Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل دورة الخلية الحية من Published: May 19, 2013 doi: 10.3791/50239
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1
1Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

بروتوكول للتحليل دورة الخلية الحية

Abstract

وقد التدفق الخلوي تستخدم على نطاق واسع للحصول على معلومات حول محتوى الحمض النووي في عدد السكان من الخلايا، إلى استنتاج النسب المئوية النسبية في مختلف مراحل دورة الخلية. وقد تم تمديد هذه التقنية بنجاح إلى الأنسجة الإنقسامية من طراز كائن ذبابة الفاكهة السوداء البطن للدراسات الجينية من تنظيم دورة الخلية في الجسم الحي. عندما يقترن مع نوع من الخلايا المحددة التعبير بروتين فلوري والتلاعب الجيني، يمكن للمرء الحصول على معلومات مفصلة حول الآثار المترتبة على عدد الخلايا، حجم الخلية ودورة الخلية الإلغاء في الجسم الحي. ومع ذلك فقد اعتمدت هذه الطريقة الخلية الحية على استخدام الخلية نفاذية هويشت 33342 صبغ الحمض النووي الإقحام، مما يحد من المستخدمين إلى أجهزة قياس التدفق الخلوي مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. قمنا بتعديل هذا البروتوكول على استخدام الخلية الحية صبغ الحمض النووي أحدث وVybrant DyeCycle البنفسج، متوافقة مع البنفسج الليزر 405nm وأكثر شيوعا. بروتوكول المعروضة هنا يسمح لكفاءة تحليل دورة الخلية إلى جانب الخليةنوع، حجم الخلية النسبي والمعلومات عدد الخلايا، في مجموعة متنوعة من الأنسجة ذبابة الفاكهة. هذا البروتوكول تمتد دورة الخلية تقنية مفيدة لتحليل الأنسجة الحية ذبابة الفاكهة إلى محلل الفوق الصغيرة، والصوتية أقلم التركيز عداد الكريات، والتي يمكن تشغيلها وصيانتها على نطاق و-LAB واحد.

Introduction

التدفق الخلوي يمكن أن تستخدم لقياس بقاء الخلية، حجم الخلية النسبي، والمحتوى الحمض النووي والتعبير بروتين فلوري في السكان الخلية الحية. ونظرا لتكرار الحمض النووي النووية خلال S-المرحلة، معلومات عن محتوى الحمض النووي في السكان من الخلايا يمكن استخدامها لاستنتاج النسب المئوية النسبية في مختلف مراحل دورة الخلية 1-3. وقد أصبح هذا الأسلوب حجر الزاوية في تحليل دورة الخلية في نظم نموذج من الخميرة إلى الثدييات.

أصبح ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن نظام نموذجا ممتازا لالوراثية في التحليلات المجراة من تنظيم دورة الخلية. الأدوات الجينية الواسعة المتاحة في الذباب تسمح للتلاعب الأنسجة أنيقة محددة زمنيا وينظم من المنظمين دورة الخلية في الجسم الحي جنبا إلى جنب مع الفلورسنت نسب البروتين على أساس تتبع 4-6. وقد استخدم التدفق الخلوي لدراسة محتوى الحمض النووي في عدد من أنواع الخلايا ذبابة الفاكهة، بما في ذلك endoreplicating الخلايا والخلايا الإنقسامية مثقف 7،8. وقدم تقدما هاما للدراسات في دورة الخلية الحية من قبل دي لا كروز وادغار، مع وضع بروتوكول لتحليل تدفق cytometric من العيش مضاعفا ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي 9،10، وهو البروتوكول الذي تم استخدامها وتكييفها من قبل العديد من مختبرات. هذه التقنية، عندما يقترن الوراثية في الجسم الحي تتبع النسب عن طريق محرض التعبير بروتين فلوري ووضع العلامات المحددة الأنسجة، ويسمح احد للحصول على معلومات حول آثار التلاعب الجيني في العام الخلية مضاعفة الوقت، وحجم الخلية وتحديد التوقيت الدقيق لمراحل دورة الخلية في الجسم الحي 9 ، 11. ومع ذلك فقد اعتمدت هذه الطريقة حتى الآن على استخدام الخلية نفاذية هويشت 33342 صبغ الحمض النووي الإقحام إلى وصمة عار وتحديد الحمض النووي في الخلايا الحية، والتي حدت مستخدمين تتدفق cytometers مع ليزر الأشعة فوق البنفسجية قادرة على إثارة صبغ هويشت. وتوجد عموما هذه فقط في مطابقة (أي دينار بحريني FACS VANTAGE، BD FACSAria) أو مكلفة متعدد الألوان أنظمة الفوق (أي BD LSR)، والتي تتطلب عادة دعم المرافق المؤسسية الأساسية التدفق.

