Summary
En protokoll for cellesyklus analyse av levende
Abstract
Flowcytometri har vært mye brukt for å innhente informasjon om DNA-innhold i en populasjon av celler, til å slutte relative prosenter i ulike cellesyklus faser. Denne teknikken har blitt utvidet til de mitotiske vev i organismen modell Drosophila melanogaster for genetiske studier av regulering av cellecyklus in vivo. Når kombinert med celle-type spesifikke fluorescerende protein uttrykk og genetiske manipulasjoner, kan man få detaljert informasjon om effekter på celle nummer, celle størrelse og cellesyklus innfasing vivo. Men denne live-celle metoden har vært avhengig av bruken av cellen gjennomtrengelig Hoechst 33342 DNA-interkalerende fargestoff, noe som begrenser brukere å flowcytometere utstyrt med en UV-laser. Vi har endret denne protokollen for å bruke en nyere live celle DNA fargestoff, Vybrant DyeCycle Violet, kompatibel med de mer vanlige fiolett 405nm laser. Protokollen presenteres her gir mulighet for effektiv cellesyklus analyse kombinert med celletype, relativ cellestørrelse og celle nummerinformasjon i en rekke Drosophila vev. Denne protokollen utvider nyttig cellesyklus analyse teknikk for live Drosophila vev til en liten bordmodell analysator, Attune Acoustic Fokusering cytometer, som kan kjøres og vedlikeholdes på en enkelt-lab skala.
Introduction
Strømningscytometri kan brukes til måling av cellenes levedyktighet, relativ cellestørrelse, DNA-innhold og fluorescerende protein ekspresjon i levende celle populasjoner. På grunn av replikasjon av kjerne-DNA i løpet av S-fase, vil informasjon om DNA-innhold i en populasjon av celler som kan brukes til å utlede relative prosenter i forskjellige celle faser 1-3. Denne metoden har blitt en hjørnestein i cellesyklus analyse i modellsystemer fra gjær til pattedyr.
Bananflue Drosophila melanogaster har blitt et utmerket modellsystem for genetisk in vivo analyser av cellesyklusregulering. De omfattende genetiske verktøy tilgjengelig i fluer tillate elegant vevet spesifikke og timelig regulert manipulasjoner av cellesyklus regulatorer sammen med in vivo fluorescerende protein-baserte avstamning tracing 4-6. Strømningscytometri er blitt brukt til å studere DNA-innhold i et antall av Drosophila celletyper, inkludert endoreplicating celler og kulturperler mitotiske celler 7,8. Et viktig fremskritt for in vivo cellesyklus studiene ble gjort av de la Cruz og Edgar, med utviklingen av en protokoll for flowcytometrisk analyse av levende diploide Drosophila imaginal plater 9,10, en protokoll som har blitt brukt og tilpasset av mange laboratorier. Denne teknikken, når kombinert med genetisk in vivo avstamning sporing via induserbar fluorescerende protein uttrykk og vev spesifikk merking, gjør det mulig å få informasjon om genmanipulering Effekter på total celle dobling tid, celle størrelse og for å fastslå presis timing av cellesyklus faser in vivo 9 11.. Men denne fremgangsmåte har hittil vært avhengig av bruken av cellen gjennomtrengelig Hoechst 33342 DNA-interkalerende fargestoff for å farge og kvantifisere DNA i levende celler, som har begrenset antall brukere som flowcytometere med en UV-laser i stand til å eksitere Hoechst fargestoff. Disse er vanligvis bare finnes i sorters (dvs. BD FACS Vantage, BD FACSAria) eller dyrt flerfarget stasjonære systemer (dvs. BD LSR), vanligvis krever støtte av institusjonelle flyt kjernefasiliteter.
