Yüksek verim SHAPE kullanarak RNA İkincil Yapısı Tahmin
Summary
Astar uzantısı (SHAPE) tarafından analiz yüksek verimli seçici 2 'hidroksil asilleme tek nükleotid çözünürlükte binlerce nükleotid birkaç yüz ile RNA'lar yapılarını belirlemek için bir teknoloji sondalama yeni kimyasal, ters transkripsiyon, kapiler elektroforez ve ikincil yapı tahmini yazılımı kullanır.
Abstract
Biyolojik süreçlerinde RNA işlevini anlama RNA yapısı ayrıntılı bir bilgi gerektirir. Bu sonuna doğru, dublaj metodoloji, veya SHAPE "astar uzantısı ile analiz yüksek verimli seçici 2 'hidroksil asilleme", tek nükleotid çözünürlükte RNA ikincil yapı tahmini sağlar. Bu yaklaşım, tercihen sulu çözelti içinde RNA tek sarmallı ya da esnek bölgeler asil ile kimyasal tarama maddeler kullanır. Bir kimyasal modifikasyon Yer modifiye RNA ters transkripsiyon ile tespit edilir ve bu reaksiyonun ürünleri, otomatik kapiler elektroforez (CE) ile fraksiyone edilmiştir. Ters transkriptaz ŞEKİL reaktifleri ile değiştirilmiş olanlar RNA nükleotid duraklar yana Sonuçta elde edilen cDNA kütüphanesi dolaylı olarak tek kapandı RNA bağlamında mahsur bu ribonükleotidler eşler. ShapeFinder yazılımı kullanarak, otomatik CE tarafından üretilen electropherograms işlenmiş ve nu dönüştürülürcleotide tepkime tablolar kendilerini RNAStructure (v5.3) tahmini algoritması kullanılan sözde enerji kısıtlamaları dönüştürülür. Siliko RNA ikincil yapı tahmininde ile sondalama SHAPE birleştirerek elde edilen iki boyutlu RNA yapıları tek başına her iki yöntemi kullanarak elde edilen yapılara göre çok daha doğru olduğu tespit edilmiştir.
Introduction
Yapıştırma, çeviri, virüs çoğaltma ve kanser düzenlenmesinde yer alan katalitik olmayan kodlama RNA'lar işlevlerini anlamak için, RNA yapısının detaylı bilgi 1,2 gereklidir. Ne yazık ki, RNA katlama doğru tahmin müthiş bir meydan okuma sunuyor. Klasik tarama maddeler muzdarip toksisite, eksik nükleotid kapsamı ve / veya deney başına 100-150 nükleotidleri ile sınırlı verim gibi birçok dezavantajları. Çıplak ikincil yapı tahmini algoritmaları benzer, dezavantajlı etkili enerjik benzer yapıları arasında ayırt etmek için kendi yetersizlik kaynaklanan yanlışlıklar nedeniyle vardır. Özellikle büyük RNA'lar, aynı zamanda X-ışını kristalografisi ve şekilsel esnekliği ve bu teknikler için gerekli son derece saf bir numune büyük miktarlarda nedeniyle spektroskopisi (NMR) nükleer manyetik rezonans olarak 3D yapı belirleme yöntemleri genellikle alınamamaktadır.
