Summary
En murin modell av kutan sårheling som kan brukes til å vurdere terapeutiske forbindelser i fysiologiske og patofysiologiske innstillinger.
Abstract
Sårtilheling og reparasjon er de mest komplekse biologiske prosesser som skjer i menneskers liv. Etter skade, flere biologiske mekanismer aktiveres. Svekket sårheling, som oppstår hos diabetespasienter for eksempel, kan føre til alvorlige ugunstige utfall for eksempel amputasjon. Det er derfor en økende drivkraft til å utvikle nye legemidler som fremmer sår reparasjon. Testingen av disse har vært begrenset til store dyremodeller slik som svin, som ofte er upraktisk. Mus representerer den ideelle preklinisk modell, som de er økonomiske og mottagelig for genetisk manipulasjon, som åpner for mekanistisk etterforskning. Men sårheling i en mus er fundamentalt forskjellig fra mennesker som det oppstår hovedsakelig via sammentrekning. Vår murine modell overvinner dette ved å innlemme en splint rundt såret. Ved splinting såret, er reparasjonsprosessen da avhengig av epithelialization, celleproliferasjonstest og angiogenese, som tett speilebiologiske prosesser av menneskelig sårtilheling. Mens krever konsistens og pleie, betyr dette murine modell ikke medføre kompliserte kirurgiske teknikker, og gjør det mulig for den robuste testing av lovende midler som kan, for eksempel, for å fremme angiogenese eller hemme inflammasjon. Videre virker hver mus som sin egen kontroll som to sårene er forberedt, det mulig å anvende både testforbindelsen og kjøretøyet kontroll på samme dyr. I konklusjonen, viser vi en praktisk, lett å lære, og robust modell av sårtilheling, som kan sammenlignes med det av mennesker.
Introduction
Svekket sårheling er ansvarlig for betydelig sykelighet og dødelighet over hele verden, og dette gjelder særlig for lider av diabetes mellitus 1,2. Hos mennesker er sårheling et kontinuum av prosesser, hvor det er betydelig overlapping 3. Umiddelbart følgende såret, inflammatoriske prosesser er igangsatt. Betennelsesceller slipper faktorer som oppfordrer prosesser av celleproliferasjon, migrasjon og angiogenese. Etter re-epithelialization og nytt vev formasjon er det en fase av ombygging som innebærer både apoptose og re-organisering av matrix proteiner som kollagen.
Kompleksiteten i sårtilheling kan for øyeblikket ikke kopiert in vitro og dette nødvendiggjør bruk av dyremodeller. Hittil har sårhelende studier blitt begrenset til store dyremodeller, slik som svin, for å sikre at helbredelsesprosessene er ekvivalente og kan sammenlignes med mennesker. Men ved å bruke store animals for slike studier kan være vanskelig å huset og er ikke alltid praktisk 4.. Laboratoriet mus representerer en økonomisk dyremodell som lett kan genetisk manipulert for mekanistisk etterforskning 5-7. Men murine sår leges ulikt på menneskekroppen, hovedsakelig på grunn av prosessen med sammentrekning åtte. Dette er delvis på grunn av en omfattende underhudsfett tverrstripet muskel laget kalles panniculus carnosus som er i stor grad fraværende hos mennesker. Hos mus, gjør denne muskelen laget huden til å bevege seg uavhengig av de dypere musklene og er ansvarlig for den raske nedgangen i huden følgende såret.
For å overvinne denne begrensningen ved murin sårheling være tilpasset til å replikere human sårheling ved bruk av en skinne (fig. 1) 8,9. I denne videoen demonstrerer vi splinted murine såret modell som eliminerer såret sammentrekning og tettere tilnærmet de menneskelige prosesser av re-epithelializasjon og nytt vev formasjon. I denne modellen to av full tykkelse excisions som inkluderer panniculus carnosus er opprettet på fotens rygg, en på hver side av midtlinjen av mus. En silikon skinne er plassert rundt såret med hjelp av lim og splint deretter sikret med avbrutte suturer. Hver mus fungerer som sin egen kontroll, med en såret som behandles, og den andre kjøretøy-kontroll, og dermed redusere dyrenummer. Etter aktuelle programmer, er en gjennomsiktig okklusjonstape brukt. Bandasjen kan fjernes når det er nødvendig for videre topiske applikasjoner og / eller målingen av sårområdet 10,11. Ved ferdigstillelse av eksperimenter, lukking av sår, morfologisk arkitektur og grad av neovascularization kan vurderes ved immunhistokjemi. Denne økonomiske og enkle å utføre modellen kan også benyttes til å vurdere sårheling i sammenheng med diabetes mellitus eller andre pathophysiologies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av splinter og okklusjon
- Skissere 10 mm sirkler på 0,5 mm tykk silikon plater og bruke saks eller en biopsipunch å lage silikon disker.