Vi har endret Hoechst-basert protokoll for å bruke en ny live-cell DNA fargestoff fra Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet. Dette fargestoffet er kompatibel med en fiolett 405 nm laser, mer vanlig i mindre stasjonære analysatorer og tilgjengelig i små selvstendige benchtop analysator, Attune Acoustic Fokusering cytometer. Her presenterer vi en detaljert protokoll for cellesyklus analyse som kan være kombinert med celletype, celle størrelse, mobilnummer og avstamning analyse i en rekke Drosophila vev i ulike stadier av utviklingen ved hjelp DyeCycle Violet og Attune. Denne protokollen utvider antallet cytometere egnet for slik analyse med Drosophila vev og gir eksempler på hvordan en slik levende celle syklus analyse kan modifiseres for ytterligere vevstyper og utviklingsstadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Fly Husbandry
- Cross flyr av ønskede genotyper i trange plast ampuller med 10 ml gjær-Glucose Medium 3 eller andre protein-rik media av ditt valg. De omfattende Drosophila transgene verktøy tilgjengelig for vev spesifikke uttrykk og avstamning sporing med in vivo fluorescerende protein uttrykk er beskrevet i detalj andre steder 4,5. Overfør foreldre til ferske ampuller daglig for å få serie på 24 hr avkom samlinger, eller for mer presis iscenesettelse, samle embryo på agarplater og overføre nyklekte larven til hetteglass som beskrevet 10. For å sikre ensartede betingelser tvers eksperimenter og unngå overbelægning, bør det totale antall F1-avkommet i en enkelt ampulle være ikke mer enn 100. Avhengig av genetisk design av forsøket, holde ampullene i et passende inkubator inntil den ønskede utviklingsstadiet.
- Samle forsøksdyr: Du trenger modne larver på 3. larveinstar (L3) på ca 110-120 hr utvikling for larve disseksjoner eller hvit prepupa (WPP) for nøyaktig pupal iscenesettelse. Dramatiske cellesyklus endringer, herunder en bryter til en ikke-proliferativ tilstand skje på forskjellige tidspunkter i løpet av metamorfose 12,13. Derfor korrekt oppsetning av puppe (innen en time av utvikling) er avgjørende for reproduserbare cellesyklus data under metamorfose. Wpp tilsvarer 0 time etter puppe formasjon (0 hr APF) som vist i Figur 1, Panel I. Utlevering wpp i en 35 mm petriskål på en brettet Kimwipe våt med 2,5 ml vann for å opprettholde noen fuktighet. Alder puppe til ønsket scene (timer APF) ved riktig temperatur. Legg merke til at utviklingen følger 1,2 ganger raskere ved 29 ° C og 2,2 ganger mer langsomt ved 18 ° C enn ved standard 25 ° C 14.
- Heat-shock dyr å aktivere varme-sjokk flipase (hs-flp)-indusert rekombinasjon for avstamning-tracing kloner hvis nødvendig 9,11. For varmen-sjokk av larve, fordypeampullene i et vannbad (satt til 37 ° C) og sikre larver er fullstendig neddykket. For varmen-sjokk av puppe, forsegle petriskål med Parafilm og fullt senk den i vannbad. Pass på å fjerne Parafilm etter varmen-sjokk, for å gi tilstrekkelig oksygen bytte for dyr å overleve. Varighet av varme-sjokk, avhenger av aktiviteten av den flipase transgenet brukt og antallet ønskede kloner. Vi rutinemessig bruker 7-8 min for å fremkalle "FlipOut" avstamning sporing kloner 15 i larver med hs-flp transgene på første kromosom og 2-4 min for varme sjokk av puppe i 35 mm-retter, mens hs-flp transgene på det andre kromosom krever en 20 min. varme sjokk å få tilsvarende antall kloner.
Frekvensen av celledeling og timing av disseksjon bestemmer klonestørrelse i hvert vev. Under normale forhold, finner vi at kloner indusert i larve fløy med en 20 min heat shock (ved hjelp av hs-flp transgene på andre kromosom) og dissected 48 timer senere, inneholder ca 20-30 godt atskilt kloner med størrelser fra 10 celler per klone til to celler per klone, med et gjennomsnitt rundt fire celler per klone. I kontrast, en 7 min varme-sjokk med den samme hs-FLP transgenet av puppe i en petriskål ved 0 hr APF dissekert 36 hr senere blir utbytter godt atskilt klonene (ca. 15-25) fra én til fire celler med en gjennomsnittlig på 2,2 celler per klone. Slike data kan benyttes for å bestemme gjennomsnittlig cellestørrelse doblingstiden for vevet under studien.
2. Disseksjon
- Forsiktig overføre larver / puppe til et klart glass disseksjon tallerken med 1X PBS.
