Summary
En protokol til cellecyklus analyse af levende
Abstract
Flowcytometri har været meget anvendt til at indhente oplysninger om DNA-indhold i en population af celler, at udlede relative procenttal i forskellige cellecyklusfaser. Denne teknik er blevet udvidet til mitotiske væv modelorganismen Drosophila melanogaster for genetiske studier af cellecyklusregulering in vivo. Når kombineret med celletypespecifik fluorescerende protein udtryk og genetiske manipulationer, kan man få detaljerede oplysninger om effekter på celle nummer, cellestørrelse og cellecyklus indfasning vivo. Men denne levende-celle metode har påberåbt sig brugen af cellen gennemtrængelig Hoechst 33342 DNA-interkalerende farvestof, begrænser brugerne til flowcytometre udstyret med en UV-laser. Vi har ændret denne protokol til at bruge en nyere live-cell DNA farvestof, Vybrant DyeCycle Violet, forenelige med de mere almindelige violette 405nm laser. Protokollen præsenteres her tillader effektiv cellecyklusanalyse kombineret med celletype relativ cellestørrelse og celle nummer information, i en række Drosophila væv. Denne protokol udvider nyttige cellecyklusanalyse teknik for levende Drosophila væv til en lille bordplade analysator, den Attune Akustisk Fokusering cytometer, der kan køres og vedligeholdes på en enkelt laboratorieskala.
Introduction
Flowcytometri kan anvendes til måling af cellelevedygtighed, relativ cellestørrelse, DNA-indhold og fluorescerende protein ekspression i levende cellepopulationer. På grund af replikation af kerne-DNA i løbet af S-fasen, information om DNA-indhold i en population af celler kan anvendes til at udlede relative procentdel i forskellige cellecyklusfaser 1-3. Denne metode er blevet en hjørnesten i cellecyklus analyse modelsystemer fra gær til pattedyr.
Bananfluen Drosophila melanogaster er blevet en glimrende model for genetiske in vivo analyser af cellecyklusregulering. De omfattende genetiske værktøjer til rådighed på fluer mulighed for elegant væv specifikke og tidsmæssigt reguleret manipulationer af cellecyklus regulatorer sammen med in vivo fluorescerende protein-baserede afstamning sporing 4-6. Flowcytometri er blevet brugt til at studere DNA-indholdet i en række Drosophila celletyper, herunder endoreplicating celler og dyrkede mitotiske celler 7,8. Et vigtigt fremskridt for in vivo cellecyklus undersøgelser blev foretaget af de la Cruz og Edgar, med udvikling af en protokol til flowcytometrisk analyse af levende diploide Drosophila imaginal skiver 9,10, en protokol, som er blevet brugt og tilpasset af mange laboratorier. Denne teknik, når kombineret med genetisk in vivo afstamning sporing via inducerbare fluorescerende protein udtryk og væv specifik mærkning, tillader en at indhente oplysninger om genmanipulation effekt på den samlede celle fordoblingstid, cellestørrelse og bestemme præcis timing af cellecyklusfaser in vivo 9 , 11.. Men denne metode hidtil påberåbt brugen af cellen gennemtrængelig Hoechst 33342 DNA-interkalerende farvestof til farvning og kvantificere DNA i levende celler, hvilket har begrænset brugerne til flowcytometre med en UV-laser kan spændende Hoechst farvestof. Disse er generelt kun findes i sorteringsanlæg (dvs. BD FACS Vantage, BD FACSAria) eller dyrt flerfarvet benchtop systemer (dvs. BD LSR), som regel kræver støtte fra de institutionelle flow core faciliteter.