- Senter et 5 mm biopsipunch i midten av den 10 mm sirkel og trykk fast for å lage et hull for å danne en "smultring"-lignende plate som vil bli brukt som en splint.
- Skissere 10 mm sirkler på en gjennomsiktig okklusiv bandasje som Opsite og bruke saks for å lage sirkulære bandasjer.
2. Forsøksdyr
- Skaff Animal Ethics Committee godkjenning for alle eksperimentene som skal utføres.
- Bruk 8-ukers gamle (22-26 gram) mannlige C57BL/6J mus fra en kommersiell oppdretter (f.eks The Jackson Laboratories).
- Hold mus i standardvilkår for 21 ° C og en 12 timers lys-mørke-syklus med fri tilgang til mat og vann.
- (Valgfritt): Diabetes kan induseres i 6 til 7 uker gamle mus av en bolus intraperitoneal injeDette skjer på 165 mg / kg streptozotocin (i citratbuffer, pH 4,5), med hyperglykemi bekreftet av vanlig blodsukkermåling (accuchek glucometer). Diabetiske mus kan ha polyuri og så deres sengetøy må skiftes oftere å eliminere fuktighet og deres vekter bør overvåkes nøye.
3. Anestesi og Operativ Forberedelse
- Indusere generell anestesi ved anvendelse av 5% isofluran i 100% oksygen (strømningshastighet 1 l / min) og opprettholde anestesi ved hjelp av 1-3% isofluran.
- Sikre de dype pedal reflekser av musen er undertrykt og plassere musen i liggende stilling.
- Klargjør det operative område ved å fjerne pelsen med klippere fra undersiden av halsen til 3 cm lenger ned på baksiden, og mellom de to skulderbladene.
- En lett påføring av Hårfjerningskrem kan søkes ikke lenger enn 2 min. Våte gasbind vattpinner kan brukes for å sikre at alt gjenværende fløte og pelsen er fjernet.
- Tørk huden med enspritserviett og to søknader på 10% povidon-jod (Betadine) og drapere musen.
4. Eksisjon og Splinting av Wound
- Diagrammessig fremstilling av murine sårhelende modellen er angitt i figur 1..
- Bruk en steril 4 mm biopsipunch antyde to sirkulære mønstre for såret på hver side av musens midtlinjen på nivået av skuldrene (se figurene 2a-2b).
- Bruk taggete pinsett til å løfte huden i midten av omrisset og iris saks for å lage en full-tykkelse sår som strekker seg gjennom underhuden (Tall 2c-2d), inkludert panniculus carnosus (2e), og avgiftsdirektoratet sirkulært stykke av vev.
- Gjenta prosessen for såret på den andre siden av midtlinjen (figur 2f).
- Fjern plast beskyttende belegg fra hver side av silikon splint.
- Påfør cyanoacrylate klebemiddel (f.eks super lim eller Krazy lim) til den ene siden av et silikon-skinne.
- Sentrer splint over såret (figur 2g) og feste skinne med avbrutt 6-0 nylon sting for å sikre posisjonering (figur 2t).
- Gjenta splinting prosessen på den andre såret.
- Hvis det er nødvendig på dette tids-punkt, gjelder den terapeutiske forbindelse som skulle testes (opp til 100 ul) til en såret (figur 2i), og kjøretøyet kontrollen til den andre.
- Dekk til såret med en gjennomsiktig okklusiv bandasje (for eksempel OpSite) (figur 2j-2k).
- En linjal er plassert under splinter og en mikrofotografiet tatt (Figur 2l).
6. Postoperativ Ledelse
- Carprofen (5 mg / kg) ble administrert en gang daglig via sub-kutan injeksjon for postoperativ smertelindring.
- Etter operasjonen dyrene er individuelt bur og vedlikeholdes på varme mats til fullt restituert.
- Overvåk dyrene to ganger daglig i manifestasjoner av smerte og vekttap. Vi observerte ingen brutto atferdsmessige skjermer av smerte eller vekttap.
7. Wound Måling og behandling
- Såret kan måles daglig.