قمنا بتعديل بروتوكول المستندة إلى هويشت لاستخدام صبغة DNA الخلية الحية الجديدة من إينفيتروجن، Vybrant DyeCycle البنفسجي. هذه الصبغة هي متوافقة مع البنفسجي 405 نانومتر ليزر، أكثر شيوعا في تحليل الفوق أصغر والمتاحة في الصغيرة محلل الفوق مكتفية ذاتيا، والصوتية أقلم التركيز عداد الكريات. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لتحليل دورة الخلية التي يمكن أن يقترن مع نوع من الخلايا، حجم الخلية، عدد الخلايا وتحليل النسب في مجموعة متنوعة من الأنسجة ذبابة الفاكهة خلال مراحل مختلفة من التطوير باستخدام DyeCycle البنفسج وأقلم. هذا البروتوكول يوسع عدد من cytometers مناسبة لمثل هذا التحليل مع الأنسجة ذبابة الفاكهة ويقدم أمثلة عن كيفية هذا النوع من تحليل دورة الخلية الحية يمكن تعديلها لأنواع الأنسجة الإضافية ومراحل النمو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. يطير تربية

  1. الصليب تطير من المورثات المرغوب في قنينات بلاستيكية ضيقة مع 10 مل الخميرة الغلوكوز متوسطة 3 أو غيرها من وسائل الاعلام الغنية بالبروتين من اختيارك. ووصف واسعة ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا أدوات متاحة للأنسجة التعبير محددة ونسبها البحث عن المفقودين في الجسم الحي مع فلوري بروتين تعبير بالتفصيل 4،5 في مكان آخر. نقل الآباء إلى قارورة الطازجة يوميا للحصول على سلسلة من 24 مجموعات ذرية الموارد البشرية، أو لمزيد من التدريج الدقيق، وجمع الأجنة على لوحات أجار ونقل اليرقة حديثة الفقس إلى قارورة كما هو موضح 10. لضمان شروط موحدة عبر التجارب وتجنب الاكتظاظ، ينبغي أن العدد الإجمالي للذرية F1 في قنينة واحدة يكون هناك أكثر من 100. اعتمادا على تصميم الوراثية من التجربة، والحفاظ على قارورة في حاضنة مناسبة حتى المرحلة التنموية المنشودة.
  2. جمع حيوانات التجارب: سوف تحتاج يرقات ناضجة في 3 ش اليرقاتالطور (L3) في حوالي 110-120 ساعة من التطوير لتشريح اليرقات أو أبيض prepupa (WPP) للانطلاق العذراء دقيقة. تغييرات دراماتيكية دورة الخلية، بما في ذلك التحول إلى دولة غير التكاثري تحدث في timepoints متميزة خلال مسخ 12،13. لذلك التدريج الصحيح للخادرة (في حدود 1 ساعة التنمية) هو الأساسي للبيانات دورة الخلية استنساخه أثناء التحول. WPP يناظر 0 ساعة بعد تشكيل خادرة (0 ساعة APF) كما هو مبين في الشكل 1، لوحة I. اجمع WPP في طبق بيتري 35 ملم على Kimwipe مطوية الرطب مع 2.5 مل من الماء للحفاظ على بعض الرطوبة. العمر خادرة حتى المرحلة المرغوبة (ساعات APF) في درجة حرارة مناسبة. لاحظ أن التنمية العائدات 1.2 مرات أسرع في 29 ° C و 2.2 مرات أكثر ببطء عند 18 درجة مئوية مما كانت عليه في معيار 25 ° C 14.
  3. الحيوانات حرارة صدمة لتنشيط للصدمة الحرارة flipase (HS-FLP) الناجم عن إعادة التركيب لنسب لتعقب الحيوانات المستنسخة إذا لزم الأمر 9،11. لللصدمة الحرارية لليرقة، اغمسوغرقت تماما قارورة في حمام مائي (وضعت في 37 درجة مئوية) وضمان اليرقات. لللصدمة الحرارية للخادرة، وختم طبق بيتري مع parafilm ويغرق بالكامل في حمام مائي. تأكد من إزالة Parafilm بعد للصدمة الحرارية، التي تتيح تبادل الأكسجين الكافي للبقاء الحيوان. مدة للصدمة الحرارية يعتمد على النشاط من التحوير flipase المستخدمة وعدد من الحيوانات المستنسخة المطلوب. نحن نستخدم بشكل روتيني 7-8 دقيقة لإحداث "FLIPOUT" النسب تتبع استنساخ 15 في اليرقات مع HS-FLP التحوير على الكروموسوم الأول و2-4 دقيقة للصدمة الحرارة من الشرانق في 35 أطباق ملم، في حين أن HS-FLP التحوير على الكروموسوم الثاني يتطلب 20 دقيقة. الصدمة الحرارية للحصول على أرقام مماثلة من الحيوانات المستنسخة.

معدل انقسام الخلايا وتوقيت تشريح يحدد حجم استنساخ في كل الأنسجة. في ظل الظروف العادية، نجد أن الحيوانات المستنسخة التي يسببها في الجناح اليرقات مع الحد الأدنى الصدمة الحرارية 20 (باستخدام HS-FLP التحوير على الكروموسوم الثاني) وdissecفي وقت لاحق تيد 48 ساعة، تحتوي على ما يقرب من 20-30 استنساخ فصل بشكل جيد مع أحجام تتراوح ما بين 10 خلايا لكل استنساخ لخليتين في استنساخ، بمتوسط ​​حوالي أربع خلايا في استنساخ. في المقابل، 7 دقائق للصدمة الحرارة مع نفس HS-FLP التحوير من الشرانق في طبق بتري في 0 ساعة APF تشريح بعد مرور 36 ساعة، غلة فصل الحيوانات المستنسخة جيدا (حوالي 15-25) تتراوح بين سنة وأربع خلايا بمتوسط من 2.2 في استنساخ الخلايا. هذه البيانات يمكن استخدامها لتحديد متوسط ​​الخلية مضاعفة الوقت للأنسجة تحت الدراسة.

