterogeneità della sorgente tessuto, sia la testa o la coda del pancreas, nonché il progressivo miglioramento degli operatori nel rilevareione delle isole nel tempo 10 min dedicato alla ispezione di ogni sezione.
RNA totale di ciascun tessuto microdissezione e lisato è stato purificato con il kit PicoPure Arcturus congelato RNA Isolation of Applied Biosystems e eluita in 11 microlitri, secondo il protocollo del produttore. Successivamente 1 RNA pl di ciascun campione è stato analizzato dal Bioanalyser Agilent 2100. Abbiamo ottenuto in media 42 ng di RNA / campione (range: 5-229 ng / provetta) con un numero medio di integrità dell'RNA (RIN) di 5,8 (range: 3,4 - 7,2). Figura 2 mostra un esempio di analisi dell'RNA. Qualunque sia il valore RIN tutti i campioni analizzati RNA sono stati utilizzati con successo per gli studi di trascrittomica. Non abbiamo trovato una relazione diretta tra la quantità di tessuto microdissezione e la resa RNA. Le differenze di intervallo di tempo tra la raccolta da parte dei chirurghi e il congelamento dei campioni pancreatiche dopo il suo esame e il rilascio dal patologo potrebbe spiegare in p arte per la qualità e quantità variabili di RNA recuperati. Altri fattori chiave da considerare sono l'energia laser applicata per microdissezione, con l'energia inferiore cedendo l'integrità dell'RNA superiore, così come il fuoco del laser e la distanza dei punti di LPC. La messa a fuoco è idealmente impostato quando un leggero "impatto" del laser sulla superficie di vetro del vetrino, formando un piccolo punto nero, può essere visto. Nelle nostre mani i migliori risultati si ottengono con una energia laser del 50%, un fuoco del laser del 65%, anche se atto a compensare le differenze di spessore delle sezioni, e una distanza di punti LPC di 5 um. Inoltre, la quantità di RNA può essere ottimizzata mantenendo l'altezza di lavoro del RoboMover, ossia la distanza tra il tappo adesivo e la sezione, la più bassa possibile per evitare la perdita di tessuto microdissezione durante il processo di cattura. Nel nostro set up l'altezza di lavoro è a -10.100 unità PALM arbitrarie.
| numero di isole / campioni | tessuto volume raccolto / campione [micron 3] | RIN | Concentrazione [ng / mL] | RNA totale [ng] | |
| DP002 | 34 | 24'947'696 | 5,2 | 1,149 | 10,34 |
| DP003 | 30 | 41'141'488 | 5,5 | 1,677 | 15,09 |
| DP005 | 23 | 27'024'264 | 3,5 | 8,259 | 66,07 |
| DP006 | 25 | 45'900'848 | 3,4 | 7,399 | 59,19 |
| DP007 | <td> 3023'936'048 | 6,5 | 0,595 | 4,76 | |
| DP008 | 22 | 68'248'432 | 6,2 | 1,559 | 14,03 |
| DP010 | 34 | 33'156'752 | 5,6 | 1,750 | 19,25 |
| DP011 | 29 | 31'339'152 | 6.0 | 1,365 | 15,02 |
| DP012 | 34 | 57'594'360 | 6,3 | 3,025 | 33,28 |
| DP017 | 35 | 28'212'256 | 6.0 | 1,292 | 14,21 |
| DP030 | 35 | 48'007'530 | 5,6 | 2,180 | 23,98 |
| DP013 | 36 | 34'371'045 | 6,9 | 1,350 | 14,85 |
| DP014 | 35 | 21'360'060 | 7,2 | 1,270 | 13,97 |
| DP015 | 33 | 20'923'488 | 4,1 | 4,000 | 44,00 |
| DP019 | 40 | 35'431'704 | 7.0 | 1,670 | 18,37 |
| DP025 | 19 | 15'329'844 | 6,6 | 0,496 | 5,46 |
| DP034 | 19 | 81'522'153 | 6,4 | 4,260 | 46,86 |
| DP039 | 32 | 19'074'410 | 6,5 | 1,270 | 13,97 |
| DP040 | 44 | 31'565'630 | 5,4 | 2,300 | 25,30 |
| DP042 | 52 | 40'333'840 | 7.0 | 2,510 27,61 | |
| DP021 | 65 | 33'996'260 | 6,3 | 2,830 | 31,13 |
| DP023 | 19 | 19'513'310 | 5,6 | 8,250 | 90,75 |
| DP024 | 32 | 24'125'140 | 6,3 | 20,780 | 228,58 |
| DP038 | 23 | 18'306'040 | 6,6 | 11,700 | 128,70 |
| DP045 | 35 | 36'345'620 | 6,3 | 1,100 | 12,10 |
| DP033 | 42 | 26'078'550 | 6,5 | 15,380 | 169,18 |
| DP022 | 49 | 33'535'460 | 6,8 | 7,590 | 83,49 |
| DP041 | 56 | 34'899'830 | 5,7 | 3,350 | 36,85 |
| DP049 | 38 | 18'521'230 | 6,8 | 1,020 | 11,22 |
| DP028 | 32 | 16'410'670 | 5,6 | 1,720 | 18,92 |
| DP056 | 36 | 19'737'580 | 5,7 | 1,130 | 12,43 |
| DP059 | 52 | 23'376'180 | 3,6 | 7,880 | 86,68 |
| DP047 | 41 | 20'658'370 | 6,4 | 1,040 | 11,44 |
| DP036 | 23 | 8'742'390 | 3,5 | 0,950 | 10,45 |
| DP027 | 42 | 29'150'480 | 5,1 | 3,410 | 37,51 |
| DP046 | 54 | 16'800'070 | 5,3 | 8,210 | 90,31 |
| DP055 | 57 | 32'340'270 | 6,2 | 1,280 | 14,08 |
| DP064 | 74 | 41'896'460 | 6,5 | 2,440 | 26,84 |
| DP067 | 80 | 46'388'540 | 6,3 | 5,200 | 57,20 |
| media | 38 | 31'544'704 | 5,8 | 3,965 | 42,14 |
| numero di isole / campioni | tessuto volume raccolto / campione [micron 3] | RIN | RNA totale [ng] | ||
| gamma | 19-80 | 8'742'390 - 81'522'153 | 3,4-7,2 | 4,76-228,58 | |
| media | 38 | 31'544'704 | 5,8 | 42,14 | |
Tabella 1. Panoramica della quantità di tessuto microdissezione e la qualità e quantità dei RNA estratto. Gli esemplari sono elencati in ordine cronologico. Il volume di tessuto prelevato viene calcolato come segue: cryosection spessore (10 micron) x area microdissezione [um 2]. 1 RNA ml di ogni campione è stato analizzato il picoChip 2100 Bioanalyser Agilent.