- Indusere narkose ved hjelp av 5% isofluran gass (flow rate 1 L / min), og deretter sørge for de dype sensoriske reflekser av musen er undertrykt bruker 1-3% isofluran.
- Forsiktig skrelle tilbake okklusjonstape med pinsett.
- Bruk kirurgiske calipers å måle såret diameter. Vi tar gjennomsnittet av tre målinger langs X-, Y-og Z-aksen (figur 2m-2o) samt et fotomikrografi for fremtidig bruk (fig. 2p).
- Valgfritt: På denne tiden dyret kan vurderes for blodgjennomstrømning ved hjelp av en laser Doppler Imager (figur 2q).
- Re-anvendelse av den terapeutiske forbindelse og bilen kontroll kan være prestaMed på dette punktet.
- En ren gjennomsiktig Okklusiv deretter settes på igjen og dyrene holdes varm til den er helt restituert.
- Merk: Hvis splinter ikke er sikret skikkelig såret vil lett kontrakt (figur 2r).
8. Histologisk analyse
- Avlive mus etter 10 dager med en overdose av anestesi.
- Bruk pinsett og skalpell blad fjerne sting og nøye skrelle bort splint.
- Bruk iris saks for å skape et bredt, full eksisjon rundt og under sårområdet og inkuber vev i 4% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvann (PBS) ved 4 ° C over natten.
- Overfør vev til 17% sukrose i PBS-løsning i ytterligere 24 timer ved 4 ° C og deretter fjerne overflødig oppløsning ved dabbing forsiktig på vev og plasser i oktober sammensatte og fryser ved -80 ° C.
- Hematoxylin og eosin farging kan anvendes til å visualisere såret struktur og epitelisk gap. Neovascularisation kan vurderes ved immunhistokjemiske analyser for å bestemme antall kapillærer (ved hjelp av Von Willebrand faktor).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En lukking av sår kurve bestemmes ved å beregne gjennomsnittlig diameter på såret og uttrykke resultatene i prosent, dvs. 100 - (Dag 0 diameter / Dag X diameter). I dette eksperiment ble en terapeutisk forbindelse (eller vehikkel-kontroll) ble daglig påført såret. Den terapeutiske forbindelsen sterkt akselerert sårlukking (figur 3). Det er viktig å merke seg at de splinter må opprettholdes for varigheten av forsøket, som fjerning av splinter vil føre til rask sår kontraksjon (figur 2r) og divergerer fra mønsteret av sårheling observert hos mennesker.
Figur 1. Skjematisk representasjon av det murine sårheling modell. I denne modellen to full tykkelse sårene er opprettet på EIther side av midtlinjen slik at hver mus for å tjene som sin egen kontroll. Silikon splinter blir overholdt, og sys fast til såret omkretsen for å hindre sår sammentrekning, noe som gir en modell replikerbart på den hos mennesker.
Figur 2. Sårheling kirurgi og postoperativ målinger. Følger hårfjerning og forberedelse av huden med alkohol og jod (ab) en biopsipunch blir forsiktig brukt for å antyde to sirkler på fotens rygg, på hver side av midtlinjen. (C) Et lite snitt blir deretter opprettet og (d) et sirkulært stykke av huden er fjernet, (e) inkludert panniculosus carnosus, (f) å lage to av full tykkelse sår. (g) Lim påføres deretter den SILIC en avstiverne og splinter festet til såret omkretsen. (h) splinter blir deretter festet med suturer. (i) Behandlinger er topikalt og (jk) et okklusivt, gjennomsiktig bandasjen er plassert over såret og festet til avstiverne (lim kan brukes hvis nødvendig). (l) photomicrographs tas daglig, og sårområdet beregnes ut fra et gjennomsnitt av tre målinger på den diameter (m) y-akse, (n) og x-aksen (o) z-aksen. (p ) Et representativt bilde av sårene på dag 10, og bemerker den mindre viklet opp på den høyre, som ble behandlet med en terapeutisk forbindelse. (q) Representative laser doppler bilde av blodgjennomstrømning av såret ved dag 6.. (R) Eksempel hurtig sår sammentrekning etter fjerning av silikon splinter.
