Lengte van telomeren en telomerase activiteit; Een Yin en Yang van celsenescentie

Summary

Een nauwkeurige, korte, verfijnd en goedkope methode wordt beschreven dat beoordeelt lengte van telomeren in meerdere weefsels en diersoorten met behulp van qRT-PCR. Daarnaast zullen we een eenvoudige test om telomerase activiteit uitoefent als aanvullend backbone test telomeren beschrijven.

Abstract

Telomeren zijn DNA-sequenties herhaald aan het uiteinde uiteinden van de chromosomen die zijn divers in lengte en bij de mens kan een lengte van 15.000 baseparen bereiken. De telomeer dient als een bioprotectieve mechanisme van chromosoom attritie bij elke celdeling. Bij een bepaalde lengte, telomeren te kort om replicatie, een proces dat kan leiden tot chromosomale instabiliteit of celdood mogelijk. Lengte van telomeren wordt gereguleerd door twee tegengestelde mechanismen: verloop en rek. Natuurlijk verloop gebeurt als elke cel deelt. Daarentegen rek gedeeltelijk gemoduleerd door het enzym telomerase, die herhalende sequenties draagt ​​aan de uiteinden van de chromosomen. Op deze manier kan telomerase eventueel omkeren van een vergrijzing van de regeling en verjongt levensvatbaarheid van de cellen. Zijn cruciale elementen in het handhaven cel levensduur en worden gebruikt om cellulaire veroudering beoordelen. In dit manuscript zullen we een nauwkeurige, korte, verfijnd en goedkope methode om de lengte van telomeren beoordelen in meerdere weefsels te beschrijvens en soorten. Deze methode maakt gebruik van twee belangrijke elementen, de tandem herhaling van de telomere sequentie en de gevoeligheid van de qRT-PCR van differentiële kopie aantal geteste monsters te detecteren. Daarnaast zullen we een eenvoudige test om telomerase activiteit uitoefent als aanvullend backbone test telomeren beschrijven.

Introduction

Telomeren zijn DNA hexameer (TTAGGG) sequenties gevonden aan de uiteinden van chromosomen herhalen. In elke cel replicatie, worden deze chromosoomeinden verkort. Als ze het te kort, kan chromosomen telomeren einde fusies, afwijkende recombinatie, en degradatie ondergaan. Dus voldoende lengte van telomeren onderhoud speelt een belangrijke rol in het chromosoom stabiliteit en celbescherming ^38. Lengte van telomeren onderhoud is ook cruciaal voor genen gevonden in de buurt van de uiteinden van chromosomen, omdat DNA-replicatie kan niet doorgaan tot het einde van de chromosomen ^1-2. Bijgevolg kan voorkomen telomeerverkorting cel stabiliteit.

Talrijke studies hebben gemeld dat telomere length is gecorreleerd met de levensduur van een organisme en zieke toestand, zoals bij kanker ^{3-4, 5} diabetes en cardiovasculaire ziekte ^6,7. Daarnaast zijn verkorte telomeren geassocieerd met overmatige stress of eenongezonde leefstijl ^8, misschien door het bevorderen van vroegtijdige veroudering van cellen en dood ^9. Anderzijds hebben sommige studies gevonden dat er geen significant verschil tussen de lengte van telomeren en levensduur en leeftijdsgebonden ziekte ^{39, 40, 41.}

Een van de cel aangeboren mechanismen van bescherming van telomere verkorting is door activering eigen enzym telomerase reverse transcriptase (TERT). Dit enzym en subeenheid telomerase RNA (TERC), een niet-coderende RNA, gebruiken de telomeer als sjabloon telomeer herhalingen toevoegen chromosoomuiteinden ^10. Hoewel telomerase activiteit afwezig verschillende soorten cellen en andere mechanismen betrokken zijn bij telomerelengte onderhoud verhoogd telomerase-activiteit gecorreleerd met verhoogde telomeren. Telomerase activering is opgericht als een van de mechanismen waarmee cellen reageren op schade en benadrukken en te voorkomen dat voortijdige veroudering en dood. Bijvoorbeeld, meer telomeres werden aangetoond in een populatie van Ashkenazi Joden uitzonderlijke levensduur ¹¹ mutaties van TERC of TERT aangetoond bijdragen tot fatale ziekte ¹² en epigenetische regulatie van telomerase is aangetoond dat een effect van leeftijd-gerelateerde ziekte ¹³ hebben. Sinds de ontdekking, is de lengte van telomeren is voorgesteld als een biomarker voor de gezondheidstoestand in verschillende diermodellen en in mensen, maar deze vroege studies waren moeilijk te repliceren schaal omdat de gebruikte methode was vervelend, lang en duur. In 2002 en verder afgestemd in 2009, Cawthon voorgesteld en gedemonstreerd een nieuwe, accurate, snelle en eenvoudige PCR-gebaseerde protocol om de lengte van telomeren beoordelen en zijn rol verder te onderzoeken in de verschillende aspecten van de celbiologie, veroudering en ziekte ^19.

