端粒长度和端粒酶活性;阴阳细胞衰老

Summary

描述一个准确的，短的，复杂的和廉价的方法，使用定量RT-PCR在多个组织和物种评估端粒长度。此外，我们将介绍一个简单的检测，以评估作为一个互补的骨干测试端粒长度的端粒酶活性。

Abstract

端粒重复DNA序列结束的尖端处的染色体长度和人类中是多种多样的，可以达到15000个碱基对的长度。端粒在每次细胞分裂染色体磨损作为一个生物保护机制。在一定的长度，端粒变得太短，允许复制，这个过程可能导致染色体不稳定或细胞死亡。端粒长度是受两个对立的机制：磨损和断裂伸长率。每个细胞分裂发生磨损。与此相反，伸长率部分调制的端粒酶，这增加了重复序列的染色体的端部。以这种方式，端粒酶可能扭转老化机制，活化细胞活力。这些都是重要的元素，在维持细胞的生命和用于评估细胞的衰老。在这篇稿件中，我们将介绍一个准确的，短的，复杂的和便宜的方法来评估在多个组织的端粒长度s和物种。这种方法需要利用两个关键要素，串联重复端粒序列和定量RT-PCR检测的灵敏度差分被测样品的拷贝数。此外，我们将介绍一个简单的检测，以评估作为一个互补的骨干测试端粒长度的端粒酶活性。

Introduction

端粒DNA重复六聚体（TTAGGG）序列，发现在染色体的末端。在每个细胞的复制，这些染色体末端缩短。如果它们变得太短，可以进行染色体端粒末端融合，异常重组和降解。因此，足够维持端粒长度染色体稳定性和细胞保护^38中起着重要的作用。基因附近发现染色体的末端端粒长度的保养也是至关重要的，因为DNA复制不能继续^1-2染色体的尽头。因此，防止端粒缩短，可以提高电池的稳定性。

许多研究已证实，端粒长度与一个有机体的长寿和疾病状态，如^3-4在癌症，糖尿病和心血管疾病的^6,7。此外，端粒缩短过度紧张或已与不健康的生活方式，可能是通过促 ​​进细胞过早衰老和死亡^9。另一方面，一些研究发现，端粒长度与寿命和年龄有关的疾病^{39，40，41，}有没有显着区别。

端粒缩短的保护细胞的先天机制之一是通过激活其自身端粒酶逆转录酶（TERT）。这种酶和其亚单位，端粒酶RNA（TERC），非编码RNA作为模板使用的端粒添加端粒重复染色体的端部^10。虽然端粒酶活性缺席参与维持端粒长度的几种类型的细胞和其他机制，增加端粒酶活性与端粒长度的增加。端粒酶激活已建立细胞损伤和强调，避免过早衰老和死亡的机制之一。例如，较长的特表现在德系犹太人的人口与例外寿命¹¹ lomeres，TERC基因的突变或叔已被证明有助于致命的疾病^12，和表观遗传调控端粒酶已被证明有效果与年龄有关的疾病^13。自从其发现，端粒长度已经提出在各种动物模型以及人类健康状况的生物标志物，但这些早期的研究采用的方法是难以广泛复制，因为繁琐，漫长而昂贵的。在2002年和2009年进一步调整，Cawthon提出并实现了一个新的，准确，快速，简单的基于PCR的协议，以评估进一步探讨端粒长度和细胞生物学的各个方面，它的作用在衰老和疾病^19。

选择正确的一项研究端粒测量方法是必不可少的。目前，有多种方法，用于测量端粒长度，每个都有其自己优点和缺点。传统上，端粒长度的测量采用Southern blot分析末端限制性片段（成绩单），其中包括：一。不切端粒重复序列，以获得成绩单，B的限制性内切酶消化的DNA。这些末端限制性片段的Southern印迹法是通过用端粒探针^14，37确定的平均TRF长度。尽管此方法是高度精确的，一个小的变动系数，是直接的措施，可以是有利的，用于测量长度分布，TRF分析是昂贵的，劳动密集型的，至少需要3微克DNA。此方法也是不敏感的短的端粒长度和决心，可以混淆的端粒DNA，它可以检测探头，由于（TTAGGG）N像序列含有^15，42。

另一种高度准确的方法测量端粒长度的端粒伸长长度分析（STELA），以单Ë分子PCR为基础的方法，只需要少量的DNA。在该方法中，引物被认识到的富含G的悬在染色体末端的一条染色体上，放大一个特定的染色体的端粒要绑定到一个独特的亚端粒序列。然后，将得到的扩增是可视化的Southern印迹法。此方法的优点是高度精确的，能够检测潜在的离群值端粒^16。不幸的是，因为并不是所有的染色体两端有富G和可用的端粒序列，端粒长度只能在特定的染色体上测量，这些测量可能无法代表所有端 ​​粒的长度在小区^15。