2. تشريح

  1. نقل بلطف اليرقات / الشرانق إلى الزجاج واضحة طبق تشريح تحتوي على 1X PBS.
  2. باستخدام مجهر تشريح وافرة ضوء، فهم بلطف بواسطة يرقة البطن مع اينوكس حاد # 5 forcep، وقطع الثالثة الأمامي مع المقص الصغير، وعكس الثالث الأمامي بالضغط على منطقة الفم إلى الداخل تجاه الخلفي في حين الضغط على اليرقات بشرة ثابت (الشكل 1A). إزالة بعناية opaquه الدهون في الجسم والقناة الهضمية أي المتبقية لزيادة وضوح من الأنسجة المطلوب، مثل الجناح، العين أو الدماغ. تشريح الأنسجة المطلوب؛ إزالة نظيفة أجنحة من القصبة الهوائية وبشرة مع ملقط، من عيون-السنانير الفم، أو الدماغ من العينين (الشكل 1G).
  3. لتشريح خادرة؛ استخدام forcep لفهم بلطف خادرة من قبل الطرف الأمامي من حالة العذراء حيث هناك فقاعة الهواء، لتجنب إتلاف خادرة داخل (الشكل 1C). ملقط أو مقص الصغرى في اليد معارضة يمكن أن تستخدم للمساعدة في موقف خادرة عائمة لاستيعاب السليم. خفض نظيفة من خلال الطرف الخلفي للخادرة مع مقص الجزئي. وينبغي بذل هذا الخفض مستعرضة في زاوية طفيف باتجاه الجزء الظهري للحيوان، للافراج عن الضغوط الداخلية دون فرض الدهون histolyzed إلى الأنسجة المطلوب في الصدر والرأس. قطع بعناية على طول متوسط ​​الظهرية، وتجنب الأجنحة الأمامية ومجمع العين والدماغ. إزالة بعناية خادرة من العذراءحالة على استيعاب الحافة الخلفية من البشرة العذراء وإخراجه من حالة العذراء (1D الشكل). كزة ثقب صغير في الجزء الأمامي إهاب إلى مجمع العين والدماغ مع ملقط. باستخدام ماصة باستير الزجاج مع لمبة المطاط، وغسل بلطف PBS حل تشريح من خلال خادرة تشريح جزئيا لازالة الدهون histolyzed وأي نوع من الأنسجة المتبقية الأمعاء. هذا أيضا يزيت بشكل فعال ماصة الزجاج مع الدهون والبروتينات، مما يقلل من الإصابة الأنسجة تشريح من الالتصاق إلى الداخل من ماصة الزجاج في وقت لاحق.
  4. للحصول على أجنحة العذراء، إهاب تخيم على الجناح والجناح نفسه يجب نزعها من خادرة (الشكل 1E). ويمكن أن يتم هذا من خلال عقد خادرة بنسبة الرأس مع forcep واحد أثناء استخدام forcep آخر إما إلى فهم الطرف الأكثر الخلفي من إهاب الجناح وسحب أو المناورة forcep تحت جناح قرب المفصلي قبل الإطاحة به من جانب الذبيحة (Figure 1E). ومن ثم يمكن خفض الجناح أو تمزق في المفصلي لإزالته من الجسم ووضع في كومة بعيدا عن الذبائح وغيرها من المواد.
  5. للحصول على عيون العذراء أو الدماغ، وغسل خادرة حتى يصبح مجمع العين والدماغ طردت وخالية من خادرة (الشكل 1F، 1H). باستخدام forcep، وسحب بلطف العين العذراء بعيدا عن الدماغ وحفظ الأنسجة المطلوب.
  6. لا يستغرق وقتا أطول من 45 دقيقة لتشريح كل عينة، كما يصبح أقل دقة النتائج وتترك الخلايا لفترة أطول في برنامج تلفزيوني بعد فتح الحيوانات.