Het kiezen van de juiste telomeer meetmethode voor een studie is van essentieel belang. Momenteel zijn er verschillende methodes om telomere lengte meten, elk met zijn eigenen nadelen. Traditioneel wordt telomeerlengte gemeten middels Southern-blotanalyse van terminale restrictiefragmenten (TRF), die omvat: een. het verteren van het DNA met restrictie-enzymen die niet in telomeren herhalingen doen verlagen om TRF's te verkrijgen, b. Southern blot van deze TRF wordt gedaan door het bepalen van de gemiddelde lengte met een TRF telomere probe ^{14, 37.} Hoewel deze werkwijze zeer nauwkeurig met een kleine variatiecoëfficiënt, is een directe maat en kan voordelig voor het meten van de distributie lengte, TRF analyse duur, arbeidsintensief en vereist minimum 3 ug DNA. Deze methode is ook ongevoelig voor korte telomeren en lengte bepaling kan worden verstoord door subtelomeric DNA, dat kan worden gedetecteerd door de probe door de (TTAGGG) n achtige sequenties Bevat ^{15, 42.}

Een andere zeer nauwkeurige methode bij het meten van de lengte van telomeren is Single telomeren Rek Lengte Analysis (STELA), een single molecule PCR-methode die vereist slechts een kleine hoeveelheid DNA. In deze werkwijze worden primers aan de G-rijke overhang herkennen eind chromosomen en te binden aan een unieke subtelomeric volgorde op een chromosoom, die de telomeer van een specifiek chromosoom versterkt. De resulterende versterking is dan gevisualiseerd door Southern Blot. Deze werkwijze heeft het voordeel dat zeer nauwkeurige en kan korte telomeren outlier sporen ^16. Helaas, aangezien niet alle chromosomen G-rijke einden en een bruikbare subtelomeric sequentie telomere lengte kan alleen worden gemeten specifieke chromosomen en deze metingen niet de lengte van de telomeren in de cel ¹⁵ vertegenwoordigen.

Een andere methode die is toegepast is het gebruik van Peptide Nucleic Acid (PNA) probes telomerelengte detecteren. Kwantitatieve Florescence in situ hybridisatie (Q-FISH) stelt ons in staat om telomeren visualiseren tijdens metafase, waar de staining van telomeren met een PNA probe in verhouding tot hun grootte maakt de vergelijking van telomeren tussen specifieke chromosomen. Deze methode kan ook worden toegepast op cellen in interfase, hier de telomere lengte afzonderlijke chromosomen kan niet worden gedetecteerd, waardoor een beperking introduceert bij het ​​meten telomere lengte verouderend of zelden delende cellen ^17. Flow FISH plaats daarvan maakt gebruik van flowcytometrie en is momenteel de meest gevoelige methode voor het meten van de lengte van telomeren van bloedcellen in de klinische setting, maar vereist hoogopgeleide technici ^18.

Momenteel is de standaard methode voor het meten van de gemiddelde lengte van telomeren in ons laboratorium maakt gebruik van de precisie, gevoeligheid, en het gemak van kwantitatieve real-time PCR. Deze methode is mogelijk voor het meten van de lengte van telomeren door de ontwikkeling van nieuwe primers die de synthese van primer-dimeer afgeleide producten, die anders zou in zo geproduceerd vermijdentandaard assay vanwege de herhalende karakter van de telomeren. Voor deze test wordt de meting van de lengte van telomeren vertegenwoordigd door de T / S-ratio, de telomeer repeat aantal kopieën aan single-copy gen nummer. Aangezien er een direct evenredig verband tussen de telomere lengte en het aantal telomere gemerkte primers binden aan het DNA tijdens de beginstadia van PCR, de T / S-verhouding is recht evenredig met de lengte van telomeren. De T / S-ratio wordt gemeten door het verschil in Ct vergelijken, het fractionele cyclus nummer waarop het monster is opgebouwd bloei een drempel overschrijdt die is meerdere standaarddeviaties boven de basislijn bloei, tussen monsters met telomeren primers en SCG primers ^19. Deze methode is bekritiseerd voor zijn indirecte meting van de lengte van telomeren, wat kan leiden tot onnauwkeurige metingen, bijvoorbeeld in het geval van chromosoom duplicaties of copy number variations ^15. Ook vergelijking van studies vaak difficult, maar standaard oligomeren zijn ontwikkeld om absolute telomerelengte ²⁰ meten. Deze methode werd bevorderd op door Cawthon verbeterd, met behulp van een monochroom multiplex qPCR assay. In deze test werd de PCR uitgevoerd bij lagere temperaturen voor de eerste paar cycli primer-dimeer binding voorkomen en telomeer en controle-gen werden geanalyseerd in dezelfde PCR buis fout verder voorkomen. De verkregen telomere lengte metingen sterk gecorreleerd met telomere lengte, gemeten door Southern blot analyse van TRF en hadden hogere nauwkeurigheid ^{15, 19, 36.} Momenteel qRT-PCR de enige geschikte methode voor het testen van grote aantallen individuen en vereist slechts een kleine hoeveelheid van DNA uit te voeren. Een cruciaal onderdeel van deze methode is uitgebreide kwaliteitscontrole maatregelen, zodat wanneer het goed is gedaan, kan deze methode waardevolle vergelijkende informatie over de lengte van telomeren bieden. Bovendien was deze methode aangepast voor gebruik buiten leukocyten voor het metentelomere length in verschillende weefsels ^42.