- Ved hjelp av en dissekere mikroskop og rikelig med lys, forsiktig tak en larve av magen med en skarp Inox # 5 forcep, kutt anterior tredje med mikro-saks, og invertere fremre tredjedel ved å skyve munnen området innover mot bakre mens du holder larve skjellaget jevn (figur 1A). Fjern forsiktig opaque fett kroppen og eventuelle gjenværende gut å øke synligheten av ønskede vev, for eksempel vinge, øye eller hjerne. Dissekere de ønskede vev; rent fjerne vinger fra luftrøret og skjellaget med tang, øyne fra munn-kroker, eller hjernen fra øynene (figur 1G).
- For dissekere puppe, bruke en forcep å forsiktig gripe en puppe av fremre spissen av pupal tilfelle hvor det er en luftboble, for å unngå skade på puppe inne (figur 1C). Tang eller mikro-saks i den motsatte hånden kan brukes til å plassere flytende puppe for riktig fatte. Ren skjære gjennom den bakre enden av puppe med mikro-saks. Dette tverrsnitt slipingen skal gjøres i en liten vinkel mot den dorsale delen av dyret, for å frigjøre det indre trykk uten å tvinge histolyzed fett til de ønskede vev i thorax og hodet. Skjær forsiktig langs dorsal median, unngå vingene og fremre øye-hjerne komplekse. Fjern forsiktig puppe fra pupalsaken ved å ta tak i bakre kant av pupal epidermis og trekke den ut av pupal saken (figur 1D). Dytte et lite hull i skjellaget anterior til eye-hjerne kompleks med tang. Ved hjelp av et glass Pasteur pipette med en gummi pære, forsiktig vaske PBS disseksjon løsning gjennom delvis dissekert puppe å fjerne histolyzed fett og eventuelle gjenværende gut vev. Dette også gir effektiv smøring av glasset pipette med lipider og proteiner, som reduserer forekomsten av dissekerte vev fester seg til det indre av glasset pipette senere.
- For å få pupal vinger, skjellaget omslutter kantene, og vingen selv må være pried fra puppe (figur 1E). Dette kan gjøres ved å holde puppe ned av hodet med en forcep mens du bruker et annet forcep å enten ta tak i mest posterior tuppen av vingen skjellaget og trekke ut eller manøvrering av forcep under vingen nær hengslene før løsner den fra siden av kadaveret (Figur 1E). Vingen kan deretter kuttes eller rives ved hengslene for å fjerne det fra kroppen og satt i en haug vekk fra skrotter og annet materiale.
- For å få pupal øyne eller hjerne, vaske puppe til eye-hjerne kompleks blir dislodged og fri fra puppe (figur 1F, 1H). Ved hjelp av en forcep dra forsiktig i pupal øyet vekk fra hjernen og lagre ønsket vev.
- Ikke ta lenger enn 45 min å dissekere hver prøve, så resultatene blir mindre nøyaktig de lengre cellene er igjen i PBS etter åpning dyrene.
3. Tissue Dissosiasjon og DNA Farging
- Ved hjelp av en Pasteur-pipette smurt forsiktig overfører de dissekerte vev inn i 0.5 ml av levende DNA farge som løsning i et 5 ml rør polystyren (figur 1G). Overføring så lite PBS som mulig (mindre enn 300 pl) inn i DNA farge løsningen, vil som fortynning av trypsin hemme vev dissosiasjon.
- Inkuber rør med Shaking ved 23 ° C ved 500 rpm (vi bruker en Eppendorf Thermomixer).
- Inkuber i 70 min, deretter vortex forsiktig i 5 sek på en middels hastighet (innstilling av fem). Overdreven virvling vil føre til celleoppbrytning og form rusk, mens under-virvling vil føre til celle klumper. Returner prøvene til risting ved 23 ° C ved 500 rpm i ytterligere 15 til 20 min før virvle dem enda en gang i 5 sekunder ved hastighet 5..
- For hjerner og pupal øyne eldre enn 36hAPF, er en modifisert protokoll nødvendig. Dissosiere vev i DNA farge løsning ved 23 ° C ved 500 opm i 45-60 min i 1,7 ml mikrosentrifugerør. Deretter en etter en manuelt distansere store biter av vev ved å overføre til dissekere tallerken sammen med ca 50 ul DNA Stain Solution og rask pipettering opp og ned med et manuelt trukket Pasteur pipette 16 (ca 100-150 mikrometer åpning). Overfør hver dissosiert prøven med resten av 0,5 ml av DNA farge-løsning i et 5 ml rør. Inkuber ytterligere 45-30 Min (opp til 90 minutter av total inkubasjonstid) ved 23 ° C med rysting ved 500 rpm inntil klumpene er ikke lenger synlige.