3. الأنسجة التفكك والحمض النووي تلطيخ

  1. باستخدام ماصة باستير مشحم، بعناية نقل الأنسجة تشريح إلى 0.5 مل من الحمض النووي لايف الحل وصمة عار في 5 مل أنبوب البوليسترين (الشكل 1G). نقل اقل PBS ممكن (أقل من 300 ميكرولتر) في الحل وصمة عار الحمض النووي، والتخفيف من التربسين سوف تمنع تفكك الأنسجة.
  2. احتضان الأنابيب مع SHAKIنانوغرام في 23 درجة مئوية في 500 دورة في الدقيقة (نستخدم إيبندورف Thermomixer).
  3. احتضان لمدة 70 دقيقة، ثم دوامة بلطف لمدة 5 ثوانى على سرعة متوسطة (الإعداد من 5). سوف vortexing لالمفرط يسبب تمزيق الخلايا وشكل الحطام، بينما كيل vortexing لسيؤدي إلى كتل الخلايا. عودة العينات إلى اهتزاز في 23 درجة مئوية في 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 إلى 20 دقيقة إضافية قبل vortexing للهم مرة أخرى لمدة 5 ثوانى بسرعة 5.
  4. للأدمغة وعيون العذراء أقدم من 36hAPF، لا بد من تعديل بروتوكول. فصل الأنسجة في الحمض النووي الحل وصمة عار في 23 درجة مئوية في 500 دورة في الدقيقة ل45-60 دقيقة في 1.7 مل أنابيب microcentrifuge. ثم واحد تلو الآخر يدويا فصل أجزاء كبيرة من الأنسجة عن طريق نقل إلى طبق تشريح جنبا إلى جنب مع حوالي 50 ميكرولتر الحمض النووي الحل وصمة عار وpipetting لالسريع صعودا وهبوطا مع رسمها يدويا ماصة باستير 16 (حوالي 100-150 افتتاح ميكرون). نقل كل عينة فصلها مع بقية 0.5 مل من الحمض النووي الحل وصمة عار في أنبوب مل 5. احتضان ل45 إضافية-30 دقيقة (ما يصل إلى 90 دقيقة من إجمالي وقت الحضانة) في 23 درجة مئوية مع اهتزاز عند 500 دورة في الدقيقة حتى كتل لم تعد مرئية.
  5. يجب أن يكون كاملا عينات فصل عدد قليل جدا من قطع مرئية كبيرة من الأنسجة، على الرغم من ملاحظة أن سوف ديكي شفافة بشرة الجناح العذراء لا فصل.

4. التدفق الخلوي

  1. بدوره على عداد الكريات أقلم وفتح البرنامج أقلم. وينبغي أن تتحول الليزر عداد الكريات على طريق القائمة بدء التشغيل، ويجب أن يتم تنفيذ اختبار الأداء اليومي مع الخرز تتبع الأداء مع عشرات كافية قبل كل يوم من الحصول على البيانات. وينبغي أن تكون مستويات السوائل على الأقل نصف كاملة والنفايات أفرغت قبل اختبار الأداء. ويمكن الاطلاع على تفاصيل لبدء التشغيل، معايرة وتشغيل أقلم في دليل المستخدم أقلم ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
  2. تصميم TE جديدةmplate من خلال خلق المؤامرات 4 نقطة و 2 رسوم بيانية في مساحة عمل فارغة مع المعلمات مبين في 4.3، أو تحديد قالب مصممة مسبقا مناسبة للتجربة، وبيان عدد العينات التي سيتم جمعها. قدمنا ​​قوالب أقلم (الملفات في. الحصول على الشكل) ليعيش ذبابة الفاكهة تحليل دورة الخلية مع Vybrant DyeCycle البنفسج وGFP أو طلب تقديم العروض التعبير في الملحق I.
  3. تشمل القوالب المتوفرة أربع قطع نقطة واثنين من رسوم بيانية مع المعلمات مبين في الشكل 2. قنوات لكشف ما يلي: FSC وSSC - مبعثر إلى الأمام والجانب مبعثر تشير إلى حجم الخلية وغشاء التعقيد، VL1 الارتفاع (H)، عرض (W) والمنطقة (أ) - تشير إلى الإثارة ليزر البنفسج من DyeCycle تلطيخ البنفسج الحمض النووي، وBL1 -A - الليزر الأزرق القناة 1 المنطقة، مشيرا إلى GFP مضان. القالب المنصوص عليها تحليل كراسة الشروط غير مطابقة للنموذج لتحليل GFP، إلا أنه يستخدم القناة الليزر الأزرق 3 (BL3-A)، والذي هو optimiزيد للكشف عن طلب تقديم العروض.
  4. المؤامرات نقطة في قوالب لديها بوابات لتقييد التحليل للسكان والمطلوب للحد من الحطام وخلية كتل من تحليل (الشكل 2). بوابة 1 يستثني الحطام وكتل على أساس SSC مقابل FSC (الشكل 2A). بوابة 2 يستثني الخلايا غير ملوثين، خلايا أفكارك G1 الفرعية وكتل الخلايا استنادا إلى تحديد singlets (VL1Area مقابل VL1Width) (الشكل 2B). بوابة 3 هو بوابة المشتقة، تشمل الخلايا داخل البوابات 1 و 2، ويحدد GFP (أو RFP) خلايا السلبية مقابل محتوى الحمض النووي على أساس VL1Height (الشكل 2C). بوابة 4 هو بوابة المشتقة، تشمل الخلايا داخل البوابات 1 و 2، ويحدد GFP (أو RFP) الخلايا إيجابية مقابل محتوى الحمض النووي (الشكل 2C). وتستخدم المؤامرات نقطة من حجم الخلية كما تم قياسها بواسطة GFP (أو RFP) مقابل مبعثر إلى الأمام (FSC) لتوليد جيتس 5 و 6 (الشكل 2D). رسوم بيانية مؤامرة محتوى الحمض النووي اثنين على العد المحور السيني وخلية على Y-AXIق للسكان يحددها بوابة 3 وبوابة 4. (الشكل 2E و2F) المدرج الإحصائي يمكن أيضا أن يدرج لحجم الخلية إذا رغبت (لا يظهر). للاطلاع على حجم رسوم بيانية الخلية، يجب تعيين السكان إلى غيتس 5 و 6، بالتآمر FSC على المحور السيني وتعول على المحور الصادي.
  5. ضبط التسجيل بحيث يتوقف عند 10،000 GFP أو طلب تقديم العروض الأحداث الإيجابية (وهذا سوف يكون بوابة 4، وبوابة المشتقة من بوابة 1، بوابة 2 وبوابة إيجابية GFP أو طلب تقديم العروض). كانت 10،000 GFP الأحداث الإيجابية تقليديا هدفا لمحات جودة المنشور 9،11 - يتراوح من 6،000. نقترح استخدام ما لا يقل عن 15 أجنحة أو العينين، أن ما يقرب من 50٪ GFP إيجابية للحصول على ما يكفي من بوابة 4 أحداث 10 لمحات ذات جودة عالية. ومع ذلك، لقد حصلنا على البيانات بنجاح واضحة لأولي تحليل دورة الخلية من عدد قليل من 6 أجنحة (الشكل 3A). ضبط مستوى الصوت لاقتناء 300 ميكرولتر، وهذا سوف نستخدم حوالي 460 ميكرولتر من إجمالي عينة مل 0.5. تاويبين بلي 2 إعدادات عتبة والجهد المناسب المقدمة في قالب على سبيل المثال في الشكل 2.
  6. تشغيل العينات في حساسية معيار أو حساسية عالية 100 ميكرولتر / دقيقة وقياسية. نجد شيئا يذكر لولا الاختلاف في تحليلنا مع مستويات حساسية مختلفة. ونظرا لتركز الصوتية من الخلايا، وهذا يمكن عداد الكريات قياس بدقة عينات في معدلات تدفق عالية جدا. على عكس cytometers التقليدية، نجد أي حل وسط من خلال الحصول على البيانات بسرعات تصل إلى 1،500 الأحداث في الثانية الواحدة. ملفات البيانات المسجلة التي يولدها البرنامج أقلم هي في صيغة السفح، وهو متوافق مع معظم الخلية دورة النمذجة البرمجيات.