High verimli SHAPE tek nükleotid çözünürlükte büyük RNA'lar yapıları sondalama için etkili, basit bir yaklaşım sağlayarak bu sorunların çoğu çözer. Ayrıca, şekil için kullanılan reaktiflere işlemek için güvenli, kolay ve reaktifler tarama çoğu diğer kimyasal aksine, dört ribonükleotidler ile reaksiyona girerler. Bu reaktifler de mümkün bağlamda in vivo (lar) 3 kendi RNA'lar araştırmak için yapım, hücre membranları içine nüfuz edebilir. Başlangıçta hafta laboratuar 4 geliştirilen ŞEKLİ RNA'lar, geniş bir yelpazede ~ 9 kb HIV-1 RNA genomunun 5 tam ikincil yapısının belirlenmesi; en önemli örneği analiz etmek için kullanılmıştır. Şeklini kullanarak Diğer başarıları bulaşıcı viroidler 6, insan uzun kodlayıcı olmayan RNA'lar 7, maya ribozomlar 8 ve 9 riboswitches hem de tespit etmek virionu ile ilişkili HIV-1 RNA 3 protein bağlanma yerleri yapılarının aydınlatılması içerir. WhSHAPE protokol Ile orijinal ve yüksek verimli varyasyonlar başka bir yerde 10-12 yayınlanmıştır, Bu çalışmada floresan oligonükleotidler, Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer kullanarak yüksek verimli SHAPE RNA ikincil yapı tayini ayrıntılı bir açıklamasını sağlar ve SHAPEfinder ve RNAStructure (v5.3) yazılımı. Daha önce yayınlanmamış teknik ayrıntı ve sorun giderme tavsiye de dahildir.
SHAPE varyasyonları
ŞEKİL ve varyasyonları özü seçici modifikasyonu sitelerinin hantal katılma ürünleri üreten, 2'-hidroksi (2'-OH) riboz grupları açilleme elektrofilik anhidritler, sulu çözelti içinde RNA maruz kalmasıdır. Baz eşleştirilmiş veya mimari Yapım ise bu kimyasal reaksiyon, tek iplikli nükleotidler bu reaktif ile elektrofilik saldırı için elverişli konformasyonlar benimsemeye daha yatkındır gibi, yerel RNA yapısal dinamikleri sorgulayan bir araç olarak hizmet vermektedirained nükleotid daha az ya da 10 reaktif değillerdir. Adukt formasyonu Yer modifiye RNA ("(+)" primer uzatma reaksiyonu) ile ilgili belirli bir site hibridize floresan veya radyoaktif primerlerle başlatarak, ters transkripsiyon ile tespit edilir. Ters transkriptaz (RT) asile ribonucleotides hareket başarısız olduğunda, cDNA ürünleri bir havuz olan uzunlukları değişiklik siteleri denk üretilir. Bir kontrol, "(-)" astar uzantısı reaktif maruz olmamıştır RNA kullanarak reaksiyon da çok yapılır bu yapı, non-spesifik RNA zincir kırıkları, vb olabilir RNA nedeniyle DNA sentezi (yani "durur") erken sona ermesi. kimyasal modifikasyonu ile üretilen duraklatma ayırt edilebilir. Son olarak, aynı primerlerle başlatılması iki-dideoksi sekanslama reaksiyonları RNA primer dizisi elektroforezi ile aşağıdaki reaktif nükleotid ilişkilendirmek için marker olarak kullanılmaktadır.
SHAP orijinal uygulamasında(-) Ve iki dizi reaksiyonlar E aynı 32 P-uç-etiketli astar, (+) için kullanılmaktadır. Bu reaksiyonların ürünleri bir% 5-8 poliakrilamid jel levha bitişik kuyu içine yüklenir ve poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE, Şekil 1), denatüre edici ile fraksiyone edilmiştir. Geleneksel şekli ile üretilen jel görüntüleri kantitatif analiz SAFA, yarı-otomatik bir ayak izi analiz yazılımı 13 kullanılarak da gerçekleştirilebilir.
Buna karşılık, yüksek verimli SHAPE floresan etiketli astar ve otomatik kapiller elektroforez kullanır. Spesifik olarak, inceleme altındaki RNA ortak bir dizi ancak farklı 5 'floresan etiketler olarak sentezlenebilir ya da satın alınması gerekir olan dört DNA primerleri kümesi her bir bölgesi için. Bu farklı-etiketli oligonükleotidler asal iki SHAPE reaksiyonlar ve iki sıralama reaksiyonları, toplanmış ve fraksiyone / otomatik kapiller elektroforez (CE) tarafından tespiti yapılan ürünler için hizmet vermektedir. NereyeEAS RNA 100-150 nt reaktivite profili temel yaklaşımı kullanarak, dört reaksiyonlar bir dizi elde edilebilir, yüksek verimli bir şekli, bir tek numune toplanmış 3 300-600 nt çözünürlüğü sağlar. Gibi pek çok 96 gibi, örnekler 12 ardışık CE çalışır (Şekil 2) boyunca fraksiyonasyon için hazırlanmış olabilir iken, aynı zamanda, fraksiyonlara ayrılmış olabilir üste reaksiyonlar 8 setleri için. Ayrıca, CEQ ve diğer genetik analiz çıkan verilerin işlenmesi ve analiz etmek için geliştirilen SHAPEfinder yazılım, daha otomatik ve SAFA 13 veya diğer jel-analiz paketleri çok daha az kullanıcı müdahalesi gerektirir.