Vi har ændret Hoechst-baseret protokol til at bruge en ny live-cell DNA farvestof fra Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet. Denne farvestof er kompatibel med en violet 405 nm laser, mere almindelig i mindre stationære analysatorer og tilgængelige i den lille selvstændig benchtop analysator, den Attune Acoustic Fokusering Cytometer. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for cellecyklusanalyse der kan kobles med celletype, cellestørrelse, celleantal og afstamning analyse i en række Drosophila væv under forskellige udviklingsstadier ved hjælp DyeCycle Violet og Attune. Denne protokol udvider antallet af cytometre egnede til en sådan analyse med Drosophila væv og giver eksempler på, hvordan denne type af levende cellecyklusanalyse kan modificeres yderligere vævstyper og udviklingsstadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Flyv Husbandry
- Cross flyver af ønskede genotyper i smalle plastik hætteglas med 10 ml gær-glucosemedium 3 eller andre proteinrige medier efter eget valg. Den omfattende Drosophila transgene værktøjer til rådighed for vævsspecifik ekspression og afstamning sporing med in vivo fluorescerende protein-ekspression er beskrevet i detaljer andetsteds 4,5. Overfør forældre til at friske hætteglas dagligt for at opnå serie af 24 timers afkom kollektioner, eller for mere præcise iscenesættelse, embryoner indsamler på agarplader og overføre nyklækkede larve til hætteglas, som beskrevet 10.. For at sikre ensartede vilkår på tværs af eksperimenter og undgå overbelægning, bør det samlede antal F1 afkom i et enkelt hætteglas ikke være mere end 100. Afhængigt genetiske udformning af eksperimentet hætteglas holde en passende inkubator indtil den ønskede udviklingsstadiet.
- Saml forsøgsdyr: du får brug for modne larver på 3. larvestadietinstar (L3) på omkring 110-120 hr for udvikling af larver dissektioner eller hvidt prepupa (WPP) til nøjagtig puppe iscenesættelse. Dramatiske cellecykluskinetikken ændringer, herunder et skifte til en ikke-proliferativ tilstand forekomme på forskellige tidspunkter i løbet af metamorfose 12,13. Derfor med rette iscenesættelse af puppe (inden for 1 time af udvikling) er afgørende for reproducerbare cellecyklusdata under forvandling. WPP svarer til 0 timer efter puppe dannelse (0 hr APF) som vist i figur 1, panel jeg. Saml WPP i en 35 mm petriskål på en foldet Kimwipe våd med 2,5 ml vand for at opretholde en vis fugtighed. Age puppe indtil det ønskede tidspunkt (timer APF) ved passende temperatur. Bemærk, at udviklingen fortsætter 1,2 gange hurtigere ved 29 ° C og 2,2 gange langsommere ved 18 ° C end ved standard 25 ° C 14.
- Heat-chok dyr at aktivere varme-shock flipase (hs-FLP)-induceret rekombination for slægt-tracing kloner hvis nødvendigt 9,11. For varme-chok larve, nedsænkehætteglas i et vandbad (ved 37 ° C) og sikre larver fuldt neddykket. For varme-chok puppe. Forsegle petriskål med Parafilm og fuldt nedsænkes i et vandbad Sørg for at fjerne Parafilm efter varmen-shock, at give tilstrækkelig ilt til gengæld for dyr overlevelse. Varighed af varmechok afhænger aktiviteten af flipase anvendte transgen og antallet af ønskede kloner. Vi rutinemæssigt bruger 7-8 min for at fremkalde "FlipOut" afstamning spore kloner 15 i larver med hs-FLP transgen på den første kromosom og 2-4 min for varme chok pupper i 35 mm skåle, mens hs-FLP transgen på den anden kromosom kræver en 20 min. varmechok at opnå tilsvarende antal kloner.
Satsen for celledeling og timingen af dissektion afgør klon størrelse i hvert væv. Under normale forhold, finder vi, at kloner induceret i larvestadiet fløj med en 20 min varmechok (ved hjælp af hs-FLP transgen på det andet kromosom), og dissecTed 48 timer senere, indeholder ca 20-30 godt adskilte kloner med størrelser fra 10 celler pr klon til to celler pr klon, med et gennemsnit omkring fire celler pr klon. I modsætning hertil dissekeret en 7 min varmechok med samme hs-flp transgen pupper i en petriskål ved 0 hr APF 36 timer senere, udbytter godt adskilte kloner (ca. 15-25) varierer fra et til fire celler med en gennemsnitlig på 2,2 celler pr klon. Sådanne data kan anvendes til at bestemme den gennemsnitlige cellestørrelse fordoblingstiden for vævet under studiet.
2.. Dissection
- Forsigtigt overføre larverne / pupper til en klart glas dissektion skål indeholdende 1X PBS.
- Ved hjælp af et dissektionsmikroskop og rigelig lys Klem forsigtigt en larve af maven med en skarp Inox # 5 Forcep, klippe den forreste tredjedel med mikro-saks, og vend den forreste tredjedel ved at skubbe munden området indad mod den bageste, mens du holder larvestadiet neglebånd stabil (fig. 1A). Fjern forsigtigt opaque fedt kroppen og eventuelle resterende tarmen til at øge synligheden af ønskede væv, såsom fløj, øjet eller hjernen. Dissekere de ønskede væv rent fjerne vinger fra luftrøret og neglebånd med en pincet, øjne fra mund-kroge, eller hjerne fra øjne (figur 1G).