5. تحليل البيانات

  1. رسوم بيانية من حجم الخلية ومحتوى الحمض النووي لGFP (أو RFP) السكان الإيجابية والسلبية يمكن مقارنة. ويمكن الطبقات يدويا عن طريق النسخ واللصق باستخدام برنامج أدوبي فوتوشوب. إذا تم تعيين المحور ص إلى تلقائي، فإن Y-المحور النطاق مع حighest العد لكل عينة. تتراكب اثنين من الرسوم البيانية مع مجموعة العمودي إلى autoscale يخلق تراكب رسوم بيانية مع المحاور المحددة لأقصى العالمية لكل السكان. وهذا يسمح المقارنة البصرية من السهل على التغيرات النسبية في دورة الخلية الإلغاء، حتى عندما مجموع أعداد الخلايا من GFP إيجابية وGFP السكان السلبية ليست ما يعادلها (على سبيل المثال في الشكل 3B). بدلا من ذلك، عرف المحور الصادي (الخيار اليدوي المحور الصادي) يمكن تعيين إلى قيمة ثابتة لرسوم بيانية. في هذه الحالة يمكن مقارنة أرقام الخلية النسبي لاثنين من السكان. كما يستخدم أقلم حجم محدد من عينة لكل شوط، الكمي المطلق للخلايا لكل شوط، في كل باب مع النسب المئوية من مجموع السكان، ويمكن الحصول عليها من جدول الإحصاءات ولدت تلقائيا أثناء تشغيل في مساحة العمل (على سبيل المثال في الشكل 3F ). ويمكن أيضا المؤامرات نقطة ورسوم بيانية تكون الطبقات بسهولة في البرنامج أقلم، ببساطة عن طريق سحب واسقاط عينات مختلفة من اله عينة القائمة ملف في الحق على الرسم البياني المطلوب من عينة مفتوحة للمقارنة. ولكن لتراكب مجموعات سكانية فرعية من داخل عينة واحدة (أي GFP إيجابية وسلبية GFP داخل نفس العينة)، ونحن نستخدم فوتوشوب.
  2. طريقتين يمكن استخدامها للعثور على النسب المئوية النسبية في مختلف مراحل دورة الخلية بالنسبة لعدد السكان. وتعتمد الطريقة على تقريب المناطق التي يحددها المستخدم لتحديد حدود G1، S، G2 و> قمم G2. هذا الأسلوب يسمح تقديرات سريعة وسهلة من النسب داخل المناطق المعرفة من قبل المستخدم (الشكل 3E). وضعناها مناطقنا استنادا إلى اختبار مباشرة مع الخلايا كيه سي ذبابة الفاكهة، وصفت لS-المرحلة باستخدام إيثينيل-deoxyUridine (EDU) التأسيس. يستخدم الأسلوب الثاني طرف ثالث نماذج البرمجيات لتقدير توزيع دورة الخلية. كنا ModFitLT (فيرتي برمجيات البيت) البرمجيات على سبيل المثال، في الشكل 3F.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 2 نتائج ممثلة لعينة الجناح اليرقات، معربا عن GFP في النصف الخلفي من الأنسجة، وذلك باستخدام قالب GFP المقدمة. ويتم الحصول على نتائج مماثلة مع نوع الأنسجة نفسها، ونمط التعبير عن طلب تقديم العروض باستخدام طلب تقديم العروض قالب المقدمة (الشكل 3A). النماذج المقدمة والفولتية (الجدول 2) هي مناسبة لتحليل عيون اليرقات (الشكل 3B)، والعقول، والأجنحة، وكذلك عيون العذراء، والعقول (الشكل 3D) والأجنحة. يمكن أيضا إنشاء رسوم بيانية من حجم الخلية النسبية التي تقدمها بالتآمر FSC للسكان في جيتس 5 و 6 (الشكل 3C). قد تحتاج إلى أن يتم ضبط البوابات قليلا بسبب الاختلافات في حجم الخلية لأنسجة أو الاختلافات في كثافة مضان GFP لمختلف الجينات المحورة أو طلب تقديم العروض المختلفة. ويمكن القيام بذلك أثناء تشغيل وحدة تخزين صغيرة من عينة اختبار (50-100 ميكرولتر)، قبل أن يضرب رقم قياسي.