- Fullt dissosierte prøvene bør ha svært få store synlige biter av vev, men merk at acellular gjennomsiktig pupal fløyen hårstråene ikke vil distansere.
4. Flowcytometrisystemer
- Slå på Attune cytometeret og åpne Attune programvare. Cytometeret lasere bør slås på via oppstartsmenyen, og en daglig ytelse bør utføres med ytelse sporing Perler med tilstrekkelige score før hver dag med datainnsamling. Væskenivåer bør være minst halvfull og avfall tømmes før ytelsestest. Detaljer for oppstart, riktig kalibrering og drift av Attune kan bli funnet i Attune brukerhåndboken ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
- Designe en ny template ved å opprette fire prikkplotter og to histogrammer i et tomt arbeidsområde med parametrene angitt i 4.3, eller velg en tidligere utformet mal som passer for forsøket, og angir antall prøver som skal samles inn. Vi har gitt Attune maler (filer i. Få format) for live Drosophila cellesyklus analyse med Vybrant DyeCycle Violet og GFP eller RFP uttrykk i Vedlegg I.
- Malene som tilbys inkluderer fire prikkplotter og to histogrammer med parametrene angitt i figur 2. Kanaler for deteksjon inkluderer: FSC og SSC - forward scatter og side scatter indikerer celle størrelse og membran kompleksitet, VL1 høyde (H), bredde (W) og areal (A) - indikerer Violet laser eksitasjon av DyeCycle Violet flekker på DNA, og BL1 -A - Blå laser Channel 1-området, noe som indikerer GFP fluorescens. Den angitte mal for RFP analyse er identisk med malen for GFP-analyse, bortsett fra at den bruker den blå laser kanal 3 (BL3-A), som er optimaliseringzed for RFP deteksjon.
- De prikkplotter i malene har porter for å begrense analysen til de ønskede bestander og for å begrense avfall og celle klumper fra analyse (Figur 2). Gate 1 utelukker rusk og klumper basert på SSC versus FSC (figur 2A). Gate 2 utelukker unstained celler, sub G1 apoptotiske celler og celle klumper basert på identifisering av singleter (VL1Area vs VL1Width) (figur 2B). Gate 3 er en avledet gate, som omfatter celler innenfor portene 1 og 2, og identifiserer GFP (eller RFP) negative celler vs DNA innhold basert på VL1Height (figur 2C). Gate 4 er et avledet port, som omfatter celler i løpet av portene 1 og 2, og identifiserer GFP (eller RFP) positive celler vs DNA-innhold (figur 2C). Prikkplotter av celle størrelse målt ved GFP (eller RFP) vs forover scatter (FSC) brukes til å generere Gates 5 og 6 (figur 2D). De to histogrammer tomten DNA innhold på X-aksen og celletall på Y-axis for populasjonene som er definert av Gate 3 og Gate 4. (Fig. 2E og 2F) histogrammer kan også inkluderes for cellestørrelse hvis ønskelig (ikke vist). For celle størrelse histogrammer, bør populasjoner settes til Gates 5 og 6, plotting FSC på X-aksen og teller på y-aksen.
- Sett innspillingen å stoppe på 10.000 GFP eller RFP positive hendelser (dette vil være 4 Gate, den avledede Gate of Gate 1, 2 Gate og GFP eller RFP positive gate). Spenner fra 6000 - 10000 GFP positive hendelser har tradisjonelt vært målet for publisering kvalitet profiler 9,11. Vi foreslår at du bruker et minimum av 15 vinger eller øyne, som er ca 50% GFP positive til å innhente tilstrekkelig Gate 4 events 10 for høy kvalitet profiler. Imidlertid har vi lykkes fått klare data for foreløpig cellesyklus analyse fra så få som seks vinger (figur 3A). Sett oppkjøpet volum for 300 ul, vil dette bruker ca 460 mL av den totale 0,5 ml prøve. TaBLE 2 viser de aktuelle terskelverdier og spenning innstillinger gitt i malen for eksempel i Figur 2.
