Comprimento dos telômeros e da telomerase atividade; Um Yin e Yang da senescência celular

Summary

Um método preciso, curto, sofisticado e barato é descrito que avalia o comprimento dos telômeros em múltiplos tecidos e espécies usando qRT-PCR. Além disso, vamos descrever um teste simples para avaliar a atividade da telomerase como um teste backbone complementar para o comprimento dos telômeros.

Abstract

Os telómeros são sequências de ADN de repetição na ponta extremidades dos cromossomas, que são diferentes em comprimento e em seres humanos pode atingir um comprimento de 15000 pares de bases. Os telómeros serve como um mecanismo de atrito bioprotector cromossoma em cada divisão celular. A um certo comprimento, os telómeros tornar demasiado curto para permitir a replicação, um processo que pode conduzir à instabilidade do cromossoma ou morte celular. O comprimento do telômero é regulada por dois mecanismos opostos: atrito e alongamento. Atrito ocorre à medida que cada célula se divide. Em contraste, o alongamento é modulado em parte pela enzima telomerase, que adiciona as sequências de repetição para as extremidades dos cromossomas. Desta forma, a telomerase pudesse inverter um mecanismo de envelhecimento e rejuvenesce viabilidade celular. Estes são elementos cruciais na manutenção da vida celular e são utilizadas para avaliar o envelhecimento celular. Neste artigo vamos descrever um método pouco preciso, sofisticado e barato para avaliar o comprimento dos telômeros em tecido múltiplas e espécies. Este método tira vantagem de dois elementos chave, a repetição em tandem da sequência do telómero e da sensibilidade do qRT-PCR para detectar números de cópias diferenciais de amostras testadas. Além disso, vamos descrever um teste simples para avaliar a atividade da telomerase como um teste backbone complementar para o comprimento dos telômeros.

Introduction

Os telômeros são repetitivas de DNA hexâmeros (TTAGGG) seqüências encontradas nas extremidades dos cromossomos. Em cada replicação celular, essas extremidades dos cromossomas são encurtados. Se eles se tornam muito curtos, os cromossomos podem sofrer fusão telômero finais, recombinação aberrante e degradação. Assim manutenção comprimento dos telômeros suficiente desempenha um papel importante na estabilidade dos cromossomas e proteção da célula ^38. Manutenção comprimento do telômero também é crucial para genes encontrados perto das extremidades dos cromossomos, uma vez que a replicação do DNA não pode continuar até o fim de cromossomos ^1-2. Consequentemente, a prevenção do encurtamento dos telômeros pode melhorar a estabilidade da pilha.

Numerosos estudos têm avaliado que o comprimento dos telómeros está correlacionada com a longevidade de um organismo e estado de doença, tais como cancro, em ^{3-4, 5} a diabetes, doença cardiovascular e ^6,7. Além disso, os telómeros encurtados têm sido associados com o stress excessivo ouestilo de vida saudável ^8, talvez, promovendo o envelhecimento prematuro e morte celular ^9. Por outro lado, alguns estudos demonstraram que não há diferença significativa entre o comprimento dos telômeros e longevidade e doenças relacionadas com idade ^{39, 40, 41.}

Um dos mecanismos inatos da célula de proteção de encurtamento dos telômeros está ativando sua própria enzima telomerase transcriptase reversa (TERC). Esta enzima e sua subunidade, o RNA da telomerase (TERC), um RNA não-codificante, utilizar o telómero como um molde para adicionar repete telomere para as extremidades do cromossoma ^10. Embora a atividade telomerase está ausente de vários tipos de células e outros mecanismos estão envolvidos na manutenção do comprimento dos telômeros, o aumento da atividade da telomerase está correlacionada com o aumento do comprimento dos telômeros. Activação de telomerase foi estabelecido como um dos mecanismos pelos quais as células respondem a danos e stress e senescência prematura e evitar a morte. Por exemplo, mais de telomeres foram demonstrados em uma população de judeus Ashkenazi com uma excepcional duração ^11, as mutações em TERC ou terc foram mostrados para contribuir para a doença fatal, ^12, e regulação epigenética da telomerase foi demonstrado ter um efeito sobre a doença relacionada com a idade ^13. Desde a sua descoberta, o comprimento dos telómeros foi proposto como um biomarcador para o estado de saúde em diversos modelos animais, bem como em seres humanos, mas estes primeiros estudos foram difíceis de replicar amplamente porque o método utilizado foi tedioso, longo e dispendioso. Em 2002 e mais sintonizado em 2009, Cawthon propôs e demonstrou um novo protocolo preciso, rápido e simples PCR baseado para avaliar o comprimento dos telômeros e investigar o seu papel em vários aspectos da biologia celular, envelhecimento e doença ^19.