Aالنماذج التالية على المحور الصادي (التهم) لدورة الخلية أو حجم رسوم بيانية الخلية إلى مقياس تلقائي (مقياس المحور ص تعيين إلى تلقائي) في البرنامج أقلم، والنتائج في رسوم بيانية تبين أقصى العالمية لكل السكان. يوضح الشكل 3B-3D ممثل النتائج مع GFP إيجابية وسلبية GFP رسوم بيانية مع المحور الصادي لتعيين الحد الأقصى العالمي لكل السكان. تحديد الحد الأقصى المحور الصادي محددة (مقياس المحور الصادي لتعيين دليل بقيمة يحددها المستخدم)، يسمح للمقارنة بين الأرقام المطلقة بين السكان، والتي يمكن أن تكون مفيدة لمقارنة معدلات الانتشار، ولكن يجعل من الصعب مقارنة دورة الخلية الإلغاء في عندما أعداد السكان GFP إيجابية الخلايا مقابل الخلايا GFP السلبية هي مختلفة إلى حد كبير.

ويبين الشكل 3B الشخصية دورة الخلية عن الخلايا GFP إيجابية وسلبية في عيون اليرقات، معربا عن GFP في الخلفية باستخدام GMR-GAL4، UAS الجينات المحورة-GFP. تراكب يكشف عن الاختلافات في دورة الخلية Phasing من GFP الخلفي معربا عن الخلايا. الشكل 3C يبين التغير النسبي في حجم الخلية بين خلايا GFP الإيجابية والسلبية في B، من خلال التآمر حجم الخلية كما تم قياسها من قبل FSC. الشكل 3D يظهر الملف الشخصي دورة الخلية من العقول العذراء في 46h APF. الخلايا GFP إيجابية هي النسب استنساخ تتبع معربا عن G1-S المنظمين السيكلين D وE2F التي تعطل هدوء وتؤدي إلى دخول S-المرحلة، يشير إليه السهم الأحمر، وأكدته وضع العلامات S-المرحلة مع إدماج EDU (الشكل 3D أقحم). هذا هو على النقيض من عدم معربا عن الخلايا GFP السلبية، التي في هذه المرحلة يتم القبض عادة في G1 (تتبع الأسود، الشكل 3D).

وتستخدم معظم التشكيلات دورة الخلية للحصول على معلومات حول النسب المئوية للسكان في مختلف مراحل دورة الخلية. يمكن تقريب هذا في البرنامج أقلم من خلال خلق مناطق يحددها المستخدم على رسوم بيانية ترسيم G1، S ومراحل G2 (<STRONG> الشكل 3E). البرنامج أقلم تلقائيا بإنشاء جدول الإحصاءات لكل شوط، وإعطاء التهم المطلقة من الخلايا داخل قوائم المناطق والنسب المئوية (الشكل 3F) المعرفة. هذا الأسلوب يعمل بشكل جيد عند مقارنة التغيرات النسبية في التوزيع المرحلة بين عنصر تحكم والسكان التجريبية. بدلا من ذلك، النمذجة البرمجيات يمكن استخدامها لتقدير النسب المئوية في كل مرحلة وكذلك الخلايا أفكارك. كنا ModFitLT (فيرتي برمجيات البيت) في الشكل الجيل الثالث 3G، والتي يمكن مباشرة فتح ملفات البيانات FCS التي يولدها البرنامج أقلم.