- Kjør prøver ved standard følsomhet eller høy følsomhet 100 mL / min og posten. Vi finner liten eller ingen forskjell i vår analyse med de ulike følsomhet nivåer. På grunn av den akustiske fokusering av cellene, kan dette cytometer måle prøver ved meget høye strømningshastigheter. I motsetning til tradisjonelle cytometere, finner vi ingen data kompromiss ved å kjøpe i hastigheter opptil 1500 hendelser per sekund. De registrerte data filer generert av Attune programvaren er in. Fcs format som er kompatibelt med de fleste cellesyklus modellering programvare.
5. Data Analysis
- Histogrammer av celle størrelse og DNA-innhold for GFP (eller RFP) positive og negative populasjoner kan sammenlignes. De kan manuelt lagvis ved å kopiere og lime inn ved hjelp av Adobe Photoshop programvare. Hvis y-aksen er satt til automatisk, vil Y-aksen skalere med highest teller for hver prøve. Overliggende to grafer med Y-aksen satt til autoscale skaper en overlapping av histogrammer med aksene er satt for den globale maksimale for hver populasjon. Dette gir enkel visuell sammenligning for relative endringer i cellesyklus utfasing, selv når totale antall celler av GFP positive og GFP negative populasjoner er ikke tilsvarende (f.eks i Figur 3B). Alternativt en tilpasset y-aksen (y-aksen manuelle alternativet) kan settes til en fast verdi for histogrammene. I dette tilfelle de relative celleantall i to populasjoner kan sammenlignes. Som Attune bruker en viss mengde prøve per løp, absolutt kvantifisering av celler for hvert løp, i hvert gate med prosenter av den totale befolkningen, kan fås fra statistikken tabellen genereres automatisk under kjøring i arbeidsområdet (eksempel i Figur 3F ). Prikkplotter og histogrammer kan også lett lagvis i Attune programvare, ved å dra og slippe forskjellige prøver fra the sample fil-menyen til høyre inn på ønsket graf av en åpen prøve for sammenligning. Men å overlappe subpopulasjoner fra en enkelt prøve (dvs. GFP positive og GFP negative innenfor den samme prøven), bruker vi Photoshop.
- To metoder kan anvendes for å finne relative prosenter i forskjellige faser av celle-syklusen for en populasjon. Tilnærming metoden er avhengig av brukerdefinerte regioner for å avgrense grensene for G1, S, G2 og> G2 topper. Denne metoden gir raske og enkle beregninger av prosenter innenfor de brukerdefinerte regioner (Figur 3E). Vi setter våre regioner basert på en direkte test med Drosophila Kc celler, merket for S-fase ved hjelp Ethynyl-deoxyuridine (Edu) innlemmelse. Den andre metoden bruker tredjeparts modellering programvare for estimering av cellesyklus distribusjon. Vi brukte ModFitLT (Verity programvarehus) programvare for eksempel i Figur 3F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser representative resultater for en larve vinge prøve, uttrykker GFP i bakre halvdel av vev, ved hjelp av den medfølgende GFP mal. Lignende resultater oppnås med de samme vevstype og uttrykk mønster for RFP med den medfølgende RFP malen (figur 3A). Den medfølgende malene og spenninger (tabell 2) er egnet for analyse av larver øyne (Figur 3B), hjerner og vinger, samt pupal øyne, hjerne (figur 3D) og vinger. Histogrammer av relativ celle størrelse levert av plotting FSC for bestander i Gates 5 og 6 kan også genereres (Figur 3C). Gates må kanskje justeres litt på grunn av forskjeller i celle størrelse for ulike vev eller forskjeller i fluorescens intensitet for ulike GFP eller RFP transgener. Dette kan gjøres mens du kjører en liten test volum av prøven (50-100 ul), før du treffer posten.
Enllowing y-aksen (teller) for cellesyklus eller celle størrelse histogrammer til auto-skala (y-aksen skala satt til automatisk) i Attune programvare, resulterer i histogrammer som viser den globale maksimale for hver populasjon. Figur 3B-3D-show representative resultater med GFP positive og GFP negative histogrammer med y-aksen satt til den globale maksimale for hver populasjon. Sette en bestemt y-aksen maksimum (y-aksen skala satt til manuell med en brukerdefinert verdi), mulighet for å sammenligne absolutte tall mellom populasjoner, som kan være nyttig for å sammenligne spredning priser, men gjør det vanskelig å sammenligne cellesyklus innfasing populasjoner når antall GFP positive celler vs GFP negative celler er helt annerledes.