Daha gelişmiş yüksek verimli yöntemleri son zamanlarda elde etmek için teknikler sıralama yeni nesil ile birlikte yapı-belirli enzimler yerine alkilleme reaktifleri kullanmak PARS (RNA yapısı paralel analiz) 14 ve Frag-Seq (fragman-dizi) 15, olarak ortaya çıkmıştır BİLİŞİMRNA yapısı hakkında n. Bu tekniklerin çekiciliğini rağmen, sondalama nükleaz doğasında birçok sınırlamalar hala 16 kalır. Bu sorunlar, yeni nesil sıralama geleneksel SHAPE'e gerçekleştirilen edilene benzer bir şekilde kimyasal modifikasyonu ve RNA'ların ters transkripsiyon öncesinde ŞEKLİ dizi analizleri (Şekil-Seq) 17 protokol bölgesi atlatılabilir. Bu yöntemler RNA yapı tayini geleceği temsil olsa da, bu yeni nesil sıralama çok pahalı ve birçok laboratuvarlara kullanılamaz durumda olduğunu hatırlamak önemlidir.
SHAPE Veri Analizi
Genetik analiz üretilen veri taşıma zaman indeksi karşı çizilen kılcal detektörü akan numunenin floresan yoğunluğu (ler) in bir electropherogram şeklinde sunulmuştur. Bu grafik, dört flüoresan kanala tekabül eden üst üste izleri formunda alırin farklı bir florofor tespit etmek için kullanılır ve tek tek her bir iz cDNA'sı ya da sekanslama ürünlerine karşılık gelen tepe oluşur burada. Elektroferogram veri bir sekme ile sınırlandırılmış metin dosyası olarak genetik analiz ihraç ve ShapeFinder dönüşüm ve analiz yazılımı 18 alınır.
ShapeFinder ilk geçiş süreleri ve yüksek miktarlar doğru sırasıyla reaksiyon ürünleri, kimlikleri ve miktarları yansıtmasını sağlamak için veri matematiksel dönüşümleri bir dizi gerçekleştirmek için kullanılır. Peaks sonra uyumlu ve entegre ve sonuçlar birincil RNA dizisi ile birlikte tablo vardır. RNA ilgili bölümü için bir "reaktivite profili" (+) nükleotid Her RNA ile ilişkili değerleri kontrol değerleri çıkarılarak, ve aşağıda tarif edildiği gibi verileri normalize edilmesiyle elde edilir. Bu profil normalize tepkime val dönüştürür (v5.3) yazılım 19,20, RNAstructure alınırRNA ikincil yapı katlama algoritması dahil edilmiştir sözde enerji kısıtlamaları içine ues. Bu şekilde algoritma sondalama ve katlama kimyasal birleştiren önemli ölçüde tek başına 12,21 ya yöntemine göre yapı tahmini doğruluğunu artırır. RNAstructure çıktısı (v5.3) en düşük enerji görüntüleri içeren RNA ikincil yapılar metin nokta-dirsek gösterimde SHAPE reaktivite profil (ler), hem de aynı yapılarla renk kodlu. İkincisi daha sonra bu Varna 22 ve PseudoViewer 23 olarak RNA'nın ikincil yapının grafik ekran için özel yazılım ihraç edilebilir.