Figura 1. Autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane autofluorescenza delle cellule beta, dopo la disidratazione di criosezioni pancreatiche con reagenti che erano o conservati a temperatura ambiente (A), o ghiacciata (B) (eccitazione 450-490 nm, emissione> 515 nm,. 400 x ingrandimento). Le cellule beta di colore giallo, mentre i dotti pancreatici, le navi e collagene visualizzare un colore verde. Scala bar: 75 micron.
Figura 2. Qualità e quantità di RNA estratto isolotto. Profilo di un campione umano isolotto RNA ottenuto con questo protocollo LMD (B) rispetto ad un campione standard di RNA (A). 1 RNA pl di ciascun campione è stato applicato su un picoChip e analizzati per quantity e qualità con il Bioanalyser 2100 Agilent. (A): RIN (numero integrità dell'RNA) 7.7 [rRNA Ratio (28S/18S): 1.3)], (B): RIN 7.2 [Rapporto di rRNA (28S/18S): 1.1)]. La concentrazione del RNA isolotto era di 1,3 ng / mL, per un importo complessivo di 10,3 ng da 21'360'060 3 micron tessuto pancreatico. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Descriviamo un metodo affidabile per la microdissezione laser (LMD) di isole umane da un campione del pancreas chirurgico. A condizione che un microscopio LMD è disponibile, questa procedura potrebbe essere attuata in qualsiasi istituto di ricerca di eseguire pancreatectomies parziali, aumentando in tal modo l'accesso al materiale umano da entrambe le isole non-diabetici e di tipo 2 soggetti diabetici. Questo è particolarmente rilevante data la scarsità di pancreas offerto per l'isolamento delle isole. Aspetti favorevoli di LMD rispetto all'isolamento isolotto dalla digestione con collagenasi sono il tempo ridotto tra espianto della lavorazione di tessuti e degli isolotti di RNA estrazione 7, l'arricchimento delle cellule beta 7, nonché evitare dure manipolazioni meccaniche ed enzimatiche 8, 9,10, che potrebbe alterare il profilo di espressione genica. Nel caso di pazienti parzialmente pancreatectomizzati informazioni clinica e metabolica è tipicamente disponibile che nel caso di organodonatori. D'altra parte, l'isolamento di isolotti di rendimenti LMD meno di RNA con valori inferiori RIN rispetto a quelli osservati dopo digestione con collagenasi e non fornisce isolotti viventi per studi funzionali. Inoltre, la malattia pancreatica porta alla chirurgia può influenzare il profilo di espressione isolotto. Una valutazione equilibrata di questi pro e contro sarà raggiungibile attraverso studi comparativi su un gran numero di isolamenti delle isole effettuata da digestione collagenasi e LMD sia da donatori di organi o pazienti parzialmente pancreatectomizzati, come quelle in corso in Medicina multicentrico iniziativa innovativa per Diabete (IMIDIA) con l'obiettivo di "Migliorare la funzione delle cellule beta e l'identificazione di biomarcatori diagnostici per il monitoraggio del trattamento nel diabete" ( http://www.imidia.org ).
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vogliamo ringraziare tutti i colleghi che hanno fornito aiuto, consiglio e contribuisce in modo fondamentale a vari passi di questo progetto. La produzione di questo articolo video è stato sostenuto con i fondi IMIDIA ( http://www.imidia.org ), il Ministero tedesco dell'Istruzione e della ricerca (BMBF) al Centro tedesco per la ricerca del diabete (DZD, http://www.dzd -ev.de ) e l'Ospedale universitario Carl Gustav Carus presso l'Università di Tecnologia di Dresda. Il lavoro ha portato a questa pubblicazione ha ricevuto il sostegno della iniziativa medicinali innovativi impresa comune ai sensi della convenzione di sovvenzione n ° 155005 (IMIDIA), le risorse di cui sono composte di partecipazione finanziaria del Settimo programma quadro dell'Unione europea (FP7/2007-2013) e dall'EFPIA società 'contributo di natura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22x22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
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