65/50265fig3.jpg "alt =" Figur 3 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50265/50265fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Representative sårlukking graf. Sårområdet er beregnet fra gjennomsnittet av tre daglige diametermålinger langs x-, y-og z-aksene. Sårlukking er uttrykt i prosent av opprinnelig såret på dag 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette er en eksperimentell murin modell av kutan sårheling. Et vesentlig trekk ved denne modellen er bruken av silikon splinter for å hindre sår sammentrekning, slik at re-epithelialization og ny vevsdannelse kan oppstå, slik at det ligner på den prosess som skjer hos mennesker. Denne modellen er allsidig og kan brukes til å vurdere sårtilheling i både fysiologiske og patofysiologiske (f.eks diabetes mellitus) innstillingene. Modellen kan også brukes til å vurdere potensiell sårheling eller angiogenese-terapi på en økonomisk innstilling. Med hver mus opptrer som sin egen kontroll, er dyrenummer minimert. Den kirurgiske teknikker som kreves for denne modellen ikke er svært avansert, og dermed kan denne modellen bli mye brukt av de med relativt lite kirurgisk erfaring.
For å sikre reproduserbarhet og nøyaktig kvantifisering er det viktig at den ortosen blir tilstrekkelig festet og forankret til huden med sting, og at ther er minimal forsinkelse mellom å opprette de to sårene. Tilbøyeligheten av murine sår til raskt å trekke opp med følgende løsning av den skinne eller delvis fjerning på grunn av riper ved musen krever daglig overvåking av splinter. Forsiktig påføring av lim er også nødvendig for å redusere irritasjon av sunn hud rundt splint som kan fremme skrape. Det er også svært viktig å følge aseptiske teknikker og grundig desinfisere utstyret, spesielt calipers, mellom mus. Anvendelsen av tildekning må også tas i betraktning, særlig hvis sår ikke kommer til å bli behandlet eller kledd daglig. Opsite og Tegaderm (3M) dressinger er sammenlignbare 12, og det har vist seg at Tegaderm dressinger kan bare forbli festet i 1-2 dager. Skulle langsiktige bandasje kreves en alternativ tilnærming har blitt beskrevet av Chung og kolleger 13.
Potensielle svakheter på denne modellen kan omfatte betennelse d ue til forankring av suturer, diffusjonen av behandlingen eller kjøretøyet mellom sår og oppføring av behandlingen inn i den systemiske sirkulasjonen. I forhold til de suturer som induserer lokal inflammasjon, blir suturene plasseres relativt langt fra såret, og som hver såret er opprettet samme, således vil en betennelse som kan oppstå bør være lik mellom sår. Tilsvarende vil avstanden mellom sårene og mangel på ødem mellom sårene minimalisere diffusjonen mellom to senger. Det finnes bevis på at en behandling kan komme inn i systemisk sirkulasjon, noe som kan akselerere helbredelse av kontroll såret 9,10. For å bestemme utstrekningen av en behandling som går inn i den systemiske sirkulasjon, kan kullbror mus anvendes, der de to sårene bare er behandlet med kjøretøyet. Forskjellene i forekomst av lukking av sår mellom mus behandlet med bilen bare, og musene som fikk både kjøretøy og behandling kan deretter sammenlignes.
"> Som konklusjon, har vi vist en forholdsvis enkel murin modell av sårheling som oppviser mange av funksjonene som observert i humane sårheling.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke finansiering støtte fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australia (Prosjekt Grant ID: 632512). Louise Dunn ble støttet av en NHMRC Early Career Fellowship og Christina Bursill av en National Heart Foundation Career Development Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
| Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
| Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
| Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
| Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
| Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
| Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
| Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
| Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, 1-18 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y.
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
- Grose, R., Werner, S. Wound-healing studies in transgenic and knockout mice. Mol. Biotechnol. 28, 147-166 (2004).
- Reid, R. R., Said, H. K., Mogford, J. E., Mustoe, T. A. The future of wound healing: pursuing surgical models in transgenic and knockout mice. J. Am. Coll. Surg. 199, 578-585 (2004).
- Fang, R. C., Mustoe, T. A. Animal models of wound healing: utility in transgenic mice. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 989-1005 (2008).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 969618 (2011).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair. 12, 485-492 (2004).
- Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
- Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13505-13510 (2009).
- Raza, A., Bayles, C., Biebel, D. Investigation of Bacterial Growth and Moisture Handling Properties of Transparent Dressings: 3M Tegaderm Transparent Dressing, 3M Tegaderm HP Transparent Dressing, and Opsite IV3000 Transparent Dressing. Smith and Nephew Report. , (1998).
- Chung, T. Y., Peplow, P. V., Baxter, G. D. Testing photobiomodulatory effects of laser irradiation on wound healing: development of an improved model for dressing wounds in mice. Photomed. Laser Surg. 28, 589-596 (2010).