Bovendien, om verder inzicht in de biologie achter telomerelengte onderhoud en interacties tussen de twee tegengestelde effecten (effecten telomere verkorting tijdens replicatie en elongatie door telomerase enzym), we vergezeld de telomere lengte methode een extra test die telomerase-activiteit meet.

Hiervoor gebruikten we een telomere Repeat Amplification Protocol, een in vitro assay. Kort gelyseerd, conserven, enzymatisch actieve cellen gesynthetiseerd telomeer herhalingen op een ondergrond met oligonucleotide telomerase, en de producten werden geamplificeerd met behulp van PCR in de aanwezigheid van SYBR Green. De resultaten werden vervolgens geanalyseerd door het vergelijken van monster en controle-Ct drempelwaarden. Omdat telomerase is een warmtegevoelig enzym, wordt een extra warmte behandelde controle uitgevoerd langs elk monster ^21.

<p class="Jove_content"> Terwijl het meten van de lengte van telomeren kan waardevol inzicht geven in de mogelijke rol van de lengte van telomeren in de pathofysiologie van veroudering en ziekte, de lengte van telomeren is geen statische eigenschap en meer informatie is nodig om telomeer functie te begrijpen. Telomerase-activiteit studies kan informatie over de lengte van telomeren regelmechanismen voegen. Bijvoorbeeld kan de gecontroleerde activering van telomerase telomere lengte celproliferatie handhaven doch ongecontroleerde activering van telomerase kan resulteren in kanker. Deze twee goedkope en ongecompliceerd methoden gecombineerd voorzag ons niet alleen met een sterker bewijs in de richting van een verband tussen de lengte van telomeren en mobiele stabiliteit, maar ook verder inzicht in de mogelijke mechanismen van telomeerverkorting en herstel. Met deze methoden hopen we de reactie van de cel om veroudering en verschillende staten van celproliferatie verder te ontrafelen met het uiteindelijke doel van een beter begrip van de centrale mechanistischms van celbiologie.

Protocol

1. Telomeren Lengte Protocol 19 DNA isolatie De meeste DNA isolatiemethoden worden gebruikt. Onze Lab geeft de voorkeur aan Qiagen DNeasy Kit (# 69506) voor bloed bronnen. Afhankelijk van de bron van DNA, zoals buccale of andere bronnen, kan een andere isolatiemethode worden gebruikt. Primers: Alle primers zijn verdund tot een voorraad concentratie van 100pmoles/μl in PCR kwaliteit water en bewaard bij -20…

Representative Results

Een voorbeeld van een telomere lengte qRT-PCR wordt getoond in figuur 1. Links bovenpaneel voorziene monsters in rood en groen geven de plaats van de geteste onderwerpen de 96-well plaat. Op de bovenste rechter paneel, wordt de amplificatiecurve aangetoond. Elk vak wordt getest door twee assays (Telomere en Single Copy Gene), dat wordt uitgevoerd in drievoud. Vanwege de verschillende kopie aantallen DNA geproduceerd in de twee analyses van geselecteerde personen, het aantal cycli totdat de fluorescentie…

Discussion

De lengte van telomeren biedt een unieke cellulaire marker om de gestresste en veroudering cel bestuderen en biedt inzichten in de mechanismen van veroudering. Sinds haar rol in veroudering eerst was voorgesteld, hebben een veelheid van studies gedaan met betrekking tot de lengte van telomeren leeftijd, levensverwachting, leeftijd-gerelateerde ziekte, kanker, en stress. Al tientallen jaren, de gouden standaard van de lengte van telomeren metingen was terminal restrictiefragmentanalyse behulp Southern hybridisatie. Echte…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516