- For dissekere puppe, bruge en Forcep til forsigtigt gribe en puppe af den forreste spids af puppe tilfælde, hvor der er en luftboble, for at undgå at beskadige puppe indeni (figur 1C). Tang eller mikro-saks i den modstående side kan bruges til at hjælpe med at positionere flydende puppe for korrekt fatte. Rent skære gennem den bageste spids på puppe med mikrosakse. Dette tværsnit snit skal foretages i en svag vinkel mod den dorsale del af dyret, for at frigøre det indre tryk uden at tvinge histolyzed fedt i de ønskede væv i brystkassen og hovedet. Skær forsigtigt langs ryggens median, undgå vinger og den forreste eye-hjerne kompleks. Fjern forsigtigt puppe fra puppesag ved at gribe den bageste kant af puppe epidermis og trække det ud af puppe sagen (Figur 1D). Stikke et lille hul i overhuden forreste til øjet-hjerne kompleks med pincet. Ved hjælp af et glas Pasteur pipette med en gummibold, forsigtigt vaske PBS dissektion løsning gennem det delvist dissekeret puppe til at fjerne histolyzed fedt og eventuelle resterende tarm væv. Dette også effektivt smører glaspipette med lipider og proteiner, hvilket reducerer forekomsten af dissekerede væv klæber til det indre af glaspipette senere.
- For at opnå puppe vinger, neglebånd omslutter vingen og fløj selv må pried fra puppe (Figur 1E). Dette kan gøres ved at holde puppe nede ved hovedet med en Forcep mens bruger anden Forcep til enten forstå den mest bageste spids af vingen kutikula og trække ud eller manøvrering af Forcep under vingen nær hængslet før løsner det fra siden af slagtekroppen (Figur 1E). Vingen kan derefter klippe eller rives ved hængslet for at fjerne det fra kroppen og sat i en bunke væk fra slagtekroppe og andet materiale.
- For at opnå puppe øjne eller hjerne, vaske puppe indtil eye-hjerne komplekset bliver løsnede og fri puppe (figur 1F, 1H). Ved hjælp af en Forcep, træk forsigtigt puppe øjet væk fra hjernen og gemme det ønskede væv.
- Må ikke tage længere tid end 45 min at dissekere hver prøve, da resultatet bliver mindre nøjagtig de længere celler er tilbage i PBS efter åbning dyrene.
3.. Tissue Dissociation og DNA Farvning
- Ved hjælp af en smurt Pasteur pipette omhyggeligt dissekerede væv i 0,5 ml Levende DNA Stain Solution i en 5 ml polystyren rør (fig. 1G). Overførsel så lidt PBS som muligt (mindre end 300 ul) i DNA'et farveopløsning, som det vil fortynding af trypsin hæmme vævs dissociering.
- Inkuber rørene med Shaking ved 23 ° C ved 500 rpm (vi bruger en Eppendorf Thermomixer).
- Inkuber i 70 min, derefter vortex forsigtigt i 5 sek ved et medium hastighed (indstilling af 5). Overdreven vortexing vil forårsage cellesprængning form og vragdele, mens under-vortex vil føre til celleklumper. Returnere prøverne for rystning ved 23 ° C ved 500 rpm i yderligere 15 til 20 minutter før vortexbehandling dem en gang mere for 5 sekunder ved hastighed 5.
- For hjerne og puppe øjne ældre end 36hAPF er en modificeret protokol kræves. Opdel væv i DNA-farveopløsning ved 23 ° C ved 500 rpm i 45-60 min i 1,7 ml mikrocentrifugerør. Derefter én efter én manuelt adskille store klumper af væv ved at overdrage dissekere fad sammen med omkring 50 pi DNA-farveopløsning og hurtig pipettering op og ned med en manuelt trukket Pasteur-pipette 16 (omtrent 100-150 um åbning). Overfør hver dissocieret prøve med resten af 0,5 ml af DNA-farveopløsning i et 5 ml rør. Inkuber yderligere 45-30 Min (op til 90 minutter af den samlede inkubationstid) ved 23 ° C med rystning ved 500 omdrejninger indtil klumper ikke længere er synlige.