الشكل 1
الشكل 1. تشريح والتدريج من أنسجة اليرقات والعذارى. A. تشريح اليرقات (من النمط الجيني ث 1118 معروضة) في 110الموارد البشرية في التنمية تبين الثالث الأمامي قبل (أعلى) وبعد (أسفل) انعكاس. أبيض رأس السهم يشير إلى الجناح تعلق على بشرة اليرقات ورأس السهم الأحمر يشير إلى موضع الدماغ B. أجنحة (أبيض رأس السهم؛ يتم إرفاق مذكرة الجناح في اليسار إلى قرص الساق، وتمزق في الجناح الأيمن في notum الظهرية)، عيون (الصفراء) والدماغ (الحمراء) إزالتها من اليرقات. C. تشريح خادرة تظهر مواقف التخفيضات مع ملقط وضعها في المجال الجوي الأمامي في الرأس (الخطوط المنقطة الحمراء) D. بوبا إزالتها من إهاب قبل الغسيل لإزالة الدهون والأمعاء . المنظفة E. خادرة تظهر عملية رفع أجنحة لإزالة F. تنظيفها خادرة تظهر أجنحة (منقط) وإزالتها جزئيا العين والدماغ المعقدة (السهام الحمراء والصفراء). G. تشريح أجنحة اليرقات وعيون تظهر ماصة للنقل. H. تشريح بعد الإنقسامية العذراء العين والدماغ المعقدة. I. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. ويرد ممثل تحليل دورة الخلية من الأنسجة معربا عن GFP باستخدام Vybrant DyeCycle البنفسج وأقلم. مساحة عمل ممثل، تحتوي على 4 قطع و 2 نقطة رسوم بيانية لعينة الجناح اليرقات معربا عن GFP والسيكلين D في الجناح الخلفي، يقودها engrailED-GAL4 التحوير. A. دوت مؤامرة من حجم الخلية مع البوابة رقم 1 لاستبعاد الحطام وكتل. B. مؤامرة نقطة تميز singlets مع بوابة 2 لاستبعاد الخلايا غير ملوثين، شبه G1 محتوى الحمض النووي (موت الخلايا المبرمج)، وكتل. C. مؤامرة نقطة من GFP مقابل محتوى الحمض النووي. الخلايا GFP السلبية (بوابة 3) وإيجابية (بوابة 4) يمكن أن تكون متميزة و2N ومحتوى الحمض النووي 4N هو واضح على أساس موقف على طول محور س. D. دوت مؤامرة من حجم الخلية كما تم قياسها بواسطة GFP مقابل مبعثر إلى الأمام (FSC) لتوليد جيتس 5 و 6. لاحظ أن الخلايا داخل Gate1 هي الأحمر الملونة للحصول على المساعدة البصرية في تحديد جيتس 5 و 6 لهذه المؤامرة مبعثر. E. الرسم البياني من محتوى الحمض النووي مقابل التهم عن GFP أو طلب تقديم العروض السلبية (السكان لتعيين بوابة 3). F. الرسم البياني من محتوى الحمض النووي مقابل التهم عن GFP أو طلب تقديم العروض الايجابية (السكان لتعيين بوابة 4). يمكن أيضا أن يدرج رسوم بيانية لحجم الخلية اذا شئت. للاطلاع على حجم رسوم بيانية الخلية، والسكان شولد يكون لتعيين جيتس 5 و 6. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل (3)
الشكل (3). رسوم بيانية ممثل تحليل دورة الخلية وحجم الخلية لمراحل النمو المختلفة والأنسجة. (A) وتظهر بيانات الرسم البياني الممثل لمقارنة دورة الخلية في أنواع معينة من الخلايا باستخدام RFP التعبير مع DyeCycle البنفسج (يظهر أقحم مبعثر مؤامرة من RFP مضان مقابل محتوى الحمض النووي ). يحتوي هذا المثال أجنحة اليرقات معربا عن طلب تقديم العروض في الخلفية، يقودها التحوير معكوسة-GAL4. (B) الأغطية من GFP GFP مقابل رسوم بيانية محتوى الحمض النووي السلبية الإيجابية في عيون اليرقات مع التعبير GFP مدفوعا GMR-GAL4 العلاقات العامةomoter 17، والتي تبين معظم الخلايا GFP إيجابية في G1. (C) أصغر حجم الخلية النسبية للGMR مدفوعة GFP + الخلايا بالمقارنة مع GFP-الضوابط، مقاسا مبعثر إلى الأمام باستخدام جيتس 5 و 6. (D) في الدماغ العذراء، GFP إيجابية خلايا تشير للصدمة الحرارة التي يسببها سلالة الحيوانات المستنسخة البحث عن المفقودين عبر FLP المغادرة طريقة 5 يسببها خلال 2 الثانية الطور اليرقي، والإفراط في التعبير عن G1-S الخلية دورة المنظمين السيكلين D وE2F، مما تسبب في دخول الشاذة S-مرحلة (رأس السهم الأحمر) في G1 تالية للتفتل عادة اعتقلت الأنسجة. تم تأكيد دخول غير طبيعي S-مرحلة لوحظ من قبل التدفق الخلوي عن طريق إدماج EDU، التي تصف الخلايا في S-المرحلة (الشكل). (E) مثال من المناطق المستخدمة لتقدير النسب المئوية النسبية في G1، G2 S ومراحل. وقدرت الحدود استنادا إلى S-مرحلة التأسيس من ايدو في خلايا ذبابة الفاكهة في تجربة منفصلة. (F) جدول مثال للإحصاءات التي تم إنشاؤها بواسطة Attunبرنامج البريد تبين النسب المئوية النسبية في المناطق المحددة. (G) مثال من دورة النمذجة خلية من البيانات أقلم ممثل باستخدام ModFitLT. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول الموصوفة هنا يسمح لتحليل دورة الخلية، حجم الخلية النسبي وعدد الخلايا في الأنسجة الحية النسبية ذبابة الفاكهة في مراحل النمو المختلفة. عندما يقترن هذا التحليل مع نوع من الخلايا المحددة التعبير بروتين فلوري أو النسب تتبع، ويمكن الحصول على معلومات مفصلة حول الاستجابات الخلوية لدورة الخلية حصيف أو اضطرابات النمو. وكدليل على المبدأ، ونحن تعطلت هدوء في الطيران الدماغ العذراء بالإعراب عن G1-S المنظمين دورة الخلية في GFP المسمى استنساخ الخلية، مما يؤدي إلى تكرار الحمض النووي الشاذة في مرحلة النمو عندما خلايا الدماغ عادة ما تكون أكثر من 90٪ القبض على G1 (الشكل 3D) .