Şekil 1. SHAPE 4,10 ile RNA yapısı belirlenmesi Akış Şeması. (A) RNA mAy biyolojik numunelerin veya in vitro transkripsiyonu sonucunda elde edilebilir. (B) kaynağına bağlı olarak, RNA, katlanmış ya da başka şekilde işlem ve ŞEKİL reaktifi ile modifiye edilir. (C) ters transkripsiyon floresan veya radyoaktif olarak etiketlenmiş primerler kullanılarak. (D) cDNA ürünlerdir ya kılcal veya levha jel tabanlı elektroforezi ile fraksiyonlara ayrılmış. (E) Parça analizi. (F) RNA yapısı tahmini. büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. CE tabanlı SHAPE yüksek verimli karakter hızlı çoklu RNA'lar analizi ve / veya aynı RNA oluşan parçalara ayır sağlar. (A) </stRong> bir RNA 300-600 nt bölümler (renk yeşil, mavi ve kırmızı kodlu) (B) RNA bölümleri floresan astar farklı ayarlar (siyah ok) ile bağımsız tanınacak olan (C) takımları ayrılabilir nasıl temsil reaksiyonları ~ 3 kb RNA1 için tam koruma sağlar, sırasıyla kuyu A1, B1, C1, vb, içine toplanmış ve yüklenir. RNA'lar 2, 3, 4, vb reaksiyon ürünleri benzer ardışık elektroforetik çalıştırır fraksiyon için hazırlanabilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada yüksek verimli SHAPE için ayrıntılı bir protokol, her boyutta RNA'lar için tek nükleotid çözünürlük sekonder yapı tayini sağlayan bir teknik size sunmak. Ayrıca, ikincil yapı tahmini algoritmaları ile deneysel SHAPE veri bağlantısı tek başına ya yöntemiyle mümkün olandan daha yüksek doğruluk derecesi ile RNA 2D modellerin üretimi kolaylaştırır. Floresan-etiketli primerlerin ve otomatik CE kombinasyonu tek bir deneyde uzun RNA sekanslarının, çözünürlük kolaylaştırmak gel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, KJ Purzycka, JW Rausch ve SFJ Le Grice Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, ABD İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| REAGENTS | |||
| N-methylisatoic anhydride (NMIA) | Life technologies | M25 | Dissolve in anhydrous DMSO |
| 1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7) | see ref. 22 | ||
| Superscript III Reverse Transcriptase | Life technologies | 18080044 | 10,000 units |
| Thermo sequenase cycle sequencing kit | Affymetrix | 78500 | |
| Materials provided by the user | |||
| RNA of interest | 6 pmol per reaction (the limit of detection will be determined by the instrument) | ||
| Sets of four 5′ labeled primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 and WellRed D1/Licor IR800) | Primers are complementary to the RNA and are used in reverse transcription and sequencing reactions. The listed fluorophores are optimal for the Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers may be purchased or synthesized in house. | ||
| DNA template | DNA is used for sequencing reactions, and must contain the sequence of the RNA being studied – including any 3’terminal extension, if present. Where applicable, it is often convenient to use the RNA transcription template. | ||
| Buffers | |||
| 10x RNA renaturation buffer | 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA | ||
| 5X RNA folding buffer | 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (This buffer might be changed depending on the case (e.g. pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor) | ||
| 2.5X RT mix | 4 μl 5X buffer, 1 μl 100 mM DTT, 1.5 μl water,1 μl 10 mM dNTPs, 0.5 μl SuperScript III. Note that the 5X buffer and 100 mM DTT are provided with purchase of SuperScript III (Invitrogen). | ||
| GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter) | Attention: Avoid multiple freeze-thaw cycles | ||
| EQUIPMENT | |||
| Capillary electrophoresis | Beckman | CEQ8000 | |
| Thermocycler | varies |
References
- Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).
- Moore, P. B., Steitz, T. A. The roles of RNA in the synthesis of protein. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003780 (2011).
- Wilkinson, K. A., et al. High-throughput SHAPE analysis reveals structures in HIV-1 genomic RNA strongly conserved across distinct biological states. Plos Biol. 6, 883-899 (2008).