- Fuldt dissocierede prøver bør have meget få store synlige bidder af væv, selv opmærksom på, at acellulær transparent puppe fløj neglebånd ikke vil dissociere.
4.. Flowcytometri
- Tænd Attune cytometeret og åbn Attune software. Cytometret lasere skal være tændt via startmenuen, og en daglig performance test skal udføres med performance Sporing perler med passende scoringer før hver dag dataopsamling. Fluid niveauer bør være mindst halvt fuld og affald tømmes før forestillingen test. Detaljer for opstart, korrekt kalibrering og drift af Attune kan findes i samordner User Guide ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
- Designe en ny template ved at oprette 4 dot plots og 2 histogrammer i en tom arbejdsområde med de parametre der er angivet i 4.3, eller vælg en tidligere designet skabelon er egnet til eksperimentet, og angive antallet af prøver, der skal indsamles. Vi har givet attune skabeloner (filer i. Få format) for levende Drosophila cellecyklusanalyse med Vybrant DyeCycle Violet og GFP eller RFP udtryk i tillæg I.
- De leverede skabeloner inkluderer fire dot plots og to histogrammer med de parametre, der er angivet i figur 2.. Kanaler til påvisning nævnes: FSC og SSC - frem scatter og sidespredning angiver cellens størrelse og membran kompleksitet VL1 højde (H), bredde (W) og areal (A) - angiver Violet laser excitation af DyeCycle Violet farvning af DNA og BL1 -A - Blå laser kanal 1 Area, indikerer GFP-fluorescens. Den angivne skabelon for RFP analyse er identisk med skabelon for GFP analyse, bortset fra at den bruger den blå laser kanal 3 (BL3-A), som er optimeringzed for RFP detektion.
- De dot plots i skabeloner har gates at begrænse analysen til de ønskede befolkninger og for at begrænse affald og celleklumper fra analyse (figur 2). Gate 1 udelukker snavs og klumper baseret på SSC vs FSC (figur 2A). Gate 2 udelukker ufarvede celler, sub G1 apoptotiske celler og celleklumper baseret på identifikation af singlets (VL1Area vs VL1Width) (figur 2B). Gate 3 er en afledt port, der omfatter celler i porte 1 og 2 og identificerer GFP (eller RFP) negative celler vs DNA indhold baseret på VL1Height (Figur 2C). Gate 4 er en afledt port, der omfatter celler i porte 1 og 2 og identificerer GFP (eller RFP) positive celler vs DNA-indhold (Figur 2C). Dot plots af celle størrelse målt ved GFP (eller RFP) vs fremad scatter (FSC) bruges til at generere Gates 5 og 6 (fig. 2D). De to histogrammer plot DNA-indhold på X-aksen og celletal på Y-axis for de befolkninger defineret af Gate 3 og Gate 4. (Figur 2E og 2F) histogrammer kan også inkluderes til cellestørrelse, hvis det ønskes (ikke vist). For cellestørrelsen histogrammer, bør populationer sættes til Gates 5 og 6, plotte FSC på X-aksen og tæller på y-aksen.
- Indstil optagelsen stopper ved 10.000 GFP eller RFP positive hændelser (dette vil være Gate 4, den afledte Gate of Gate 1, Gate 2 og GFP eller RFP positive gate). Spænder fra 6.000 - 10.000 GFP positive begivenheder har traditionelt været målet for offentliggørelse kvalitetsprofiler 9,11. Vi foreslår at bruge et minimum af 15 vinger eller øjne, der er cirka 50% GFP positivt at opnå tilstrækkelig Gate 4 arrangementer 10 for høj kvalitet profiler. Imidlertid har vi med succes opnået klare data for foreløbig cellecyklusanalyse fra så få som 6 vinger (figur 3A). Indstil købet lydstyrke for 300 ul, vil dette bruger omkring 460 pi af den samlede 0,5 ml prøve. TaBLE 2 viser de relevante tærskel-og spænding indstillinger forudsat i skabelonen for eksempel i figur 2..
- Kør prøver ved standard følsomhed eller høj følsomhed 100 ul / min og optage. Vi finder lidt at ingen forskel i vores analyse med de forskellige følsomhed niveauer. Grundet den akustiske fokusering af celler, kan denne cytometer præcist at måle prøver ved meget høje strømningshastigheder. I modsætning til traditionelle cytometre, finder vi ingen data kompromis ved at erhverve ved hastigheder op til 1.500 hændelser per sekund. De optagede datafiler genereret af Attune software er i. FCS-format, som er kompatibel med de fleste celle-cyklus modellering software.