Figur 3B viser cellesyklus profiler for GFP positive og negative celler i larve øyne, uttrykker GFP i bakre bruker GMR-Gal4, UAS-GFP transgener. Overlegget avslører forskjellene i cellesyklus phasing av bakre GFP uttrykke celler. Figur 3C viser den relative endringen i celle størrelse mellom GFP positive og negative celler i B, ved å plotte celle størrelse målt ved FSC. Figur 3D viser en celle syklus profil fra pupal hjerner på 46h APF. GFP positive celler er avstamning tracing kloner uttrykker G1-S regulatorer Cyclin D og E2F som forstyrrer quiescence og føre til S-fase inngang, angitt ved den røde pilen og bekreftet av S-fase merking med inkorporering av Edu (Figur 3D innfelt). Dette er i motsetning til de ikke-negative celler som uttrykker GFP, som på dette tidspunkt er normalt arrestert i G1 (svart kurve, figur 3D).
De fleste cellesyklus profiler brukes for å innhente informasjon om prosenter av en befolkning i ulike cellesyklus faser. Dette kan tilnærmes i Attune programvare ved å opprette brukerdefinerte områder på histogrammer opptegning G1, S og G2 faser (<strong> Figur 3E). Den Attune programvare genererer automatisk en statistikk tabell for hvert løp, noe som gir de absolutte tellinger av celler i brukerdefinerte regioner og prosenter (figur 3F). Denne metoden fungerer godt når man sammenligner relative endringer i fase fordeling mellom en kontroll og eksperimentell befolkningen. Alternativt kan modelleringsprogrammet brukes til å anslå prosenter i hver fase, samt apoptotiske celler. Vi brukte ModFitLT (Verity programvarehus) i figur 3G, noe som kan åpne den. FCS datafiler generert av Attune programvare.
Figur 1. Disseksjon og iscenesettelse av larver og puppe-vev. A. Disseksjon av larver (av genotype w 1118 vist) på 110hr utvikling viser fremre tredjedel før (øverst) og etter (nederst) inversjon. Hvitt pilespiss indikerer en vinge festet til larvenes hårstråene og en rød pilhode angir posisjonen til hjernen B. vinger (hvit pilspiss; oppmerksom på venstre vinge er festet til et ben plate, blir vingen på høyre revet i dorsal notum), øyne (gul) og hjernen (rød) fjernet fra larver. C. Disseksjon av puppe viser posisjonene til kutt med tang plassert på luftrommet anterior til hodet (røde stiplede linjer) D. puppe fjernet fra cuticle før vask for å fjerne fett og gut . E. Renset puppe viser prosessen med å løfte vingene for fjerning F. Renset puppe viser vinger (prikket) og delvis fjernet eye-hjerne kompleks (røde og gule pilspisser). G. dissekert larve vinger og øyne som viser pipette for overføring. H. dissekert post-mitotic pupal eye-hjerne-kompleks. I. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Representant cellesyklus analyse av vev som uttrykker GFP hjelp Vybrant DyeCycle Violet og Attune. Et representativt arbeidsområde, som inneholder fire prikkplotter og to histogrammer er vist for en larve vinge prøve uttrykker GFP og Cyclin D i bakre vinge, drevet av en engrailed-Gal4 transgen. A. Dot tomt på celle størrelse med Gate 1 for å utelukke rusk og klumper. B. Dot komplott for å diskriminere singleter med Gate 2 for å utelukke unstained celler, sub-G1 DNA innhold (apoptose), og klumper. C. prikkplott av GFP vs DNA innhold. GFP negative (Gate 3) og positive (Gate 4) celler kan skilles og 2N og 4N DNA innhold er tydelig basert på posisjon langs x-aksen. D. Dot tomt på celle størrelse målt ved GFP vs forover scatter (FSC) å generere portene 5 og 6. Legg merke til at cellene i Gate1 er farget rød for visuell hjelp til å fastsette Gates fem og seks for denne spredningsdiagram. E. Histogram av DNA innhold vs teller GFP eller RFP negative (befolkning satt til Gate 3). F. Histogram av DNA innhold vs teller GFP eller RFP positive (befolkning satt til Gate 4). Histogrammer kan også inkluderes for celle størrelse hvis ønskelig. For celle størrelse histogrammer, populasjoner should settes til Gates fem og seks. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Representative histogrammer av cellesyklus og celle størrelse analyse for ulike utviklingsstadier og vev. (A) Representant histogram data er vist for å sammenligne cellesyklus i bestemte celletyper med RFP uttrykk med DyeCycle Violet (innfelt viser spredningsdiagram av RFP fluorescens vs DNA innhold ). Dette eksemplet inneholder larver vinger uttrykker RFP i bakre, drevet av en engrailed-Gal4 transgen. (B) Overlegg av GFP positive vs GFP negative DNA innhold histogrammer i larve øynene med GFP uttrykk drevet av GMR-Gal4 promoter 17, som viser de fleste GFP positive celler i G1. (C) mindre relativ cellestørrelse GMR drevet GFP + celler sammenlignet med GFP-kontroller, som målt ved fremover diffusjon ved hjelp av portene 5 og 6. (D) I pupal hjerne, GFP positiv celler indikerer varme-sjokk indusert avstamning tracing kloner via flp-ut metoden 5 indusert under 2. larve instar, over-uttrykke G1-S cellesyklus regulatorer Cyclin D og E2F, forårsaker avvikende S-fase inngang (rød pilspiss) i normalt postmitotic G1 arrestert vev. Den unormale S-fase oppføring observert av flowcytometri ble bekreftet ved inkorporering av Edu, som betegner celler i S-fase (innfelt). (E) Eksempel på regionene brukes til å anslå relative prosenter i G1, S og G2 faser. Grensene ble estimert basert på S-fase inkorporering av Edu i Drosophila celler i et eget eksperiment. (F) Eksempel på statistikk tabellen generert av Attune-programvare viser relative prosenter i regionene definert. (G) Eksempel på cellesyklus modellering av representative Attune data ved hjelp ModFitLT. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet her gir mulighet for analyse av cellesyklus, relativ celle størrelse og relativ celle nummer i levende Drosophila vev på ulike utviklingsstadier. Når denne analysen er kombinert med celle-type spesifikke fluorescerende protein uttrykk eller avstamning sporer kan detaljert informasjon fås om cellulære responser til diskret cellesyklus eller vekst forstyrrelsene. Som bevis på prinsippet forstyrret vi quiescence i pupal fly hjernen ved å uttrykke G1-S cellesyklus regulatorer i GFP merkede celle kloner, som fører til avvikende DNA replikering på et utviklingsstadium når hjernecellene er normalt over 90% G1 arrestert (Figur 3D) .
Men det er noen viktige begrensninger i denne levende celle syklus analysemetode. Først, kan man ikke skille mellom celler i de ulike stadier av mitose ved hjelp av protokollen beskrevet her. Således bør den analysen som er beskrevet her bli supplert med immunofluorescence farging for en mitotisk markør, for eksempel Ser10-fosforylert Histone H3 18 å kvantifisere mitotisk indeks i vev av interesse. I tillegg er metoden som er beskrevet her, kan ikke skjelne mellom celler i et G1 g. G0 arrest, som begge stater har den samme DNA-innhold. Siden DyeCycle Violet er tatt opp av levende celler, identifisering av celler i senere apoptotic stadier er også begrenset. Til slutt er det viktig å merke seg at målinger av celle størrelse basert på forward scatter er relative celle størrelse målinger snarere enn absolutt kvantifisering av størrelse. For absolutt kvantifisering av cellestørrelse anbefales en volumetrisk metode som den som brukes i en Coulter Counter (Beckman Coulter).
Når cellesyklus fase og størrelse data er kombinert med avstamning sporer for å måle celle fordoblingstid, detaljert informasjon om cellesyklusen og vekst kan beregnes, slik som lengden av G1, S og G2-fasene og celle vekstrate 9,11 in vivo kan gi detaljert informasjon om cellesyklus og vekst regulering for kvantitativ cellesyklus, cellevekst og vev morphogenesis modellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Aida de la Cruz for å utvikle og undervise den opprinnelige protokollen som denne versjonen er basert ti. Arbeid i Buttitta Lab er støttet av NIH stipend GM086517.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||
| 12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
||||||||||||||||||
References
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. Drosophila; A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Press. (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- On-line Protocols of Protistology Workshop 2005 at The Marine Biological Laboratory [Internet]. , Woods Hole, M.A. Available from: http://starcentral.mbl.edu/eutree_workshop/protistiary/protocols/protocols_pipette.htm (2005).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