- Merino, E. J., Wilkinson, K. A., Coughlan, J. L., Weeks, K. M. RNA structure analysis at single nucleotide resolution by selective 2 ‘-hydroxyl acylation and primer extension (SHAPE). J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005).
- Watts, J. M., et al. Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA genome. Nature. 460, 711-716 (2009).
- Xu, W., Bolduc, F., Hong, N., Perreault, J. P. The use of a combination of computer-assisted structure prediction and SHAPE probing to elucidate the secondary structures of five viroids. Mol. Plant Pathol. , (2012).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Structural architecture of the human long non-coding RNA, steroid receptor RNA activator. Nucleic Acids Res. 40, 5034-5051 (2012).
- Leshin, J. A., Heselpoth, R., Belew, A. T., Dinman, J. High-throughput structural analysis of yeast ribosomes using hSHAPE. RNA Biol. 8, 478-487 (2011).
- Souliere, M. F., Haller, A., Rieder, R., Micura, R. A powerful approach for the selection of 2-aminopurine substitution sites to investigate RNA folding. J. Am. Chem. Soc. 133, 16161-16167 (2011).
- Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2 ‘-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nat. Protoc. 1, 1610-1616 (2006).
- McGinnis, J. L., Duncan, C. D. S., Weeks, K. M. High-Throughput Shape and Hydroxyl Radical Analysis of Rna Structure and Ribonucleoprotein Assembly. Method Enzymol. 468, 67-89 (2009).
- Low, J. T., Weeks, K. M. SHAPE-directed RNA secondary structure prediction. Methods. 52, 150-158 (2010).
- Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. S. A. F. A. Semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments. Rna-a Publication of the Rna Society. 11, 344-354 (2005).
- Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467, 103-107 (2010).
- Underwood, J. G., et al. FragSeq: transcriptome-wide RNA structure probing using high-throughput sequencing. Nat. Methods. 7, 995-1001 (2010).
- Mauger, D. M., Weeks, K. M. Toward global RNA structure analysis. Nat. Biotechnol. 28, 1178-1179 (2010).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11063-11068 (2011).
- Vasa, S. M., Guex, N., Wilkinson, K. A., Weeks, K. M., Giddings, M. C. ShapeFinder: a software system for high-throughput quantitative analysis of nucleic acid reactivity information resolved by capillary electrophoresis. RNA. 14, 1979-1990 (2008).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
- Pang, P. S., Elazar, M., Pham, E. A., Glenn, J. S. Simplified RNA secondary structure mapping by automation of SHAPE data analysis. Nucleic Acids Res. 39, e151 (2011).
- Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 97-102 (2009).
- Darty, K., Denise, A., Ponty, Y. VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure. Bioinformatics. 25, 1974-1975 (2009).
- Byun, Y., Han, K. PseudoViewer: web application and web service for visualizing RNA pseudoknots and secondary structures. Nucleic Acids Res. 34, 416-422 (2006).
- Brown, T., Brown, D. J. S., Eckstein, F. . Oligonucleotides and Analogues – A Practical Approach. , 20 (1990).
- Legiewicz, M., et al. The RNA Transport Element of the Murine musD Retrotransposon Requires Long-range Intramolecular Interactions for Function. J. Biol. Chem. 285, 42097-42104 (2010).
- Steen, K., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Syntheis of 1-methyl-8-nitroisatoic anhydride (1M7). Protocol Exchange. , (2011).
- Mortimer, S. A., Weeks, K. M. A fast-acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry. J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007).
- Mitra, S., Shcherbakova, I. V., Altman, R. B., Brenowitz, M., Laederach, A. High-throughput single-nucleotide structural mapping by capillary automated footprinting analysis. Nucleic Acids Res. 36, e63 (2008).
- Giddings, M. C., Severin, J., Westphall, M., Wu, J., Smith, L. M. A software system for data analysis in automated DNA sequencing. Genome Res. 8, 644-665 (1998).
- Aviran, S., et al. Modeling and automation of sequencing-based characterization of RNA structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11069-11074 (2011).