5.. Dataanalyse
- Histogrammer for cellestørrelse og DNA indhold til GFP (eller RFP) positive og negative populationer kan sammenlignes. De kan manuelt lagdelte ved at kopiere og indsætte ved hjælp af Adobe Photoshop-software. Hvis y-aksen er sat til automatisk, vil Y-aksen skaleres med highest tæller for hver prøve. Overlejre to grafer med Y-aksen indstillet til autoscale skaber en overlejring af histogrammer med akserne fastsat for det globale maksimum for hver population. Dette gør det nemt visuel sammenligning for relative ændringer i cellecyklus indfasning, selv når de samlede celleantal af GFP positive og GFP negative populationer er ikke ækvivalent (eksempel i figur 3B). Alternativt, en brugerdefineret y-aksen (y-aksen manuel indstilling) kan indstilles til en fast værdi for histogrammerne. I dette tilfælde de relative celleantal i to populationer kan sammenlignes. Som Attune bruger en veldefineret volumen af prøve pr run, absolut kvantificering af celler for hver kørsel i hver port med procentdele af den samlede befolkning, kan fås fra statistikken tabellen genereres automatisk under kørslen i arbejdsområdet (eksempel i figur 3F ). Dot plots og histogrammer kan også nemt lagdelt i Attune software, ved blot at trække og slippe forskellige prøver fra the prøvefilen menuen til højre ind på den ønskede grafen for en åben prøve til sammenligning. Men at overlejre delpopulationer fra et enkelt prøve (dvs. GFP positive og GFP negativ inden for den samme prøve), bruger vi Photoshop.
- To metoder kan anvendes til at finde relative procentdel i forskellige faser af cellecyklussen for en population. Tilnærmelsen Metoden er afhængig brugerdefinerede regioner til at afgrænse grænserne for G1, S, G2 og> G2 toppe. Denne metode giver hurtig og nem skøn over procenter inden for de bruger-definerede regioner (figur 3E). Vi sætter vores regioner baseret på en direkte test med Drosophila Kc celler mærket til S-fase ved hjælp Ethynyl-deoxyuridin (Edu) inkorporering. Den anden metode bruger tredjeparts modellering software til estimering af cellecyklus distribution. Vi bruges ModFitLT (Verity Software House) software for eksempel i figur 3F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser repræsentative resultater for en larve fløj prøve, udtrykker GFP i den bageste halvdel af vævet, med den medfølgende GFP skabelon. Lignende resultater opnås med samme vævstype og ekspressionsmønster for RFP hjælp af den medfølgende RFP skabelon (figur 3A). De leverede skabeloner og spændinger (tabel 2) er egnet til analyse af larver øjne (figur 3B), hjerne og vinger, samt puppe øjne, hjerne (figur 3D) og vinger. Histogrammer for relativ cellestørrelse billede ved afbildning FSC for beboerne i Gates 5 og 6 kan også genereres (figur 3C). Gates kan være nødvendigt at justere en smule på grund af forskelle i cellestørrelse for forskellige væv eller forskelle i fluorescensintensitet for forskellige GFP eller RFP transgener. Dette kan gøres, mens du kører en lille test prøvevolumen (50-100 ul), før du slår rekord.
Allowing y-aksen (tællinger) for cellecyklus eller celle størrelse histogrammer til auto-skalaen (y-aksens skala indstillet til automatisk) i Attune software, resulterer i histogrammer viser det globale maksimum for hver population. 3B-3D shows repræsentative resultater med GFP positive og GFP negative histogrammer med y-aksen indstillet til den globale maksimum for hver population. Indstilling af en bestemt y-aksen maksimum (y-aksens skala indstillet til manuel med en brugerdefineret værdi), giver mulighed for sammenligning af absolutte tal mellem befolkninger, som kan være nyttige til sammenligning opformeringsrater, men gør det vanskeligt at sammenligne cellecyklus indfasning populationer, når antallet af GFP positive celler vs GFP-negative celler er meget forskellige.