Escolher o método de medição dos telômeros correto para um estudo é essencial. Atualmente, existem vários métodos usados ​​para medir o comprimento dos telômeros, cada um com o seu própriovantagens e desvantagens. Tradicionalmente, o comprimento dos telómeros é medido utilizando a análise de Southern Blot de fragmentos de restrição terminal (TRF), que envolve: a. digerir o ADN com enzimas de restrição que não cortam no repete telomere, a fim de obter TRFs, b. Southern Blot destas TRFs é feito através da determinação do comprimento TRF significativo utilizando uma sonda telomérica ^{14, 37.} Embora este método seja altamente preciso, com um pequeno coeficiente de variação é uma medida directa, e pode ser vantajoso para a medição da distribuição do comprimento, a análise TRF é caro, trabalhoso e requer, pelo menos, 3 ug de DNA. Este método também é insensível à telómeros curtos e determinação comprimento pode ser confundida pelo DNA subtelomérica, que pode ser detectado pela sonda devido a (TTAGGG) n como sequências que contêm ^{15, 42.}

Outro método de alta precisão para medir o comprimento dos telômeros é Única dos telômeros Alongamento Análise Comprimento (STELA), um singlmolécula e método baseado em PCR que requer apenas uma pequena quantidade de DNA. Neste método, os iniciadores são feitas para reconhecer o G-rico saliência na extremidade dos cromossomas e para se ligar a uma sequência de subtelomérica única sobre um cromossoma, o qual amplifica o telómero de um cromossoma específico. A amplificação resultante é, então, visualizado por Southern Blot. Este método tem a vantagem de ser altamente precisa e é capaz de detectar os telómeros outlier curtas ^16. Infelizmente, uma vez que nem todos os cromossomos têm extremidades G-ricos e uma seqüência subtelomérica utilizável, o comprimento dos telômeros só pode ser medido em cromossomos específicos e essas medidas podem não representar o comprimento de todos os telômeros nas células ^15.

Outro método que tem sido praticado é o uso do ácido nucleico de péptido (ANP) sondas para detectar comprimento dos telómeros. Florescimento quantitativa em hibridização in situ (Q-FISH) nos permite visualizar os telômeros durante a metáfase, onde a ruaaining dos telómeros com uma sonda de PNA, em proporção ao seu tamanho permite a comparação dos telómeros entre cromossomas específicos. Embora este método também pode ser usado para células na interfase, aqui o comprimento dos telómeros para cromossomas diferentes não pode ser detectado, o que introduz uma limitação quando medição do comprimento dos telómeros nas células senescentes, ou raramente divisória ^17. FISH fluxo em vez disso usa citometria de fluxo e é atualmente o método mais sensível para medir o comprimento dos telômeros das células do sangue na clínica, mas exige técnicos altamente qualificados ^18.

Actualmente, o método padrão para a medição do comprimento dos telómeros, em média, o nosso laboratório tem a vantagem de precisão, sensibilidade e facilidade de PCR quantitativa em tempo real. Este método só foi possível por medição do comprimento dos telómeros pelo desenvolvimento de novos iniciadores que evitam a síntese de dímeros de iniciadores produtos derivados, que teriam sido produzidas comoensaio tandard devido à natureza repetitiva de telômeros. Para este ensaio, a medição do comprimento de telómeros é representado pela razão T / S, o número de cópias de repetição telomérica para o número de genes de cópia única. Uma vez que existe uma relação proporcional directa entre o comprimento dos telómeros e o número de iniciadores marcados telomere ligação ao ADN durante os estágios iniciais de PCR, a razão T / S é directamente proporcional ao comprimento dos telómeros. A razão T / S é medida pela comparação da diferença de Ct, o número do ciclo fraccionada em que a amostra é de fluorescência acumulada cruza um limite que é de vários desvios padrão acima da linha de base de fluorescência, entre as amostras, com os primários telomere iniciadores e SCG ^19. Este método tem sido criticado por sua medida indireta do comprimento dos telômeros, o que pode levar a medições imprecisas, por exemplo, no caso da duplicação de cromossomos ou cópia variações número ^15. Além disso, a comparação entre os estudos é muitas vezes difficult, mas padrão oligômeros foram desenvolvidos para medir o comprimento dos telômeros absoluta ^20. Este método foi melhorado por promoveu Cawthon, utilizando um ensaio multiplex qPCR monocromática. Neste ensaio, o PCR foi executado a temperaturas mais baixas para os primeiros ciclos para evitar a ligação de dímeros de iniciadores e o gene telómeros e de controlo foram analisados ​​no mesmo tubo de PCR, para evitar uma maior erro. As medidas de comprimento dos telômeros resultantes fortemente correlacionada com o comprimento dos telômeros medidos por análise de Southern blot dos TRFs e teve maior precisão ^{15, 19, 36.} No momento, qRT-PCR é o único método prático disponível para testar amostras de grande tamanho e requer apenas uma pequena quantidade de ADN para levar a cabo. Uma parte crucial do método tem medidas de controle de qualidade, de modo que quando ele é feito corretamente, este método pode fornecer informações comparativas valiosas sobre o comprimento dos telômeros. Adicionalmente, este método foi adaptado para utilização além de leucócitos para medircomprimento dos telómeros numa variedade de diferentes tecidos ^42.

Além disso, a fim de melhor entender a biologia por trás manutenção comprimento dos telómeros e as interacções entre os dois efeitos opostos (isto é, telómeros de encurtamento durante a replicação e alongamento pela enzima telomerase), que acompanha o comprimento dos telómeros método com um ensaio adicional, que mede a actividade da telomerase.

Para este efeito, foi utilizado um protocolo de amplificação repetição telomérica, um ensaio in vitro. Resumidamente, foram lisadas preservada, células enzimaticamente activas repetições teloméricas sintetizados sobre um substrato de oligonucleótido usando a telomerase, e os produtos foram amplificadas usando PCR, na presença de SYBR Green. Os resultados foram então analisadas por comparação da amostra de controlo e os valores de limiar Ct. Desde telomerase é uma enzima sensível ao calor, um calor adicional controle tratado é executado ao lado de cada amostra ^21.

<p class="Jove_content"> Ao medir o comprimento dos telômeros pode fornecer informações valiosas sobre o possível papel do comprimento dos telômeros na fisiopatologia do envelhecimento e da doença, o comprimento dos telômeros não é uma propriedade estática e é necessária mais informação para entender a função dos telômeros. Estudos a atividade da telomerase pode adicionar informações sobre os mecanismos de regulação comprimento dos telômeros. Por exemplo, a activação controlada de telomerase pode manter o comprimento do telómero e da proliferação celular, mas a activação descontrolada da telomerase pode resultar em cancro. Estes dois métodos de baixo custo para a frente e em linha reta combinados forneceu-nos não só com a evidência mais forte no sentido de uma relação entre o comprimento dos telômeros e da estabilidade celular, mas também uma visão mais aprofundada os possíveis mecanismos de encurtamento dos telômeros e recuperação. Com estes métodos esperamos elucidar a resposta da célula ao envelhecimento e vários estados de proliferação celular com o objetivo final de uma melhor compreensão do mechanis Centralms de biologia celular.

Protocol

1. Comprimento dos telômeros Protocolo n º 19 O isolamento do DNA Pode ser utilizado A maioria dos métodos de isolamento do ADN. Nosso Lab prefere Qiagen DNeasy Kit (# 69506) para as fontes de sangue. Dependendo da fonte de ADN, tais como fontes de bucais ou outro, um método de isolamento diferentes podem ser utilizados. Iniciadores: Todos os iniciadores são diluídas até uma concentração de caldo d…

Representative Results

Um exemplo de um comprimento de ensaio de qRT-PCR dos telómeros é mostrado na Figura 1. No painel superior esquerdo, amostras marcadas em vermelho e verde representam a localização dos sujeitos testados na placa de 96 poços. No painel superior direito, a curva de amplificação é demonstrada. Cada indivíduo é testado por dois ensaios (telômero e único gene Copy), que é feito em triplicata. Devido a diferentes números de cópias de ADN produzidos nos dois ensaios de indivíduos seleccionados,…

Discussion

Comprimento Telômero proporciona um marcador celular única para o estudo da célula esforçado e envelhecimento e oferece perspectivas sobre os mecanismos de envelhecimento. Desde o seu papel no envelhecimento primeira tinha sido sugerido, uma infinidade de estudos têm sido feitos relativos comprimento dos telômeros de idade, longevidade, doenças relacionadas com a idade, câncer e estresse. Durante décadas, o padrão ouro de medidas de comprimento dos telômeros foi a análise de fragmentos de restrição do term…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516