已经实行的另一种方法是使用肽核酸（PNA）探针检测端粒长度。 原位杂交定量花期 （Q-FISH）技术使我们能够想象的端粒在中期，ST癌宁端粒与PNA探针在它们的大小比例，允许特定染色体的端粒之间的比较。虽然这种方法也可以用于细胞间期，在这里针对不同的染色体的端粒长度不能被检测到，它引入了一个在衰老或不常除以单元¹⁷测量时，端粒长度的限制。流鱼，而不是使用流式细胞仪，是目前最敏感的方法，在临床上用于测量血细胞的端粒长度，但需要高度熟练的技术人员^18。

目前，在我们的实验室中测量平均端粒长度的标准方法充分利用的精度，灵敏度，简便的定量实时PCR。此方法所开发的新型引物，避免合成的引物二聚体衍生的产品，否则会被作为测量端粒长度尽可能由于端粒的重复性质TANDARD测定。对于这个实验中，端粒长度的测量T / S比，端粒重复序列拷贝数单拷贝基因数目表示。因为有一个直接的端粒长度和标记的端粒引物结合的DNA的PCR过程的开始阶段的数量之间的比例关系，在T / S比率成正比的端粒长度。 T / S比值衡量比较CT的差异，在该样品的循环数累计花期越过一个门槛就是几基线花期个标准差以上，端粒引物与样品之间的和SCG引物^19。这种方法已经被批评为间接测量端粒长度，这可能会导致不准确的测量，例如，在染色体重复或拷贝数变异¹⁵的情况下。此外，研究之间的比较往往是二已发展到测量绝对端粒长度²⁰ fficult，但标准低聚物。此方法进一步改进通过Cawthon，使用单色多重qPCR实验。在该试验中，在PCR的前几个周期，在较低温度下运行，以避免引物二聚体的结合，并的端粒和控制基因进行了分析，在相同的PCR管中以进一步避免错误。与端粒长度的末端限制性片段的Southern印迹分析测定，将所得的端粒长度测量很强的相关性，并具有更高的精度^{15，19，36。}此刻，实时定量RT-PCR是唯一方便的方法，可用于大样本测试，只需要少量的DNA进行。这种方法的一个重要部分是全面的质量控制措施，这样，当它处理得当，这种方法可以提供有价值的比较信息端粒长度。此外，这种方法已被改编为超越白细胞测量在各种不同的组织^42的端粒长度。

此外，为了进一步了解背后的生物学机制维持端粒长度和两种相反的效果（ 即端粒缩短和伸长率在复制过程中的端粒酶）之间的相互作用，我们伴随着额外的检测，测量端粒酶活性与端粒长度的方法。

为了这个目的，我们使用了端粒重复序列扩增， 在体外试验。简单地说，溶解，保护，合成的酶活性的细胞将端粒重复序列的寡核苷酸的基板使用端粒酶，并用PCR扩增的存在下的SYBR Green的产品。结果，然后进行分析比较样品和控制CT阈值。由于端粒酶是一种对热敏感的酶，一个额外的热处理控制每个样品²¹一 ​​起运行。

<p class=的“jove_content”>测量端粒长度的同时，可以提供有价值的洞察衰老和疾病的病理生理中端粒长度可能发挥的作用，端粒长度是不是一个静态的财产和更多的信息，以便了解端粒功能。端粒酶活性的研究可以添加信息端粒长度的调控机制。例如，控制端粒酶活化可以维持端粒长度和细胞增殖，但端粒酶的不受控制的激活可以导致癌症。这两个价格低廉，直远期相结合的方法，不仅为我们提供有力的证据，对端粒长度和细胞稳定性之间的关系，同时也进一步了解端粒缩短和恢复的可能机制。有了这些方法，我们希望进一步阐明细胞的老化和细胞增殖的各种状态，最终目标是更好地理解中央机制及ms的细胞生物学。

Protocol

1。端粒长度协议19 DNA的提取大多数DNA的提取方法也可使用。我们的实验室更喜欢：Qiagen公司都可套件（＃69506）血源。根据源DNA，如口腔或其他来源的不同，不同的隔离方法也可使用。 底漆： 稀释所有的引物在PCR级水100pmoles/μl股票的浓度，并储存在-20℃直到需要。工作股引物作出了新的，并存储在20℃很短的一…

Representative Results

端粒长度定量RT-PCR分析的一个例子是图1中所示。在左上角的面板中，在红色和绿色标记的样品代表的位置上的96 – 孔板的受试者。在右上方的面板，扩增曲线证明。每个主题是由两个检测（端粒，单拷贝基因），这是一式三份进行测试。由于选定的个人的两个实验中产生的不同的DNA的拷贝数，花期检测的周期数，直到达到其指数曲线之间的不同检测。在较高的拷贝数管（ 即端…

Discussion

端粒长度提供了一个独特的学习压力和老化细胞的细胞标记和衰老的机制提供见解。由于其老化的作用首次被提出，众多的研究已经完成，有关端粒长度的年龄，长寿，与年龄有关的疾病，癌症和压力。几十年来，端粒长度测量的金标准是末端限制性片段分析Southern杂交。然而，最近一个负担得起的，快速和容易执行由Cawthon方法已经演变而来的。使用实时定量PCR，Cawthon提供了一个有用的替代测量…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516