Figur 3B viser cellecyklus profiler til GFP positive og negative celler i larvernes øjne, der udtrykker GFP i den bageste hjælp af GMR-Gal4, UAS-GFP transgener. Den overlay afslører forskellene i cellecyklus phasing af den bageste GFP-udtrykkende celler. 3c viser den relative ændring i cellestørrelse mellem GFP positive og negative celler i B, ved at plotte cellestørrelse som målt ved FSC. Figur 3D viser en cellecyklus profil fra puppe hjerner hos 46h APF. GFP positive celler er slægt sporing kloner udtrykker G1-S regulatorer Cyklin D og E2F som forstyrrer ubevægelighed og føre til S-fasen post, angivet ved den røde pil og bekræftet af S-fasen mærkning med inkorporering af Edu (figur 3D indsat). Dette er i modsætning til de ikke-udtrykkende GFP-negative celler, som på dette stadium normalt arresteret i G1 (sort spor, figur 3D).
De fleste cellecykluskinetikken profiler anvendes til at indhente oplysninger om procentdele af en befolkning i forskellige cellecyklusfaser. Dette kan tilnærmes i Attune software ved at skabe brugerdefinerede regioner på histogrammer afgrænser G1, S og G2 faser (<strong> Figur 3E). Den samordner softwaren automatisk genererer en statistik tabel for hver kørsel, hvilket giver de absolutte tællinger af celler i brugerdefinerede områder og procenter (Figur 3F). Denne metode fungerer godt, når man sammenligner relative ændringer i fasefordeling mellem en kontrol-og eksperimentel befolkning. Alternativt kan modeling software anvendes til at estimere procentdele i hver fase såvel som apoptotiske celler. Vi brugte ModFitLT (Verity Software House) i figur 3G, som direkte kan åbne. FCS datafiler genereret af Attune software.
Figur 1. Dissektion og iscenesættelse af larver og puppe væv. A. Dissektion af larver (af genotype w 1118 vist) ved 110hr udvikling viser den forreste tredjedel før (øverst) og efter (nederst) inversion. White pilespids angiver en vinge fastgjort til larvernes kutikula og en rød pilespids indikerer positionen af hjernen B. Wings (hvide pilespids, bemærk fløj til venstre er fastgjort til et ben disk, fløj til højre revet på den dorsale notum), øjne (gul) og hjernen (rød) fjernes fra larverne. C. Dissektion af puppe viser positioner af udskæringer med en pincet stillet til luftrummet forreste til hovedet (røde stiplede linjer) D. Pupa fjernet fra kutikula før vask at fjerne fedt og tarmen . E. Renset puppe viser processen løfte vinger til fjernelse F. Renset puppe viser vinger (punkteret), og delvist fjernet eye-hjerne komplekset (røde og gule pilespidser). G. Dissekeret larvernes vinger og øjne viser pipette til overførsel. H. Dissekeret post-mitotiske puppe eye-hjerne kompleks. I. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Repræsentativ cellecyklusanalyse af væv udtrykker GFP ved hjælp Vybrant DyeCycle Violet og Attune. Et repræsentativt arbejdsområde, der indeholder 4 dot plots og 2 histogrammer er vist for en larve fløj prøve udtrykker GFP og cyklin D i den bageste fløj, drevet af en engrailed-Gal4 transgen. A. Dot plot af cellens størrelse med Gate 1 at udelukke snavs og klumper. B. Dot plot at diskriminere herreundertrøjer med Gate 2 at udelukke ufarvede celler, sub-G1 DNA indhold (apoptose), og klumper. C. punktdiagram af GFP vs DNA-indhold. GFP negative (Gate 3) og positive (Gate 4) celler kan skelnes og 2N og 4N DNA-indhold er indlysende baseret på position langs x-aksen. D. Dot plot af cellestørrelse som målt ved GFP vs fremad scatter (FSC) at generere Gates 5 og 6. Bemærk, at celler i Gate1 er farvet rødt for visuel hjælp til at bestemme Gates 5 og 6 til dette scatter plot. E. Histogram af DNA indhold vs tæller for GFP eller RFP negativ (population sat til Gate 3). F. Histogram af DNA indhold vs tæller for GFP eller RFP positive (population sat til Gate 4). Histogrammer kan også inkluderes for cellestørrelse, hvis det ønskes. For celle størrelse histogrammer, skuldre befolkningerd sættes til Gates 5 og 6. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Repræsentative histogrammer for cellecyklus og cellestørrelse analyse for forskellige udviklingsstadier og væv. (A) Repræsentative histogramdata er vist til sammenligning cellecyklus i bestemte celletyper ved hjælp af RFP udtryk med DyeCycle Violet (indsat viser scatter plot af RFP fluorescens vs DNA-indhold ). Dette eksempel indeholder larver vinger udtrykker RFP i den bageste, drevet af en engrailed-Gal4 transgen. (B) Overlejringer af GFP positive vs GFP negative DNA-indhold histogrammer i larvernes øjne med GFP-ekspression drevet af GMR-GAL4 PRomoter 17, vist fleste GFP positive celler i G1. (C) Mindre relativ cellestørrelse på GMR drevet GFP +-celler i forhold til GFP-styringer, målt ved fremadspredning hjælp Gates 5 og 6. (D) I puppe hjerne, GFP positive celler indikerer varme-shock induceret afstamning sporing kloner via FLP-out metode 5 induceret under 2. larve instar, over-udtrykker G1-S cellecyklus regulatorer Cyklin D og E2F, der forårsager afvigende S-fasen post (rød pilespids) i normalt postmitotiske G1 standset væv. De unormale S-fasen post observeret ved flowcytometri blev bekræftet ved inkorporering af Edu, hvilke etiketter celler i S-fase (indsat). (E) Eksempel på regionerne, der anvendes til at estimere relative procenter i G1, S og G2 faser. Grænser blev anslået baseret på S-fasen inkorporering af Edu i Drosophila celler i et særskilt forsøg. (F) Eksempel på statistiktabel genereret af Attune software viser relative procenter i definerede regioner. (G) Eksempel på cellecyklus modellering af repræsentative attune data ved hjælp ModFitLT. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her tillader analyse af cellecyklus, relativ cellestørrelse og relative celleantal i levende Drosophila væv på forskellige udviklingsstadier. Når denne analyse er kombineret med celletypespecifik fluorescerende protein udtryk eller afstamning opsporing, kan detaljerede oplysninger indhentes om cellulære reaktioner på diskret cellecyklus eller vækst forstyrrelser. Som bevis principielt forstyrret vi ubevægelighed i puppe flyve hjernen ved at udtrykke G1-S cellecyklus regulatorer i GFP-mærkede celle-kloner, hvilket fører til afvigende DNA-replikation på et udviklingstrin, hvor hjerneceller normalt over 90% anholdt G1 (Figur 3D) .
Men der er nogle vigtige begrænsninger for denne levende cellecyklus analysemetode. Først kan man ikke skelne mellem celler i de forskellige stadier af mitose anvendelse af protokollen beskrevet her. Således bør analysen her beskrevne suppleres med immunofluorescence farvning for en mitotisk markør, såsom Ser10-phosphoryleret Histon H3 18 at kvantificere mitotisk indeks i væv af interesse. Desuden den her beskrevne fremgangsmåde kan ikke skelne mellem celler i G1 kontra en G0 anholdelse, da begge stater har samme DNA-indhold. Da DyeCycle Violet er taget op af levende celler, identifikation af celler i senere apoptotiske stadier er også begrænset. Endelig er det vigtigt at bemærke, at målinger af cellestørrelse baseret på fremadrettet lysspredning er relative cellestørrelsen målinger snarere end absolut kvantificering af størrelse. For absolut kvantificering af cellestørrelse anbefaler vi en volumetrisk metode som den, der anvendes i en Coulter Counter (Beckman Coulter).
Når celle cyklus fase og størrelse data kombineret med afstamning sporing at måle celle fordoblingstid, detaljerede oplysninger om cellecyklus og vækst kan beregnes, såsom længden af G1, S og G2 faserne og cellevæksthastigheden 9,11 in vivo kan give detaljerede oplysninger om cellecyklus og vækstregulering for kvantitativ cellecyklus, cellevækst og vævsmorfogenese modellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Aida de la Cruz for at udvikle og undervise den oprindelige protokol, som denne version er baseret 10. Arbejdet i Buttitta Lab er støttet af NIH tilskud GM086517.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||
| 12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
||||||||||||||||||
References
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. Drosophila; A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Press. (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- On-line Protocols of Protistology Workshop 2005 at The Marine Biological Laboratory [Internet]. , Woods Hole, M.A. Available from: http://starcentral.mbl.edu/eutree_workshop/protistiary/protocols/protocols_pipette.htm (2005).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