ولكن هناك بعض القيود الهامة لهذه الخلية أسلوب تحليل دورة الحية. أولا، لا يمكن للمرء التمييز بين الخلايا في مراحل مختلفة من الانقسام باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا. وبالتالي، ينبغي أن تستكمل تحليل الموصوفة هنا مع IMMتلطيخ unofluorescence للعلامة الإنقسامية، مثل Ser10-فسفرته هيستون H3 18 لقياس مؤشر الإنقسامية في أنسجة الفائدة. وبالإضافة إلى ذلك الأسلوب هو موضح هنا لا يمكن التمييز بين الخلايا في G1 مقابل اعتقال G0، لأن كلا من الدول لديها محتوى نفس الحمض النووي. حيث يتم أخذ DyeCycle البنفسج من قبل الخلايا الحية، ويتم تحديد الخلايا في مراحل أفكارك محدودة أيضا في وقت لاحق. وأخيرا، من المهم أن نلاحظ أن قياسات حجم الخلية على أساس مبعثر إلى الأمام هي قياسات حجم الخلية النسبية بدلا من الكمي المطلق للحجم. لتقدير المطلق من حجم الخلية نوصي نهجا الحجمي مثل تلك المستخدمة في مكافحة كولتر (بيكمان كولتر).

عندما يقترن مرحلة دورة الخلية وحجم البيانات مع نسب تتبع لقياس الخلية مضاعفة الوقت، معلومات مفصلة حول دورة الخلية ويمكن حساب النمو، مثل طول G1، G2 S ومراحل ومعدل نمو الخلايا 9،11 في الجسم الحي تقديم معلومات مفصلة عن دورة الخلية وتنظيم النمو لدورة الخلية الكمي، نمو الخلايا والأنسجة النمذجة التشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر عايدة دي لا كروز لتطوير وتدريس البروتوكول الأصلي الذي يستند هذا الإصدار 10. ويدعم عمل في مختبر من قبل المعاهد الوطنية للصحة Buttitta منحة GM086517.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube BD Falcon 352058 5 ml tubes
Attune Acoustic Focusing Cytometer Life Technologies/ Applied Biosystems 4445315 Blue / Violet configuration
Attune Cytometer Software (version 1.2.5) Life Technologies/ Applied Biosystems Free PC only
Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) Life Technologies/ Applied Biosystems 4449754 For daily performance test
Dumont #5 Inox forceps Fine Science Tools 11251-20
Embryo dishes 30 mm x 12mm Electron Microscopy Sciences 70543-30 Glass dissection dishes
Eppendorf Thermomixer Eppendorf 022670051
Trypsin-EDTA Solution (10x) Sigma T4174
Vannas-Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15003-08 Straight 5mm Cutting Edge
Vybrant DyeCycle Violet Stain Life Technologies/ Invitrogen V35003
Table 1. Required reagents and instruments.

Live DNA Stain Solution (10 ml):

1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2)
9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma)
5 μl Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)

10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
FSC SSC BL1 VL1
Threshold (x1000) 100 10 10 10
Voltage (mV) 2950 4250 1800 1150

Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
  2. Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
  3. Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
  4. del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
  5. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  6. McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
  7. Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
  8. Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
  9. Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
  10. de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
  11. Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
  12. Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
  13. Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
  14. Ashburner, M. Drosophila; A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Press. (1989).
  15. Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
  16. On-line Protocols of Protistology Workshop 2005 at The Marine Biological Laboratory [Internet]. , Woods Hole, M.A. Available from: http://starcentral.mbl.edu/eutree_workshop/protistiary/protocols/protocols_pipette.htm (2005).
  17. Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
  18. Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).

Tags

علم الأحياء الجزيئية، العدد 75، علم الأحياء الخلوي وعلم الأحياء التطوري، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، علم الوراثة، التدفق الخلوي، دورة الخلية، النسخ المتماثل الحمض النووي، والتحول، والبيولوجي،
تحليل دورة الخلية الحية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة باستخدام الصوتية أقلم التركيز عداد الكريات وVybrant DyeCycle البنفسج الحمض النووي وصمة عار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flegel, K., Sun, D., Grushko, O.,… More

Flegel, K., Sun, D., Grushko, O., Ma, Y., Buttitta, L. Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain. J. Vis. Exp. (75), e50239, doi:10.3791/50239 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter